Matrizes 2D e 3D para estudar formação e atividade de Invadosome Linear

Resumo

Este protocolo descreve como preparar uma matriz mista 2D, consistindo em gelatina e colágeno I, e um plugue 3D de colágeno I para estudar invadossomas lineares. Esses protocolos permitem o estudo da formação de invadosoma linear, atividade de degradação da matriz e as capacidades de invasão de células primárias e linhas celulares de câncer.

Resumo

A adesão celular, a migração e a invasão estão envolvidas em muitos processos fisiológicos e patológicos. Por exemplo, durante a formação de metástases, as células tumorais devem atravessar barreiras anatômicas para invadir e migrar através do tecido circundante, a fim de atingir o sangue ou vasos linfáticos. Isso requer a interação entre células e a matriz extracelular (ECM). No nível celular, muitas células, incluindo a maioria das células cancerosas, são capazes de formar invadosomes, que são estruturas baseadas em F-actina capazes de degradar ECM. Os invadosomos são estruturas de actina protrusivas que recrutam e ativam metaloproteinases de matriz (MMPs). A composição molecular, a densidade, a organização e a rigidez do ECM são cruciais na regulação da formação e ativação do invadosoma. In vitro , um ensaio de gelatina é o ensaio padrão usado para observar e quantificar a atividade de degradação do invadosoma. No entanto, a gelatina, que é o colágeno I desnaturado, não é uma matriz fisiológica eLement. Um novo ensaio utilizando fibrilas de colágeno de tipo I foi desenvolvido e utilizado para demonstrar que esta matriz fisiológica é um potente indutor de invadossomas. Os invadosomas que se formam ao longo das fibrilas de colágeno são conhecidos como invadosses lineares devido à sua organização linear nas fibras. Além disso, a análise molecular de invadossomas lineares mostrou que o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1) é o receptor envolvido em sua formação. Esses dados demonstram claramente a importância de usar uma matriz fisiologicamente relevante para entender as complexas interações entre células e ECM.

Introdução

A remodelação da matriz extracelular (ECM) ocorre durante processos fisiológicos e patológicos, como angiogênese e invasão de células tumorais. Em condições fisiológicas, muitos tipos de células, principalmente da linhagem hematopoiética, são capazes de degradar elementos ECM. Por exemplo, os macrófagos são capazes de atravessar barreiras anatômicas para atingir os tecidos e osteoclastos degradam a matriz óssea para garantir a homeostase do cálcio. Mais globalmente, todas as matrizes do corpo se renovam para manter suas propriedades físicas e químicas. Nos tecidos do câncer, a composição do microambiente do tumor é alterada. Por exemplo, no câncer de mama e câncer de pulmão, o colágeno de tipo I é sobre-expressado e se acumula em torno do tumor. Além disso, essa acumulação está associada a um risco aumentado de desenvolver metástases ^{1 , 2} . A metástase do câncer depende da capacidade das células cancerosas para degradar o ECM e invadir os tecidos adjacentes.

oA atividade invasiva das células é atribuída a estruturas especializadas em ricas em actinas conhecidas como invadosomes. Este termo inclui podossomas e invadopodia, que estão presentes, respectivamente, em células normais e cancerígenas ( por exemplo, macrófagos, células endoteliais e células cancerosas, como a linhagem celular de câncer de mama MDA-MB-231). In vitro , os invadosomes podem se organizar em diferentes formas: pontos, agregados ou rosetas ³ . Classicamente, os invadosomes são compostos de um núcleo de F-actina contendo várias proteínas, como a proteína de andaimes Tks5 e cortactina, cercada por moléculas de placa de adesão, como integrinas e vinculina ⁴ . Recentemente, mostrou-se que a TK5 e a RhoGTPase Cdc42 podem ser usadas como uma assinatura molecular mínima para invadosomas funcionais ⁵ . Essas estruturas são capazes de degradar o ECM através do recrutamento e ativação de proteínas de metaloprotease específicas, como MT1-MMP e MMP-2 ⁶. Em um estudo anterior, relatamos que a interação entre as fibrilas de colágeno tipo I e o receptor de domínio de discoidina 1 (DDR1), um receptor específico de fibrilas de colágeno tipo I, leva à formação de uma nova classe de invadossomas, denominados invadossomas lineares. Os invadosomas lineares são formados ao longo de fibrilas de colágeno tipo I ⁷ . Essas estruturas são capazes de degradar fibrilas de colágeno tipo I através do recrutamento e ativação de MT1-MMP / MMP2. Além disso, sua formação depende da Tks5 e Cdc42 ⁵ . In vitro , demonstramos a existência de invadossomas lineares eo envolvimento de DDR1 na sua formação e atividade ⁸ usando diferentes estratégias consistindo em uma combinação de vários elementos da matriz, incluindo: i) lamínulas fluorescentes revestidas com gelatina, ii) fibrilação de colágeno tipo I fluorescente Lamelas revestidas e iii) tampas de colágeno 3D tipo I. Devido ao uso de diferentes matrizes, pudemos estudar e caracterizarFormação de invadosoma linear e sua atividade de degradação ^{7 , 8} .

Finalmente, para compreender melhor a biologia das células invasivas, utilizou-se uma combinação de componentes de ECM nos sistemas de cultura 2D e 3D, imitando a complexidade da composição do microambiente do tumor. Abaixo estão protocolos para revestimento de lamínulas com colágeno de gelatina / tipo I em sistemas de cultura 2D e 3D.

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Protocolo

NOTA: Antes da fixação, todas as etapas são completadas em uma capa de fluxo laminar estéril.

1. matriz 2D

NOTA: as matrizes 2D são usadas para determinar a porcentagem de células que formam invadosomes e a área de degradação da matriz por célula.

Figura 1: Protocolo. Resumo do protocolo utilizado para preparar matrizes de gelatina e colágeno I. É possível fazer apenas a matriz de gelatina ou uma matriz mista de gelatina e colágeno I. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Matriz de gelatina
   NOTA: As matrizes de gelatina fluorescente são usadas para quantificar a degradação da matriz e a gelatina não fluorescente é usada para promover a adesão das fibras de colágeno I. Tapete de gelatina fluorescenteOs arroz são também utilizados para estudos de podosomas e invadopodias (ver Figura 1 ).
   1. Sob um capuz de fluxo laminar estéril, coloque um parafino (20 cm x 15 cm) na área de trabalho e desinfecte-o com etanol a 70%.
   2. Alíquotas 20 μL de gotículas de 1 mg / mL de gelatina em uma linha, espaçadas aproximadamente a 1 cm de distância; Consulte a Figura 1 para organização de gotículas.
   3. Cubra cada 20 μL de gotícula de gelatina com um lamínula de vidro autoclavado (12 mm de diâmetro).
   4. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Se a gelatina estiver fluorescente, proteja-a da luz.
   5. Alíquotas de 40 μL de gotículas de 0,5% de glutaraldeído em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma linha, cada uma espaçada aproximadamente 1 cm abaixo da linha de lamínulas do passo 1.1.3.
      CUIDADO: O glutaraldeído é um agente fixador tóxico. Use luvas e não inspire.
   6. Usando fórceps jewelled, transfira cada lamela revestida de gelatina para uma gota de glutaraldeído.
      AnoteÉ normal que uma pequena gota de gelatina permaneça no parafilme. Não reutilize isso para outro experimento.
   7. Incubar durante 40 min à temperatura ambiente. Para lamínulas fluorescentes, proteja-os da luz.
   8. Pegue uma placa de cultura de células de 24 poços e preencha cada poço com 500 μL de 1x PBS estéril. Coloque os lamínulas, com a gelatina voltada para cima, em cada poço.
   9. Lave duas vezes em 1x PBS por 5 minutos cada.
      NOTA: Nesta etapa, os lamínulas podem ser usadas para experimentação ou armazenadas em 1x PBS a 4 ° C. Os lamínulas não fluorescentes podem ser armazenados por uma semana, e lâminas fluorescentes podem ser armazenadas por 48 h.
2. Matriz de tipo I do colágeno fibrilante
   NOTA: A matriz de colágeno tipo I de fibrilação é utilizada para estudar a formação de invadosoma linear e a degradação da matriz associada. Uma combinação de colágeno fluorescente I e lâminas de gelatina não fluorescentes é usada para colocar os marcadores invadossais com fibras de colágeno ( por exemplo, F-actina iN o canal distante, o colágeno I no canal vermelho, o Tks5 no canal verde e o tintura Hoechst para uma mancha nuclear). Por outro lado, uma combinação de colágeno não fluorescente I com lâminas de gelatina não fluorescentes é usada para maximizar o número de marcadores de invadosoma corados ( por exemplo, F-actina no canal vermelho distante, cortactina no canal vermelho, Tks5 em O canal verde e tintura Hoechst para uma mancha nuclear). Finalmente, uma combinação de colágeno não fluorescente I com lâminas de gelatina fluorescentes é usada para quantificar a degradação associada à gelatina ( por exemplo, F-actina no canal vermelho distante, Tks5 no canal vermelho, no canal verde e tintura Hoechst Para uma mancha nuclear) (ver Figura 1). O tinte Hoechst é usado para manchar o núcleo, e também verifica a contaminação por micoplasma, além de um teste de PCR feito regularmente nas linhas celulares utilizadas.
   1. Colágeno fluorescente I
      1. Use colágeno comercial que extrai do tendão do rato-cauda em 0,02 N de ácido acéticoD. Retirar a quantidade de colágeno necessário para preparar 500 μL de solução por lamínula a uma concentração final de 0,4 mg / mL de colágeno I.
      2. Adicionar éster succinimidílico de 5-carboxi x rodamina a uma concentração final de 10 μg / mL, calculado para o volume final da solução de colagénio I (nx 500 μL).
      3. Misturar a solução pipetando para cima e para baixo e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz.
      4. Diluir para o volume final com 1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) contendo cálcio e magnésio, e usar diretamente.
   2. Cobertura do colágeno Fibrilar I
      1. Use os lâminas de gelatina não fluorescentes ou fluorescentes previamente preparadas no passo 1.1.
      2. Prepare uma solução de colágeno fluorescente ou não fluorescente I em uma concentração final de 0,4 mg / mL em DPB 1X contendo cálcio e magnésio.
      3. Adicionar 500 μL de solução de colágeno I fluorescente ou não fluorescente porLamínula em uma placa de cultura celular de 24 poços.
      4. Incubar durante 4 h a 37 ° C para a polimerização de colágeno I.
      5. Após a incubação, remova o excesso de colágeno I inclinando a placa e pipetando no lado do poço (não diretamente na lamínula) para evitar danificar a matriz.
         NOTA: Esta matriz não pode ser armazenada. Semeie as células imediatamente após remover o excesso de colágeno I.

2. Semeadura de células, tempo de cultura e fixação

1. Dependendo do tipo de célula, prepare as células no meio de cultura apropriado e adicione células para um volume final de 500 μL por poço.
2. Para caracterizar a capacidade de uma linha celular para formar invadossomas lineares e para degradar a matriz, prenda as células por 4 h, 12 h e 24 h na matriz de colágeno I para determinar a cinética da formação de invadosoma linear e a atividade de degradação associada.
   NOTA: A Tabela 1 contém exemplos de linhas celularesTestado em laboratório.

   Linha celular	Número de células por capa	Tempo de contato com a matriz para quantificação de invadosoma linear	Tempo de contato com a matriz para quantificação da atividade de degradação do invadosoma linear
   MDA MB 231	40.000	4 h	12 h
   HUH7	40.000	12 h	24 h
   HEP 3B	40.000	12 h	24 h
   SNU 398	40.000	12 h	24 h
   NIH 3T3, src	30.000	4 h	12 h
   A431	50,000	6 h	24 h
   A549	40.000	12 h	24 h &# 160;
   CRU	40.000	12 h	12 h
   PAE	40.000	12 h	12 h

   Tabela 1: Referência de semeadura celular e tempo de incubação. Esta tabela apresenta uma lista não exaustiva de linhas celulares usadas para estudar invadossomas lineares. Indica o número de células para semente na matriz, o tempo necessário para observar invadossomas lineares e o tempo necessário para observar a degradação da matriz associada. Os invadosomes lineares têm uma vida curta. Para poder observar invadossomas lineares no número máximo de células, as células devem estar em contato com a matriz de colágeno I por um curto período de tempo. Por outro lado, para poder visualizar a degradação de gelatina relatada, as células devem estar em contato com a matriz de colágeno I por um período de tempo maior que os listados acima.
3. Após a remoção do meio de cultura de células,Conserte os lamínulas durante 10 minutos em 500 μL de paraformaldeído a 4% em PBS 1X.
4. Lave duas vezes com 1x PBS.
5. Armazenar a 4 ° C, protegido da luz.

3. Imunofluorescência

1. Permeabilize as células por 10 min com uma solução fresca. De Triton X-100 a 0,2% em 1x PBS. Não reutilize esta solução.
2. Lave os lamínulas duas vezes com 1x PBS.
3. Coloque um parafino (20 cm x 15 cm) no banco.
4. Diluir o anticorpo primário em 4% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x PBS, conforme descrito na Tabela de Materiais .
5. Alíquotas de 50 μL de gotículas de solução de anticorpo primário em uma linha, cada uma espaçada aproximadamente a 1 cm de distância.
6. Coloque cada lamínula sobre uma gota.
7. Incube durante 40 min à temperatura ambiente, protegido da luz.
8. Após o período de incubação, lave duas vezes com 1x PBS.
9. Diluir o anticorpo secundário, faloidina e tintura Hoechst em 4% BSA em 1xPBS.
10. Alíquotas de 50 μL de gotículas da mistura, cada uma espaçada aproximadamente 1 cm abaixo da primeira linha de lamínulas, conforme feito anteriormente.
11. Coloque cada lamínula sobre uma gota.
12. Incube durante 30 min à temperatura ambiente, protegido da luz.
13. Após a incubação, lave duas vezes com 1x PBS.
14. Lave uma vez com água destilada para remover os sais.
15. Monte os lamínulas em uma lâmina de vidro com meio de montagem de polimerização.
16. Deixe os cobertores secar durante a noite à temperatura ambiente, protegidos da luz, antes da microscopia.

4. Quantificações

Figura 2: Quantificação do invadosoma linear. A macro requer imagens confocadas de F-actina e coloração Tks5 (formato: 1.024 x 1.024). ( A ) Primeiro, abra a imagem F-actina e faça uma máscara. ( B ) Então, abraA imagem Tks5 e limita-a. Aplique a macro. ( C ) Os resultados analisados ​​aparecerão em duas tabelas. O número de invadosomes lineares por célula e outras informações, como a área de porcentagem usada por invadoss linux na célula, estará na tabela Resumo. O tamanho de cada invadosoma linear será na tabela de resultados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Porcentagem de células que formam invadossomas lineares
   1. Contar as células que formam invadossomas lineares, aproximadamente 100 células por lamelas (use triplicados técnicos). Quantifique pelo menos 300 células por n, com n = 3.
   2. Calcule a porcentagem de células que formam invadossomas lineares, tomando a média de três experiências independentes, resultando em 900 células quantificadas.
2. Tamanho e número de invadosome linear de células
   NOTA: Use um microscópio confocal para tirar imagens seqüenciais das manchas F-actina e Tks5. A macro é adaptada para um formato de imagem de 1.024 x 1.024.
   1. Use ImageJ com a macro suplementar.
3. Degradação por célula
   1. Use três lamínulas por condição.
   2. Pegue 30 imagens por lamínula de gelatina fluorescente e núcleos manchados com Hoechst.
   3. Use o software ImageJ como descrito em Martin KH et al. ⁹ .

5. Ensaio de invasão de colágeno 3D

Figura 3: esquema de ensaio de invasão. Resumo do protocolo de ensaio de invasão. O colágeno I é reticulado com corante de éster succinimidílico e polimerizado durante 1 h a 37 ° C. As células são adicionadas em meio isento de soro em cima do plugue de colágeno I. A inserção é colocada em média wi10% FBS. Os tampões de colágeno I são fixados 1 h após a semeadura celular no controle e 3 dias após a semeadura celular na condição experimental para determinar a capacidade de invasão das células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação de plugue de colágeno e eu
   1. Faça um curso de tempo de 4 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h para o primeiro experimento para determinar a cinética de invasão no gel de acordo com o tipo de célula. Para cada experiência, adicione um ponto de tempo de 1 h como um ponto de tempo de referência quando não ocorre uma invasão.
   2. Prepare a solução de colágeno I no gelo sob uma capa de fluxo laminar estéril. Prepare 500 μL de solução para 3 inserções de câmara Boyden.
   3. Aspirar 1 mg de colágeno comercial de rato-cauda I para preparar uma solução com uma concentração final de 2 mg / mL de colágeno I.
   4. Adicionar 5-carboxi x éster succinimidílico de Rhodamine aUma concentração final de 1 μg / mL, calculada para o volume final da solução de colágeno I (neste caso, 500 μL).
   5. Misture bem e incube durante 5 minutos no gelo sob o capô de fluxo laminar estéril, protegido da luz.
   6. Adicionar 50 μL de PBS 10X arrefecido com gelo e 6,25 μL de hidróxido de sódio 1 M gelado (NaOH).
   7. Adicione água estéril de acordo com a fórmula 443.75 - x μL de colágeno I.
   8. Adicione 100 μL de solução por inserção da câmara de Boyden.
   9. Incubar durante 1 h a 37 ° C para permitir a polimerização.
   10. Adicionar meio de cultura celular enriquecido com soro fetal bovino (FBS) em novos poços; Coloque inserções nesses poços.
   11. Semeiam 30 mil células em cima do colágeno que eu conto em meio sem FBS.
   12. Após a cultura das células a 37 ° C, coloque o tampão de colagénio I durante 30 minutos em paraformaldeído a 4% em 1x PBS.
   13. Imunofluorescência completa como no passo 3, com exceção das seguintes etapas: permeabilidadeZe com 0,2% de Triton X-100 em 1x PBS durante 30 min, não 10 min; Incubar com soluções de anticorpos primários e secundários por 1,5 h cada, em vez de 40 min e 30 min, respectivamente. Mancha para F-actina ou núcleos para localizar as células.
   14. Após imunofluorescência, use um bisturi para cortar a membrana da inserção e transferir cuidadosamente o plugue de colágeno I para um prato de fundo de vidro. Certifique-se de que a parte superior do plugue de colágeno I esteja em contato com o vidro. Mantenha a membrana de inserção ligada ao fundo do plugue de colágeno I para manter a integridade do plugue.
       NOTA: O plugue de colágeno I permanece intacto no prato de fundo de vidro. A profundidade entre o fundo de vidro eo plástico que circunda o fundo de vidro é equivalente à espessura do bujão.
   15. Coloque um lamínula no plugue de colágeno I e monte com o meio de montagem de polimerização para evitar que o plugue seque.
   16. Use um microscópio confocal invertido para projetar o plugue de colágeno I; O topo deO plugue está em contato com o fundo de vidro do prato.
       1. Adquira uma pilha z da parte superior para a parte inferior do plugue de colágeno I para visualizar a invasão celular. Determine a espessura da pilha z ao examinar quão profundamente as células invadem o campo de imagem. Execute aquisições com um objetivo de óleo 40X em um formato de 512 x 512 com um tamanho de passo z de 0,25 μm.
          NOTA: Para referência, a pilha média de células MDA-MB-231 3 dias após a semeadura é de 30 μm.

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Resultados

Usando uma combinação de dois tipos de matrizes, gelatina e colágeno tipo I ( Figuras 1 e 4 ), destacamos um novo tipo de invadosoma, conhecido como invadossomas lineares. A rotulagem dessas matrizes permite a observação da formação de invadosoma linear ao longo de fibras de colágeno I e de suas capacidades de degradação ( Figura 5 ). O número de estruturas invasivas pode então ser quantificado pela macro descrita anteriormen...

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Discussão

Classicamente, os invadosomas são estudados in vitro , independentemente do microambiente e da matriz em que as células são banhadas. São atualmente utilizados vários tipos de matrizes, incluindo gelatina, fibronectina, vitronectina ou colágeno fibrilar de alta densidade (HDFC) ^{7 , 11} ; No entanto, muitas vezes não são representativas do microambiente em que as células residem e não são fisiologicamente relevantes. Aqui, foi utilizado um novo...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin solution	Sigma	G1393	Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate	Molecular probe life technologies	G13186	5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
Microscope cover glasses	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12mm No.1
2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4	Electron microscopy science	15960	Dilute at 0.5 % in sterile water
1x PBS pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	Use this PBS in all steps before fixation
Collagen I Rat tail	Corning	354236
5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester	Life technologies	C-6125
DPBS 1x + calcium + magnesium	Gibco by life technologies	14040-091
Paraformaldehyde 16% solution	Electron microscopy science	15710	Dilute at 4% in 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x PBS buffer pH 7.4	Ambion	AM9625	Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
Tks5 antibody	Santa Cruz	sc-30122	Invadosome markers Dilution : 1/100
Cortactin 4F11 antibody	Millipore	5180	Invadosome markers Dilution :1/100
DDR1 antibody	Cell signaling	5583	Linear invadosome receptor
Dilution :1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrillary actin marker Dilution :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Nucleus marker Dilution :1/200
Secondary antibodies FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H or FP-647H
Albumin from bovine serum	Sigma	A2153	Dilute at 4% in 1X PBS
Fluoromount G mounting medium	Interchim	FP 483331
ImageJ software	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Cell culture insert	Corning	353097	8.0µm pore size / 24 wells
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	221465