선형 Invadosome 형성과 활동을 연구하기위한 2D와 3D 매트릭스

요약

이 프로토콜은 젤라틴과 콜라겐 I로 구성된 2D 혼합 매트릭스를 준비하는 방법과 선형 invadosomes를 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그를 작성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 선형 invadosome 형성, 매트릭스 저하 활동 및 기본 세포와 암세포 라인의 침략 기능에 대한 연구를 허용합니다.

초록

세포 접착, 이동 및 침입은 많은 생리적 및 병리학 적 과정에 관여한다. 예를 들어, 전이가 형성되는 동안 종양 세포는 혈액이나 림프관에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘어 침입하고 주변 조직을 통해 이동해야합니다. 이것은 세포와 세포 외 기질 (ECM) 사이의 상호 작용을 필요로합니다. 세포 수준에서, 대부분의 암세포를 포함하여 많은 세포가 ECM을 분해 할 수있는 F- 굴지 기반 구조 인 침입자를 형성 할 수 있습니다. Invadosome은 matrix metalloproteinases (MMPs)를 모집하고 활성화시키는 돌출 액틴 구조입니다. ECM의 분자 구성, 밀도, 조직 및 강성은 침입자 형성 및 활성화를 조절하는 데 중요합니다. 시험 관내 에서, 젤라틴 분석은 침입자 분해 작용을 관찰하고 정량화하는데 사용되는 표준 분석법이다. 그러나, 변성 콜라겐 I 인 젤라틴은 생리적 매트릭스가 아니며준비. I 형 콜라겐 원 섬유를 사용하는 새로운 분석법이 개발되어이 생리 학적 매트릭스가 침입자의 강력한 유도제임을 입증합니다. 콜라겐 원 섬유를 따라 형성되는 침입자는 섬유상에서 선형 구조로 인해 선형 침입자로 알려져 있습니다. 또한, 선형 invadosomes의 분자 분석은 discoidin 도메인 수용체 1 (DDR1)은 그들의 형성에 관여 수용체임을 보여 주었다. 이러한 데이터는 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 이해하기 위해 생리 학적으로 관련이있는 매트릭스를 사용하는 것이 중요하다는 것을 분명히 보여줍니다.

서문

세포 외 기질 (ECM) 재 형성은 혈관 신생 및 종양 세포 침범과 같은 생리적 및 병리학 적 과정 중에 발생한다. 생리 조건에서 대부분 조혈 계통의 많은 세포 유형이 ECM 요소를 분해 할 수 있습니다. 예를 들어, 대 식세포는 조직에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘을 수 있으며 파골 세포는 칼슘 항상성을 보장하기 위해 골질을 분해합니다. 전 세계적으로 신체의 모든 매트릭스가 물리적, 화학적 특성을 유지하기 위해 갱신됩니다. 암 조직에서 종양의 미세 환경 구성이 변경됩니다. 예를 들어, 유방암과 폐암에서 I 형 콜라겐은 과발현되어 종양 주위에 축적됩니다. 더욱이,이 축적은 전이를 일으킬 위험도가 높아진다. 암 전이는 암 세포가 ECM을 저하시키고 인접 조직을 침범하는 능력에 달려 있습니다.

그만큼세포의 침입 성 활동은 침입자 (invadosome)로 알려진 특이한 액틴 풍부 구조에 기인한다. 이 용어는 정상 세포와 암 세포 ( 예 : 대 식세포, 내피 세포, MDA-MB-231 유방암 세포주와 같은 암세포)에 각각 존재하는 포도 솜 (podosomes)과 인다도 포디 아 (invadopodia)를 포함합니다. 시험 관내 에서, invadosome은 점, 집계, 또는 장미와 같은 다양한 형태로 구성 될 수 있습니다 ³ . 고전적으로, invadosomes은 integrins과 vinculin ⁴ 와 같은 접착 플라크 분자로 둘러싸인 scaffold protein Tks5와 cortactin과 같은 여러 단백질을 함유 한 F-actin 코어로 구성됩니다. 최근 Tks5와 RhoGTPase Cdc42가 기능성 침입자의 최소 분자 표지로 사용될 수 있음이 밝혀졌습니다 ⁵ . 이러한 구조는 MT1-MMP 및 MMP-2와 같은 특정 메탈로 프로테아제 단백질의 동원 및 활성화를 통해 ECM을 분해 할 수있다. 이전 연구에서 I 형 콜라겐 원 섬유와 I 형 콜라겐 원 섬유의 특이 적 수용체 인 디스코 딘 도메인 수용체 1 (DDR1) 사이의 상호 작용이 선형 침입자라는 새로운 종류의 침입자를 형성한다고보고했습니다. Linear invadosome은 I 형 콜라겐 원 섬유에 따라 형성된다. 이러한 구조는 MT1-MMP / MMP2의 동원 및 활성화를 통해 I 형 콜라겐 섬유질을 분해 할 수 있습니다. 또한, 그들의 형성은 Tks5와 Cdc42 ⁵ 에 달려있다. 시험관 내 에서, 우리는 선형 invadosomes의 존재와 DDR1의 형성과 활동 ⁸ 의 참여를 보여 주었다 : i) 형광 젤라틴 코팅 coverslips, ii) 형광 타입 I 콜라겐 피 브릴 코팅 된 coverslips, 그리고 iii) 3D 타입 I 콜라겐 플러그. 다른 행렬의 사용으로 인해 우리는 공부할 수 있었고 성격도 좋았습니다.선형 invadosome 형성과 그들의 분해 활성을 감소시킨다. ^{7 , 8} .

마지막으로 침입 세포의 생물학적 특성을보다 잘 이해하기 위해 종양 미세 환경 조성의 복잡성을 모방 한 2D 및 3D 배양 시스템에서 ECM 구성 요소의 조합을 사용했습니다. 아래는 2D 및 3D 배양 시스템에서 젤라틴 / I 형 콜라겐으로 커버 슬립을 코팅하기위한 프로토콜입니다.

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프로토콜

참고 : 고정하기 전에 모든 단계는 멸균 층류 후드에서 완료됩니다.

1. 2D 매트릭스

참고 : 2D 행렬은 침입자를 형성하는 세포의 비율과 세포 당 매트릭스 분해 영역을 결정하는 데 사용됩니다.

그림 1 : 프로토콜. 젤라틴 및 콜라겐 I 매트릭스를 제조하는 데 사용 된 프로토콜 요약. 젤라틴 매트릭스 만 만들거나 젤라틴과 콜라겐 혼합 매트릭스를 만들 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 젤라틴 매트릭스
   참고 : 형광 젤라틴 매트릭스는 매트릭스 분해를 정량화하는 데 사용되며 비 형광 젤라틴은 콜라겐 I 섬유의 접착을 촉진하는 데 사용됩니다. 형광 젤라틴 매트rices는 또한 podosome 및 invadopodia 연구에 사용됩니다 ( 그림 1 참조).
   1. 멸균 층류 후드 아래에서 작업 영역에 parafilm (20cm x 15cm) 조각을 놓고 70 % 에탄올로 소독합니다.
   2. 1 ㎝ 간격으로 줄 지어 1 ㎎ / mL 젤라틴의 분액 20 μL 액적; 방울 조직에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
   3. 각 20 μL 젤라틴 방울을 압력솥 유리 coverslip (직경 12 mm)로 덮으십시오.
   4. 실온에서 20 분 동안 품어 낸다. 젤라틴이 형광등 인 경우 빛으로부터 보호하십시오.
   5. 1 분 1 초 인산염 완충 식염수 (PBS)에 0.5 % 글루 타르 알데히드 40 μL의 작은 방울을 각각 1.1.3 단계의 커버 슬립 줄 아래 약 1 cm 간격으로 배치합니다.
      주의 : 글루 타르 알데히드는 독성 정착 제입니다. 장갑을 착용하고 흡입하지 마십시오.
   6. 보석 포셉을 사용하여 각 젤라틴 코팅 coverslip을 glutaraldehyde 방울로 이동하십시오.
      참고 : Itparafilm에 작은 젤라틴 물방울이 남는 것이 정상입니다. 이것을 다른 실험에 다시 사용하지 마십시오.
   7. 실온에서 40 분 동안 품어 낸다. 형광 커버 슬립의 경우 빛으로부터 보호하십시오.
   8. 24 잘 세포 배양 접시를 가지고 멸균 1X PBS의 500 μL로 각 우물을 작성하십시오. 각 우물에 coverslips, 젤라틴면을 올려 놓으십시오.
   9. 5 분 각각에 대해 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
      참고 :이 단계에서 coverslips는 실험에 사용하거나 4 ° C에서 1x PBS에 저장할 수 있습니다. 비 형광 coverslips은 일주일 동안 저장할 수 있으며, 형광 coverslips은 48 시간 동안 저장할 수 있습니다.
2. 섬유소 콜라겐 I 형 매트릭스
   참고 : 섬유소 콜라겐 I 형 매트릭스는 선형인데 도좀 형성 및 관련 매트릭스 분해를 연구하는 데 사용됩니다. 형광 콜라겐 I과 비 형광 젤라틴 coverslips의 조합은 콜라겐 섬유와 invadosome 마커를 colocalize하는 데 사용됩니다 ( 예 : F - 굴지 나는원적외선 채널, 적색 채널의 콜라겐 I, 녹색 채널의 Tks5, 핵 얼룩의 Hoechst 염료). 반면에 비 형광성 콜라겐 I과 비 형광 젤라틴 coverslips의 조합은 염색 된 침입자 마커의 수를 최대화하기 위해 사용됩니다 ( 예 : 적색 채널의 F- 액틴, 적색 채널의 코르 탁틴, 녹색 채널, 핵 염색을위한 Hoechst 염료). 마지막으로 형광이없는 콜라겐 I과 형광성 젤라틴 coverslips의 조합을 사용하여 젤라틴 관련 분해를 측정합니다 ( 예 : 원적외선 채널의 F- 액틴, 적색 채널의 Tks5, 녹색 채널의 Tks5 및 헴스트 염료 핵 염색을 위해) (그림 1 참조). Hoechst 염료는 핵을 염색하는데 사용되며, 또한 사용 된 세포주에서 정기적으로 수행되는 PCR 검사와 더불어 마이코 플라스마 오염을 검사합니다.
   1. 형광 콜라겐 I
      1. 0.02 N 아세트산에서 쥐 - 꼬리 힘줄에서 추출한 상업용 콜라겐을 사용하십시오.디. 콜라겐 I의 0.4mg / mL의 최종 농도에서 coverslip 당 500μL의 용액을 준비하는데 필요한 콜라겐의 양을 제거하십시오.
      2. 콜라겐 I 용액 (nx 500 μL)의 최종 부피를 계산하여 10 μg / mL의 최종 농도로 5-carboxy x rhodamine succinimidyl ester를 첨가한다.
      3. 위 아래로 pipetting하여 솔루션을 혼합하고 빛으로부터 보호, 실온에서 5 분 품어.
      4. 칼슘과 마그네슘을 함유 한 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS)으로 최종 부피로 희석하고 직접 사용하십시오.
   2. 섬유소 콜라겐 나는 coverslip
      1. 이전에 단계 1.1에서 준비한 비 형광 또는 형광 젤라틴 coverslips를 사용하십시오.
      2. 칼슘과 마그네슘을 함유 한 1X DPBS에서 0.4mg / mL의 최종 농도로 형광 또는 비 형광 콜라겐 I 용액을 준비합니다.
      3. 500 μL의 형광 또는 비 형광 콜라겐 I 용액을 추가합니다coverslip 24- 웰 세포 배양 접시에.
      4. 콜라겐 중합을 위해 37 ° C에서 4 시간 동안 인큐베이션한다.
      5. 부화 후, 매트릭스를 손상을 피하기 위해 (물론 coverslip에 아닙니다)의 측면에 플레이트와 pipetting 기울여하여 콜라겐 과잉을 제거합니다.
         참고 :이 행렬은 저장할 수 없습니다. 과잉 콜라겐을 제거한 직후에 세포에 씨를 뿌린다.

2. 세포 파종, 배양 시간 및 고정

1. 세포 유형에 따라, 적절한 배지에 세포를 준비하고 우물 당 500 μL의 최종 볼륨에 대한 세포를 추가합니다.
2. 선형 invadosomes를 형성하고 매트릭스를 저하시키는 세포주의 능력을 특성화하기 위해 선형 invadosome 형성 및 관련 저하 활동의 속도론을 결정하기 위해 콜라겐 I 매트릭스에 4 시간, 12 시간 및 24 시간 동안 세포를 플레이트하십시오.
   참고 : 표 1 은 세포주실험실에서 테스트되었습니다.

   세포주	coverslip 당 세포의 수	선형 invadosome 부량을위한 모체와의 접촉 시간	선형 invadosome 분해 활성의 정량을위한 matrix와의 접촉 시간
   MDA MB 231	40,000	4 시간	12 시간
   HUH7	40,000	12 시간	24 시간
   HEP 3B	40,000	12 시간	24 시간
   서울대 398 호	40,000	12 시간	24 시간
   NIH 3T3 src	30,000	4 시간	12 시간
   A431	50,000	6시	24 시간
   A549	40,000	12 시간	24 시간 후# 160;
   노골적인	40,000	12 시간	12 시간
   PAE	40,000	12 시간	12 시간

   표 1 : 세포 파종 및 배양 시간 참고. 이 표는 선형 invadosomes를 연구하는 데 사용되는 세포 라인의 비 포괄적 인 목록을 제공합니다. 이것은 매트릭스에 시드 할 세포의 수, 선형 침입자를 관찰하는 데 필요한 시간 및 관련 매트릭스 분해를 관찰하는 데 필요한 시간을 나타냅니다. 선형 침입자는 수명이 짧습니다. 세포의 최대 숫자에서 선형 invadosomes을 관찰 할 수 있도록, 세포는 시간이 짧은 기간 동안 콜라겐 전 매트릭스와 접촉해야합니다. 반면에,보고 된 젤라틴 분해를 시각화 할 수 있으려면 세포는 콜라겐 I 매트릭스와 위에 나열된 것보다 오랜 기간 동안 접촉해야합니다.
3. 세포 배양 배지를 제거한 후,1X PBS에 4 % paraformaldehyde 500 μL 10 분 coverslips을 수정.
4. 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
5. 빛으로부터 보호 된 4 ° C에서 보관하십시오.

3. 면역 형광법

1. 신선하게 준비된 용액으로 10 분 동안 세포를 침투시킨다. 1X PBS 중 0.2 % Triton X-100. 이 솔루션을 다시 사용하지 마십시오.
2. coverslips를 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
3. 벤치에 parafilm (20cm x 15cm) 조각을 놓습니다.
4. 재료 표 에 설명 된대로 1x PBS에 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 기본 항체를 희석합니다.
5. 한 줄에 1 차 항체 용액을 50 μL 나누어 각각 약 1 cm 간격으로 둡니다.
6. 각 coverslip을 물방울에 놓습니다.
7. 빛으로부터 보호 된 실온에서 40 분 동안 품어 낸다.
8. 잠복기 후, 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
9. 2 차 항체, phalloidin, Hoechst dye를 1 % BSA 4 %PBS.
10. 분량 50μL의 혼합 액을 각각 이전에 행한 것처럼 coverslips의 첫 번째 줄 아래 약 1cm 간격으로 배치합니다.
11. 각 coverslip을 물방울에 놓습니다.
12. 빛으로부터 보호 된 실온에서 30 분 동안 품어 낸다.
13. 부화 후, 1x PBS로 두 번 씻으십시오.
14. 증류수로 한 번 씻어서 소금을 제거하십시오.
15. 마운팅 매체 중합과 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재하십시오.
16. 현미경 검사 전에 실온에서 밤 사이에 커버 슬립을 건조시켜 빛으로부터 보호하십시오.

4. 수량

그림 2 : 선형 침입 정량. 매크로는 F - 굴지와 Tks5 얼룩 (형식 : 1,024 X 1,024)의 공 촛점 이미지가 필요합니다. ( A ) 먼저 F-actin 그림을 열고 가면을 만드십시오. ( B ) 그런 다음, openTks5 그림과 그것을 임계 값. 매크로를 적용하십시오. ( C ) 분석 결과는 두 테이블에 나타납니다. 셀당 선형 침입자의 수와 셀의 선형 침입자가 사용하는 백분율 영역과 같은 기타 정보는 요약 테이블에 있습니다. 각 선형 침입자의 크기는 결과 테이블에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 선형 invadosomes를 형성하는 세포의 백분율
   1. 선형 invadosomes를 형성 셀을 계산, coverslip 당 약 100 세포 (기술 triplicates를 사용). n 당 3,000 개 이상의 세포를 정량화하십시오.
   2. 세 번의 독립적 인 실험의 평균을 취하여 선형 인베 돌좀을 형성하는 세포의 백분율을 계산하면 900 개의 정량 세포가 생성됩니다.
2. 세포 당 선형 침입 크기 및 수
   참고 : F - 굴지와 Tks5 얼룩의 연속 이미지를 찍으려면 공 촛점 현미경을 사용하십시오. 매크로는 1,024 x 1,024 이미지 형식으로 조정됩니다.
   1. 보충 매크로와 함께 ImageJ를 사용하십시오.
3. 세포 당 분해
   1. 조건 당 3 개의 커버 슬립을 사용하십시오.
   2. 형광 젤라틴과 Hoechst 얼룩 핵의 coverslip 당 30 이미지를 가져 가라.
   3. Martin KH et al. 에 설명 된대로 ImageJ 소프트웨어를 사용하십시오 . ⁹ .

5. 3D 콜라겐 침입 분석

그림 3 : 침입 분석 스키마. 침략 분석 프로토콜 요약. 콜라겐 I은 숙신 이미 딜 에스테르 염료와 가교 결합되어 37 ° C에서 1 시간 동안 중합됩니다. 세포는 혈청이없는 배지에 콜라겐 I 플러그 위에 첨가됩니다. 삽입물은 중간 크기10 % FBS. 콜라겐 I 플러그는 대조군에서 세포 파종 1 시간 후 및 실험 조건에서 세포 파종 3 일 후 세포의 침투 용량을 결정하기 위해 고정시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 콜라겐 I 준비 플러그
   1. 세포 유형에 따라 젤에 침략의 속도론을 결정하는 첫 번째 실험에 대한 4 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간의 시간 과정을 확인하십시오. 각 실험마다 침입이 일어나지 않을 때 기준 시점으로 1 시간 지점을 추가하십시오.
   2. 멸균 층류 후드 아래 얼음에 콜라겐 I 솔루션을 준비합니다. 3 개의 Boyden 챔버 인서트 용 용액 500 μL를 준비하십시오.
   3. 상업용 쥐 - 꼬리 콜라겐 1mg을 흡인하여 2mg / ml 콜라겐 I의 최종 농도를 갖는 용액을 제조하십시오.
   4. 5- 카르복시 x 로다 민 석신 이미 딜 에스테르를콜라겐 I 용액 (이 경우, 500 μL)의 최종 부피에 대해 계산 된 1 μg / mL의 최종 농도.
   5. 잘 섞어서 빛으로부터 보호되는 멸균 층류 후드 아래 얼음 위에서 5 분 동안 품어 라.
   6. 얼음처럼 차가운 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)을 얼음 저온의 여과 된 10X PBS와 6.25 μL의 50 μL를 첨가한다.
   7. 식 443.75 - x μL의 콜라겐 I에 따라 멸균 수를 추가하십시오.
   8. Boyden chamber insert 당 100 μL의 용액을 첨가하십시오.
   9. 중합을 허용하기 위해 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 낸다.
   10. 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 풍부한 세포 배양 배지를 새로운 우물에 첨가한다. 이 우물에 삽입물을 넣으십시오.
   11. 콜라겐 위에 씨앗 30,000 개의 세포를 넣고 FBS가없는 배지를 연결합니다.
   12. 37 ° C에서 세포를 배양 후, 1X PBS에 4 % paraformaldehyde에 30 분 동안 콜라겐 제가 플러그 수정.
   13. 다음 단계를 제외하고 3 단계에서와 같이 완전한 면역 형광법을 사용하십시오 : 투과 액30 분 동안 10 분이 아닌 1 x PBS에서 0.2 % Triton X-100으로 ze 처리; 각각 40 분 및 30 분이 아닌 1.5 시간 동안 1 차 및 2 차 항체 용액과 함께 배양하십시오. 세포를 국한시키기 위해 F- 액틴 또는 핵에 염색합니다.
   14. immunofluorescence 후, 삽입물의 멤브레인 주위를 잘라하고 유리 바닥 접시에 콜라겐 내가 플러그를 신중하게 메스를 사용합니다. 콜라겐 I 플러그의 꼭대기가 유리와 접촉되어 있는지 확인하십시오. 플러그의 완전성을 유지하기 위해 삽입 막을 콜라겐 바닥에 붙이십시오.
       참고 : 콜라겐 I 플러그는 유리 바닥 접시에 그대로 남아 있습니다. 유리 바닥과 유리 바닥을 감싸는 플라스틱 사이의 깊이는 플러그의 두께와 동일합니다.
   15. 콜라겐 I에 coverslip을 놓고 마개가 막히는 것을 막기 위해 중합 매체를 장착합니다.
   16. 콜라겐 I 이미지를 이미지화하기 위해 역상 공 촛점 현미경을 사용하십시오. 정상플러그가 접시의 유리 바닥과 접촉합니다.
       1. 세포 침입을 시각화하기 위해 연결하는 콜라겐의 상단에서 하단까지 z 스택을 얻습니다. 세포가 이미징 분야에 얼마나 깊이 침투 하는지를 조사하여 z-stack의 두께를 결정하십시오. 0.25x의 z- 스텝 크기를 가진 512x512 포맷의 40X 오일 대물 렌즈로 수집을 수행하십시오.
          참고 : 참고로, MDA-MB-231 세포의 평균 z-stack은 seeding 3 일 후에 30 μm입니다.

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결과

젤라틴과 I 형 콜라겐의 두 가지 유형 ( 그림 1 과 4 )의 조합을 사용하여 선형 침입자로 알려진 새로운 유형의 침입자를 강조했습니다. 이러한 매트릭스의 라벨링은 콜라겐 I 섬유 및 그 분해능에 따른 선형인데 돔 형성의 관찰을 허용한다 ( 도 5 ). 침입 구조의 수는 이전에 설명한 매크로 (단계 4.2)에 의해 정량화 될 수 있으며, 분해 활...

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토론

고전적으로, invadosomes는 microenvironment 및 세포가 도금되는 매트릭스에 관계없이 체외에서 공부 하고 있습니다. 젤라틴, fibronectin, vitronectin 또는 고밀도 원 섬유 콜라겐 (HDFC) 7,11을 포함하여 여러 유형의 매트릭스가 현재 사용됩니다. 그러나, 이들은 종종 세포가 존재하고 생리 학적으로 관련이없는 미세 환경을 대표하지 못한다. 여기에는 젤라틴과 섬유소 I 형 콜라겐 사이의 결합으로...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin solution	Sigma	G1393	Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate	Molecular probe life technologies	G13186	5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
Microscope cover glasses	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12mm No.1
2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4	Electron microscopy science	15960	Dilute at 0.5 % in sterile water
1x PBS pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	Use this PBS in all steps before fixation
Collagen I Rat tail	Corning	354236
5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester	Life technologies	C-6125
DPBS 1x + calcium + magnesium	Gibco by life technologies	14040-091
Paraformaldehyde 16% solution	Electron microscopy science	15710	Dilute at 4% in 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x PBS buffer pH 7.4	Ambion	AM9625	Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
Tks5 antibody	Santa Cruz	sc-30122	Invadosome markers Dilution : 1/100
Cortactin 4F11 antibody	Millipore	5180	Invadosome markers Dilution :1/100
DDR1 antibody	Cell signaling	5583	Linear invadosome receptor
Dilution :1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrillary actin marker Dilution :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Nucleus marker Dilution :1/200
Secondary antibodies FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H or FP-647H
Albumin from bovine serum	Sigma	A2153	Dilute at 4% in 1X PBS
Fluoromount G mounting medium	Interchim	FP 483331
ImageJ software	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Cell culture insert	Corning	353097	8.0µm pore size / 24 wells
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	221465