Matrices 2D et 3D pour étudier la formation et l'activité invadosome linéaire

Résumé

Ce protocole décrit comment préparer une matrice mixte 2D, constituée de gélatine et de collagène I, et une prise de collagène I 3D pour étudier les invadosomes linéaires. Ces protocoles permettent l'étude de la formation linéaire d'invadosome, l'activité de dégradation matricielle et les capacités d'invasion des cellules primaires et des lignées cellulaires cancéreuses.

Résumé

L'adhésion, la migration et l'invasion cellulaire sont impliquées dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Par exemple, lors de la formation de métastases, les cellules tumorales doivent traverser les barrières anatomiques pour envahir et migrer à travers le tissu environnant afin d'atteindre le sang ou les vaisseaux lymphatiques. Cela nécessite l'interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM). Au niveau cellulaire, de nombreuses cellules, y compris la majorité des cellules cancéreuses, sont capables de former des invadosomes, qui sont des structures à base de F-actine capables de dégrader l'ECM. Les invadosomes sont des structures d'actine protrusives qui recrutent et activent des métalloprotéinases matricielles (MMP). La composition moléculaire, la densité, l'organisation et la rigidité de l'ECM sont essentielles pour réguler la formation et l'activation de l'invadosome. In vitro , un dosage de gélatine est l'essai standard utilisé pour observer et quantifier l'activité de dégradation de l'invadosome. Cependant, la gélatine, qui est le collagène I dénaturé, n'est pas une matrice physiologique eLement. Un nouvel essai utilisant des fibrilles de collagène de type I a été développé et utilisé pour démontrer que cette matrice physiologique est un inducteur puissant d'invadosomes. Les invadosomes qui se forment le long des fibrilles de collagène sont appelés invadosomes linéaires en raison de leur organisation linéaire sur les fibres. En outre, l'analyse moléculaire des invadosomes linéaires a montré que le récepteur 1 du domaine de la discoïde (DDR1) est le récepteur impliqué dans leur formation. Ces données démontrent clairement l'importance d'utiliser une matrice physiologiquement pertinente afin de comprendre les interactions complexes entre les cellules et l'ECM.

Introduction

Le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) se produit au cours de processus physiologiques et pathologiques tels que l'angiogenèse et l'invasion de cellules tumorales. Dans les conditions physiologiques, de nombreux types cellulaires, principalement issus de la lignée hématopoïétique, peuvent dégrader les éléments ECM. Par exemple, les macrophages sont capables de traverser les barrières anatomiques pour atteindre les tissus, et les ostéoclastes dégradent la matrice osseuse pour assurer l'homéostasie du calcium. Plus globalement, toutes les matrices du corps se renouvellent pour maintenir leurs propriétés physiques et chimiques. Dans les tissus cancéreux, la composition du micro-environnement de la tumeur est modifiée. Par exemple, dans le cancer du sein et du poumon, le collagène de type I est surexprimé et s'accumule autour de la tumeur. En outre, cette accumulation est associée à un risque accru de développer une métastase ^{1 , 2} . La métastase du cancer dépend de la capacité des cellules cancéreuses à dégrader l'ECM et à envahir les tissus adjacents.

leL'activité invasive des cellules est attribuée à des structures riches en actine spécialisées connues sous le nom d'invadosomes. Ce terme comprend les podosomes et les invadopodes, présents respectivement dans les cellules normales et cancéreuses ( p. Ex., Les macrophages, les cellules endothéliales et les cellules cancéreuses telles que la lignée cellulaire du cancer du sein MDA-MB-231). In vitro , les invadosomes peuvent s'organiser sous différentes formes: points, agrégats ou rosettes ³ . Classiquement, les invadosomes sont composés d'un noyau de F-actine contenant plusieurs protéines, telles que la protéine d'échafaudage Tks5 et la cortactine, entourée de molécules de plaque adhésive, telles que les intégrines et les ligatures ⁴ . Récemment, il a été montré que Tks5 et la RhoGTPase Cdc42 peuvent être utilisées comme minimum de signature moléculaire pour les invadosomes fonctionnels ⁵ . Ces structures sont capables de dégrader l'ECM par le recrutement et l'activation de protéines spécifiques de métalloprotéases, telles que MT1-MMP et MMP-2 ⁶. Dans une étude antérieure, nous avons signalé que l'interaction entre les fibrilles de collagène de type I et le récepteur 1 du domaine de la discoïde (DDR1), un récepteur spécifique des fibrilles de collagène de type I, conduit à la formation d'une nouvelle classe d'invadosomes appelés invadosomes linéaires. Les invadosomes linéaires sont formés selon les fibrilles de collagène de type I ⁷ . Ces structures peuvent dégrader les fibrilles de collagène de type I par le recrutement et l'activation de MT1-MMP / MMP2. En outre, leur formation dépend de Tks5 et Cdc42 ⁵ . In vitro , nous avons démontré l'existence d'invadosomes linéaires et l'implication du DDR1 dans leur formation et leur activité ⁸ en utilisant différentes stratégies consistant en une combinaison de divers éléments matriciels, notamment: i) lamelles fluorescentes revêtues de gélatine, ii) fibrilles de collagène fluorescentes de type I Couvre-lits recouverts, et iii) les bouchons de collagène 3D type I. En raison de l'utilisation de différentes matrices, nous avons pu étudier et le caractèreFormation linéaire d'invadosome et leur activité de dégradation ^{7 , 8} .

Enfin, pour mieux comprendre la biologie des cellules envahissantes, on a utilisé une combinaison de composants ECM dans les systèmes de culture 2D et 3D, imitant la complexité de la composition micro-ambiante tumorale. Voici des protocoles pour le revêtement des lamelles avec du collagène de gélatine / type I dans les systèmes de culture 2D et 3D.

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Protocole

REMARQUE: Avant la fixation, toutes les étapes sont complétées dans un capot de flux laminaire stérile.

1. Matrice 2D

NOTE: Les matrices 2D sont utilisées pour déterminer le pourcentage de cellules formant des invadosomes et la zone de dégradation de la matrice par cellule.

Figure 1: Protocole. Résumé du protocole utilisé pour préparer les matrices de gélatine et de collagène I. Il est possible de fabriquer uniquement la matrice de gélatine ou une matrice mélangée de gélatine et de collagène I. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Matrice de gélatine
   NOTE: Les matrices de gélatine fluorescente sont utilisées pour quantifier la dégradation de la matrice, et la gélatine non fluorescente est utilisée pour favoriser l'adhérence des fibres de collagène I. Tapis de gélatine fluorescentLes rizières sont également utilisées pour les études sur les podosomes et les invadopodes (voir la figure 1 ).
   1. Sous un capot de flux laminaire stérile, placez un morceau de parafilm (20 cm x 15 cm) sur la zone de travail et désinfectez-le avec 70% d'éthanol.
   2. Aliquoter 20 μL de gouttelettes de 1 mg / ml de gélatine dans une ligne, espacée d'environ 1 cm l'une de l'autre; Se référer à la figure 1 pour l'organisation des gouttelettes.
   3. Couvrir chaque 20 μL de gouttelettes de gélatine avec une lamelle de verre autoclavée (12 mm de diamètre).
   4. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Si la gélatine est fluorescente, protégez-la de la lumière.
   5. Aliquoter 40 μL de gouttelettes de 0,5% de glutaraldéhyde dans 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS) dans une ligne, chacune espacée d'environ 1 cm au-dessous de la ligne des lamelles de l'étape 1.1.3.
      ATTENTION: Le glutaraldéhyde est un agent fixateur toxique. Utilisez des gants et ne pas inhaler.
   6. En utilisant des pinces à bijoux, transférez chaque lamelle revêtue de gélatine à une gouttelette de glutaraldéhyde.
      REMARQUE: ilEst normal qu'une petite gouttelette de gélatine reste sur le parafilm. Ne réutilisez pas cela pour une autre expérience.
   7. Incuber pendant 40 min à température ambiante. Pour les lamelles fluorescentes, protégez-les de la lumière.
   8. Prenez une plaque de culture cellulaire à 24 puits et remplissez chaque puits avec 500 μL de PBS 1x stérile. Placez les lamelles, de la gélatine vers le haut, dans chaque puits.
   9. Laver deux fois en 1x PBS pendant 5 min chacun.
      REMARQUE: à cette étape, les lamelles peuvent être utilisées pour expérimentation ou stockées dans 1x PBS à 4 ° C. Les lamelles non fluorescentes peuvent être stockées pendant une semaine, et les lamelles fluorescentes peuvent être stockées pendant 48 h.
2. Matrice de type I du collagène fibrillaire
   NOTE: La matrice de type collagène de type Fibrillaire est utilisée pour étudier la formation d'invadosome linéaire et la dégradation associée de la matrice. Une combinaison de collagène fluorescent I et de lamelles de gélatine non fluorescentes est utilisée pour localiser les marqueurs invadosomes avec des fibres de collagène ( p. Ex., La F-actine iN le canal lointain, le collagène I dans le canal rouge, Tks5 dans le canal vert et le colorant Hoechst pour une tache nucléaire). D'autre part, une combinaison de collagène I non fluorescent avec des lamelles de gélatine non fluorescentes est utilisée pour maximiser le nombre de marqueurs d'invadosome colorés ( p. Ex., L'actine F dans le canal lointain, la cortactine dans le canal rouge, Tks5 in Le canal vert et le colorant Hoechst pour une tache nucléaire). Enfin, une combinaison de collagène I non fluorescent avec des lamelles fluorescentes de gélatine est utilisée pour quantifier la dégradation associée à la gélatine ( p. Ex., L'actine F dans le canal lointain, Tks5 dans le canal rouge, dans le canal vert et le colorant Hoechst Pour une tache nucléaire) (voir la figure 1). Le colorant Hoechst est utilisé pour tacher le noyau, et il vérifie également la contamination par mycoplasme, en plus d'un test de PCR effectué régulièrement sur les lignées cellulaires utilisées.
   1. Colagène fluorescent I
      1. Utilisez le collagène commercial que j'ai extrait du tendon de rat-queue dans 0,02 N d'acide acétiqueré. Retirer la quantité de collagène I nécessaire pour préparer 500 μl de solution par lamelle à une concentration finale de 0,4 mg / mL de collagène I.
      2. Ajouter un ester 5-carboxy x rhodamine succinimidylique à une concentration finale de 10 μg / mL, calculé pour le volume final de la solution de collagène I (nx 500 μL).
      3. Mélanger la solution en pipetant vers le haut et vers le bas et incuber pendant 5 minutes à température ambiante, protégé de la lumière.
      4. Diluez le volume final avec 1 x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) contenant du calcium et du magnésium, et utilisez-le directement.
   2. Couchette de collagène Fibrillaire I
      1. Utilisez les lamelles de gélatine non fluorescentes ou fluorescentes préalablement préparées à l'étape 1.1.
      2. Préparer une solution de collagène I fluorescent ou non fluorescent à une concentration finale de 0,4 mg / mL dans des DPBS 1X contenant du calcium et du magnésium.
      3. Ajouter 500 μL de solution de collagène I fluorescente ou non fluorescente parCouvre-lit dans une plaque de culture cellulaire à 24 puits.
      4. Incuber pendant 4 h à 37 ° C pour la polymérisation du collagène I.
      5. Après l'incubation, éliminer l'excès de collagène I en inclinant la plaque et en pipetant sur le côté du puits (pas directement sur la lamelle) pour éviter d'endommager la matrice.
         REMARQUE: cette matrice ne peut pas être stockée. Semer les cellules immédiatement après avoir éliminé l'excès de collagène I.

2. Semis cellulaire, temps de culture et fixation

1. Selon le type de cellule, préparer les cellules dans le milieu de culture approprié et ajouter des cellules pour un volume final de 500 μl par puits.
2. Pour caractériser la capacité d'une lignée cellulaire à former des invadosomes linéaires et à dégrader la matrice, plaque les cellules pendant 4 h, 12 h et 24 h sur la matrice de collagène I pour déterminer la cinétique de la formation d'invadosome linéaire et l'activité de dégradation associée.
   NOTE: Le tableau 1 contient des exemples de lignées cellulairesTesté en laboratoire.

   Ligne cellulaire	Nombre de cellules par lamelle	Temps de contact avec la matrice pour quantification linéaire d'invadosome	Temps de contact avec la matrice pour la quantification de l'activité de dégradation de l'invadosome linéaire
   MDA MB 231	40 000	4 h	12 h
   HUH7	40 000	12 h	24 h
   HEP 3B	40 000	12 h	24 h
   SNU 398	40 000	12 h	24 h
   NIH 3T3 src	30 000	4 h	12 h
   A431	50 000	6 h	24 h
   A549	40 000	12 h	24 h &N ° 160;
   BRUT	40 000	12 h	12 h
   PAE	40 000	12 h	12 h

   Tableau 1: Relevage des cellules et temps d'incubation. Ce tableau présente une liste non exhaustive de lignées cellulaires utilisées pour étudier les invadosomes linéaires. Il indique le nombre de cellules à semer sur la matrice, le temps nécessaire pour observer les invadosomes linéaires et le temps nécessaire pour observer la dégradation associée de la matrice. Les invadosomes linéaires ont une courte durée de vie. Pour pouvoir observer des invadosomes linéaires dans le nombre maximal de cellules, les cellules doivent être en contact avec la matrice de collagène I pendant une courte période de temps. D'autre part, pour pouvoir visualiser la dégradation de la gélatine rapportée, les cellules doivent être en contact avec la matrice de collagène I pendant une période plus longue que celles énumérées ci-dessus.
3. Après l'élimination du milieu de culture cellulaire,Réparer les lamelles pendant 10 min dans 500 μL de paraformaldéhyde à 4% dans 1X PBS.
4. Laver deux fois avec 1x PBS.
5. Conserver à 4 ° C, protégé de la lumière.

3. Immunofluorescence

1. Perméabiliser les cellules pendant 10 min avec une solution fraîchement préparée De 0,2% de Triton X-100 en 1x PBS. Ne réutilisez pas cette solution.
2. Laver les lamelles deux fois avec 1x PBS.
3. Placez un parafil (20 cm x 15 cm) sur le banc.
4. Diluer l'anticorps primaire dans 4% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans 1x PBS, comme décrit dans la table des matériaux .
5. Aliquoter 50 μL de gouttelettes de solution d'anticorps primaire dans une ligne, chacune espacée d'environ 1 cm l'une de l'autre.
6. Placez chaque lamelle sur une gouttelette.
7. Incuber pendant 40 min à température ambiante, protégé de la lumière.
8. Après la période d'incubation, laver deux fois avec 1x PBS.
9. Diluer l'anticorps secondaire, la phalloidine et le colorant Hoechst dans 4% de BSA en 1xPBS.
10. Aliquoter 50 μL de gouttelettes du mélange, chacune espacée d'environ 1 cm au-dessous de la première ligne de lamelles, comme fait précédemment.
11. Placez chaque lamelle sur une gouttelette.
12. Incuber pendant 30 min à température ambiante, protégé de la lumière.
13. Après incubation, laver deux fois avec 1x PBS.
14. Laver une fois avec de l'eau distillée pour éliminer les sels.
15. Monter les lamelles sur une glissière en verre avec un support de polymérisation.
16. Laissez les lamelles sécher pendant la nuit à température ambiante, protégées de la lumière, avant la microscopie.

4. Quantifications

Figure 2: Quantification linéaire d'invadosome. La macro nécessite des images confocales de taches F-acttin et Tks5 (format: 1 024 x 1 024). ( A ) D'abord, ouvrez l'image F-acttin et créez un masque. ( B ) Ensuite, ouvrezL'image Tks5 et le seuil. Appliquer la macro. ( C ) Les résultats analysés apparaîtront dans deux tableaux. Le nombre d'invadosomes linéaires par cellule et d'autres informations, comme la zone de pourcentage utilisée par les invadosomes linéaires dans la cellule, sera dans le tableau récapitulatif. La taille de chaque invadosome linéaire sera dans le tableau des résultats. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Pourcentage de cellules formant des invadosomes linéaires
   1. Comptez les cellules formant des invadosomes linéaires, environ 100 cellules par lamelle (utilisez des triplicats techniques). Quantifier au moins 300 cellules par n, avec n = 3.
   2. Calculer le pourcentage de cellules formant des invadosomes linéaires en prenant la moyenne de trois expériences indépendantes, ce qui entraîne 900 cellules quantifiées.
2. Taille et nombre d'invadosome linéaire par cellule
   NOTE: Utilisez un microscope confocal pour prendre des images séquentielles des taches F-acttin et Tks5. La macro est adaptée à un format d'image de 1024 x 1024.
   1. Utilisez ImageJ avec la macro supplémentaire.
3. Dégradation par cellule
   1. Utilisez trois lamelles pour chaque condition.
   2. Prenez 30 images par lamelle de glaucure fluorescente et de noyaux teints par Hoechst.
   3. Utilisez le logiciel ImageJ comme décrit dans Martin KH et al. ⁹ .

5. Ensemble d'invasion de collagène 3D

Figure 3: schéma d'essai d'invasion. Résumé du protocole d'essai d'invasion. Le collagène I est réticulé avec du colorant ester succinimidylique et polymérisé pendant 1 h à 37 ° C. Les cellules sont ajoutées dans un milieu sans sérum au-dessus de la prise de collagène I. L'insert est placé en moyenne wiTh 10% FBS. Les bouchons de collagène I sont fixés 1 heure après l'ensemencement cellulaire dans le contrôle et 3 jours après l'ensemencement cellulaire dans l'état expérimental pour déterminer la capacité d'invasion des cellules. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Préparation de la prise de collagène I
   1. Faire un temps de 4 h, 12 h, 24 h, 48 h et 72 h pour la première expérience pour déterminer la cinétique d'invasion dans le gel selon le type de cellule. Pour chaque expérience, ajoutez un point de temps de 1 heure comme point de référence lorsque aucune invasion ne se produit.
   2. Préparez la solution de collagène I sur de la glace sous un capuchon stérile d'écoulement laminaire. Préparez 500 μL de solution pour 3 inserts de chambre Boyden.
   3. Aspirer 1 mg de collagène commercial de queue de rat I pour préparer une solution avec une concentration finale de 2 mg / ml de collagène I.
   4. Ajouter 5-carboxy x ester succinimidylique de Rhodamine àUne concentration finale de 1 μg / mL, calculée pour le volume final de la solution de collagène I (dans ce cas, 500 μL).
   5. Mélanger bien et incuber pendant 5 minutes sur de la glace sous le capot de flux laminaire stérile, protégé de la lumière.
   6. Ajouter 50 μl de PBS filtré et filtré 10X et 6,25 μl d'hydroxyde de sodium 1 M glacé (NaOH) glacé.
   7. Ajouter de l'eau stérile selon la formule 443.75 - x μL de collagène I.
   8. Ajouter 100 μL de solution par insert de chambre Boyden.
   9. Incuber pendant 1 h à 37 ° C pour permettre la polymérisation.
   10. Ajouter un milieu de culture cellulaire enrichi en sérum bovin fœtal (FBS) dans de nouveaux puits; Placez les inserts dans ces puits.
   11. Graine 30 000 cellules sur le collagène I enfichant un milieu sans FBS.
   12. Après la culture des cellules à 37 ° C, réparer le bouchon de collagène I pendant 30 minutes dans du paraformaldéhyde à 4% dans 1x PBS.
   13. Immunofluorescence complète comme à l'étape 3, à l'exception des étapes suivantes: permeabiliZe avec 0,2% de Triton X-100 dans 1x PBS pendant 30 min, pas 10 min; Incuber avec des solutions d'anticorps primaires et secondaires pendant 1,5 h chacun, au lieu de 40 min et 30 min, respectivement. Tache pour la F-actine ou les noyaux pour localiser les cellules.
   14. Après immunofluorescence, utiliser un scalpel pour couper autour de la membrane de l'insert et transférer soigneusement le collagène I dans un plat à fond de verre. Assurez-vous que le haut de la fiche de collagène I est en contact avec le verre. Gardez la membrane d'insertion attachée au fond de la fiche de collagène I afin de maintenir l'intégrité de la fiche.
       REMARQUE: La fiche de collagène I reste intacte dans le plat en verre. La profondeur entre le fond de verre et le plastique entourant le fond de verre est équivalente à l'épaisseur de la fiche.
   15. Placez une lamelle sur la prise de collagène I et montez avec un support de polymérisation pour éviter que la bougie ne se dessèche.
   16. Utilisez un microscope confocal inversé pour l'image de la prise de collagène I; le meilleur deLa fiche est en contact avec le fond de verre du plat.
       1. Acquérir une pile z du haut au bas de la prise de collagène I pour visualiser l'invasion cellulaire. Déterminez l'épaisseur de la pile z en examinant à quel point les cellules envahissent le champ d'imagerie. Effectuez des acquisitions avec un objectif huile 40X dans un format 512 x 512 avec une taille z de 0,25 μm.
          REMARQUE: Pour référence, la pile z moyenne pour les cellules MDA-MB-231 3 jours après l'ensemencement est de 30 μm.

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Résultats

En utilisant une combinaison de deux types de matrices, de gélatine et de collagène de type I ( figures 1 et 4 ), nous avons mis en évidence un nouveau type d'invadosome, connu sous le nom d'invadosomes linéaires. L'étiquetage de ces matrices permet d'observer la formation linéaire d'invadosome le long des fibres de collagène I et de leurs capacités de dégradation ( figure 5 ). Le nombre de structures invasiv...

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Discussion

Classiquement, les invadosomes sont étudiés in vitro sans égard au microenvironnement et à la matrice sur laquelle les cellules sont plaquées. Plusieurs types de matrices sont actuellement utilisés, y compris la gélatine, la fibronectine, la vitronectine ou le collagène fibrillaire haute densité (HDFC) ^{7 , 11} ; Cependant, ce ne sont souvent pas représentatifs du microenvironnement dans lequel les cellules résident et ne sont pas pertinentes s...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin solution	Sigma	G1393	Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate	Molecular probe life technologies	G13186	5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
Microscope cover glasses	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12mm No.1
2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4	Electron microscopy science	15960	Dilute at 0.5 % in sterile water
1x PBS pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	Use this PBS in all steps before fixation
Collagen I Rat tail	Corning	354236
5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester	Life technologies	C-6125
DPBS 1x + calcium + magnesium	Gibco by life technologies	14040-091
Paraformaldehyde 16% solution	Electron microscopy science	15710	Dilute at 4% in 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x PBS buffer pH 7.4	Ambion	AM9625	Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
Tks5 antibody	Santa Cruz	sc-30122	Invadosome markers Dilution : 1/100
Cortactin 4F11 antibody	Millipore	5180	Invadosome markers Dilution :1/100
DDR1 antibody	Cell signaling	5583	Linear invadosome receptor
Dilution :1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrillary actin marker Dilution :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Nucleus marker Dilution :1/200
Secondary antibodies FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H or FP-647H
Albumin from bovine serum	Sigma	A2153	Dilute at 4% in 1X PBS
Fluoromount G mounting medium	Interchim	FP 483331
ImageJ software	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Cell culture insert	Corning	353097	8.0µm pore size / 24 wells
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	221465