2D и 3D-матрицы для изучения формирования и активности линейных инвадосом

Резюме

В этом протоколе описывается, как подготовить двумерную смешанную матрицу, состоящую из желатина и коллагена I, и пробку 3D-коллагена I для исследования линейных интрадосом. Эти протоколы позволяют изучать формирование линейной инвадосомы, активность деградации матриц и возможности инвазии первичных клеток и линий раковых клеток.

Аннотация

Клеточная адгезия, миграция и инвазия участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Например, во время образования метастазов опухолевые клетки должны пересекать анатомические барьеры, чтобы вторгнуться и мигрировать через окружающую ткань, чтобы достичь кровеносных или лимфатических сосудов. Для этого требуется взаимодействие между клетками и внеклеточным матрицей (ECM). На клеточном уровне многие клетки, включая большинство раковых клеток, способны образовывать инвадусомы, которые представляют собой структуры на основе F-актина, способные разрушать ECM. Invadosomes - это протрузивные актиновые структуры, которые рекрутируют и активируют матриксные металлопротеиназы (MMP). Молекулярный состав, плотность, организация и жесткость ECM имеют решающее значение для регулирования образования и активации инвадосом. В пробирке анализ желатина является стандартным анализом, используемым для наблюдения и количественного определения активности деградации инвадосом. Однако желатин, являющийся денатурированным коллагеном I, не является физиологической матрицей element. Был разработан новый анализ с использованием коллагеновых фибрилл I типа, который показал, что эта физиологическая матрица является мощным индуктором интрадосом. Инвадосомы, которые образуются вдоль коллагеновых фибрилл, известны как линейные инвадосомы из-за их линейной организации на волокнах. Более того, молекулярный анализ линейных интрадосом показал, что рецептор домена дискоидина 1 (DDR1) является рецептором, участвующим в их образовании. Эти данные наглядно демонстрируют важность использования физиологически релевантной матрицы для понимания сложных взаимодействий между клетками и ECM.

Введение

Ремоделирование внеклеточной матрицы (ECM) происходит во время физиологических и патологических процессов, таких как ангиогенез и инвазия опухолевых клеток. В физиологических условиях многие типы клеток, в основном из гематопоэтической линии, способны деградировать элементы ECM. Например, макрофаги способны пересекать анатомические барьеры для достижения тканей, а остеокласты разрушают костный матрикс для обеспечения гомеостаза кальция. Более глобально все матрицы в организме восстанавливаются, сохраняя свои физические и химические свойства. В раковых тканях состав микроокружности опухоли изменяется. Например, при раке груди и легкого коллаген I типа сверхэкспрессируется и накапливается вокруг опухоли. Более того, это накопление связано с повышенным риском развития метастазов ^{1 , 2} . Раковые метастазы зависят от способности раковых клеток разрушать ECM и вторгаться в смежные ткани.

Инвазивная активность клеток объясняется специализированными актино-богатыми структурами, известными как интрадосомы. Этот термин включает подзомы и инвадоподии, которые присутствуют, соответственно, в нормальных и раковых клетках ( например, макрофагах, эндотелиальных клетках и раковых клетках, таких как клеточная линия рака молочной железы MDA-MB-231). In vitro , интрадосомы могут организовываться в разные формы: точки, агрегаты или розетки ³ . Классически интрадосомы состоят из ядра F-актина, содержащего несколько белков, таких как белок Taff5 и кортатин, окруженный молекулами адгезионной бляшки, такими как интегрины и винкулин ⁴ . Недавно было показано, что Tks5 и RhoGTPase Cdc42 могут быть использованы как минимальная молекулярная сигнатура для функциональных инвадосом ⁵ . Эти структуры способны разрушать ECM посредством рекрутирования и активации специфических белков металлопротеазы, таких как MT1-MMP и MMP-2 ⁶, В предыдущем исследовании мы сообщали, что взаимодействие между фибриллами коллагена типа I и рецептором домена discoidin 1 (DDR1), специфическим рецептором фибрилл коллагена I типа, приводит к образованию нового класса инвадосом, называемых линейными инвадосомами. Линейные инвадомости образуются вдоль коллагеновых фибрилл I типа ⁷ . Эти структуры способны разрушать фибриллы коллагена I типа путем набора и активации MT1-MMP / MMP2. Более того, их образование зависит от Tks5 и Cdc42 ⁵ . В пробирке мы продемонстрировали существование линейных интрадосом и вовлечение DDR1 в их формирование и активность ^8, используя различные стратегии, состоящие из комбинации различных матричных элементов, в том числе: i) люминесцентные покрытые желатином покровные стекла, ii) флуоресцентный коллагеновый фибрилл I типа Покрытые покровным покрытием, и iii) вилки с коллагеном типа I. Из-за использования разных матриц мы смогли учиться и характеризоватьсяА также их деградирующей активности ^{7 , 8} .

Наконец, чтобы лучше понять биологию инвазивных клеток, была использована комбинация компонентов ECM в системах 2D и 3D культуры, имитирующих сложность состава микроокружения опухоли. Ниже приведены протоколы покрытия покровных стекол желатином / типом I в системах 2D и 3D культуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ. Перед фиксацией все этапы завершаются в стерильном ламинарном вытяжном шкафу.

1. 2D-матрица

ПРИМЕЧАНИЕ. 2D-матрицы используются для определения процента клеток, образующих инвадусомы, и площади деградации матрицы на ячейку.

Рисунок 1: Протокол. Резюме протокола, используемого для приготовления желатиновых и коллагеновых матриц I. Можно сделать только желатиновую матрицу или смешанную матрицу желатина и коллагена I. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Желатиновая матрица
   ПРИМЕЧАНИЕ. Флуоресцентные желатиновые матрицы используются для количественного определения деградации матрицы, а для флуоресцентного желатина используется для стимуляции адгезии волокон коллагена I. Флуоресцентный желатиновый матРисы также используются для исследований подзомы и инвадоподии (см . Рис. 1 ).
   1. Под стерильным ламинарным вытяжным потоком поместите кусочек парафильма (20 см x 15 см) на рабочую зону и продезинфицируйте его 70% этанолом.
   2. Аликвоту 20 мкл капель 1 мг / мл желатина в линии, расположенную на расстоянии примерно 1 см друг от друга; См . Рисунок 1 для организации капель.
   3. Накройте каждую 20 мкл желатиновой капли стеклянным покровным стеклом (12 мм в диаметре).
   4. Инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре. Если желатин является флуоресцентным, защитите его от света.
   5. Аликвоту 40 мкл капель 0,5% глутарового альдегида в 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в линии, каждый на расстоянии примерно 1 см ниже линии покровных с этапа 1.1.3.
      ОСТОРОЖНО: Глутаральдегид является токсичным фиксатором. Используйте перчатки и не вдыхайте.
   6. Используя драгоценные пинцеты, перенесите каждое покрытое желатином покровное стекло каплей глутаральдегида.
      Обратите вниманиеНормально, что небольшая желатиновая капля остается на парафильме. Не используйте его повторно для другого эксперимента.
   7. Инкубируйте в течение 40 мин при комнатной температуре. Для флуоресцентных покровных, защитите их от света.
   8. Возьмите 24-луночный планшет для культивирования клеток и заполните каждую лунку 500 мкл стерильного 1x PBS. Поместите покровные стекла, желатин вверх, в каждую лунку.
   9. Промыть дважды в 1х PBS в течение 5 минут каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе покровные стекла можно использовать для экспериментов или хранить в 1x PBS при 4 ° C. Нефлуоресцентные покровные стекла можно хранить в течение одной недели, а флуоресцентные покровные стекла можно хранить в течение 48 часов.
2. Фибриллярная матрица коллагена типа I
   ПРИМЕЧАНИЕ. Фибриллярная матрица коллагена типа I используется для изучения линейного образования инвадосом и связанной с этим деградации матрицы. Комбинацию флуоресцентного коллагена I и не флуоресцентных желатиновых покровных используют для колокализации инвазивных маркеров с коллагеновыми волокнами ( например, F-actin iN дальний красный канал, коллаген I в красном канале, Tks5 в зеленом канале и краситель Hoechst для ядерного пятна). С другой стороны, комбинация не флуоресцентного коллагена I с не флуоресцентными желатиновыми покровными стеклами используется для максимизации числа окрашенных инвазивных маркеров ( например, F-актин в дальнем красном канале, кортикат в красном канале, Tks5 in Зеленый канал и краситель Hoechst для ядерного пятна). Наконец, комбинация не флуоресцентного коллагена I с флуоресцентными желатиновыми покровными стеклами используется для количественного определения связанного с желатином деградации ( например, F-актина в дальнем красном канале, Tks5 в красном канале, в зеленом канале и красителя Hoechst Для ядерного пятна) (см. Рис. 1). Хехст-краситель используется для окрашивания ядра, а также проверяет загрязнение микоплазмы, в дополнение к тесту на ПЦР, регулярно проводимому на клеточных линиях.
   1. Флуоресцентный коллаген I
      1. Используйте коммерческий коллаген I, извлеченный из сухожилия крысиного хвоста в 0,02 Н уксусной кислотыд. Изъятие количества коллагена I необходимо для приготовления 500 мкл раствора на покровное стекло при конечной концентрации 0,4 мг / мл коллагена I.
      2. Добавляют 5-карбокси-х-родамин сукцинимидиловый эфир с конечной концентрацией 10 мкг / мл, рассчитанный для конечного объема раствора коллагена I (nx 500 мкл).
      3. Смешайте раствор путем пипетирования вверх и вниз и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
      4. Разбавьте до конечного объема с помощью 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS), содержащего кальций и магний, и используйте непосредственно.
   2. Фибриллярный коллаген I покровное
      1. Используйте не флуоресцентные или флуоресцентные желатиновые покровные стекла, предварительно приготовленные на этапе 1.1.
      2. Подготовьте раствор флуоресцентного или не флуоресцентного коллагена I при конечной концентрации 0,4 мг / мл в 1X DPBS, содержащем кальций и магний.
      3. Добавьте 500 мкл флуоресцентного или не флуоресцентного раствора коллагена I вПокровное стекло в 24-луночном планшете для культивирования клеток.
      4. Инкубируйте в течение 4 ч при 37 ° С для полимеризации коллагена I.
      5. После инкубации удалите избыток коллагена I путем наклона пластины и пипетирования со стороны лунки (не непосредственно на покровное стекло), чтобы не повредить матрицу.
         ПРИМЕЧАНИЕ. Эта матрица не может быть сохранена. Высевают клетки сразу после удаления избытка коллагена I.

2. Посев клеток, время культуры и фиксация

1. В зависимости от типа клетки, подготовьте клетки в соответствующей культуральной среде и добавьте клетки для конечного объема 500 мкл на лунку.
2. Чтобы охарактеризовать способность линии клеток формировать линейные интрадосомы и деградировать матрицу, наклеивают клетки на 4 ч, 12 ч и 24 ч на матрицу коллагена I для определения кинетики формирования линейной инвадосом и связанной с ней деградации.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В таблице 1 приведены примеры клеточных линийИспытаны в лаборатории.

   Клеточная линия	Количество ячеек на покровное стекло	Время контакта с матрицей для количественного определения линейной инвадосомы	Время контакта с матрицей для количественной оценки активности деградации линейной инвазии
   MDA MB 231	40000	4 ч	12 ч.
   HuH7	40000	12 ч.	24 ч
   HEP 3B	40000	12 ч.	24 ч
   SNU 398	40000	12 ч.	24 ч
   NIH 3T3 src	30000	4 ч	12 ч.
   A431	50000	6 часов	24 ч
   A549	40000	12 ч.	24 ч &# 160;
   RAW	40000	12 ч.	12 ч.
   PAE	40000	12 ч.	12 ч.

   Таблица 1: Ссылка на посев клеток и инкубацию. В этой таблице представлен неисчерпывающий список клеточных линий, используемых для исследования линейных интрадосом. Он указывает количество клеток, которые высевают на матрице, время, необходимое для наблюдения линейных инвадусом, и время, необходимое для наблюдения за связанной матричной деградацией. Линейные интрадосомы имеют короткий срок службы. Чтобы иметь возможность наблюдать линейные инвадусомы в максимальном количестве клеток, клетки должны находиться в контакте с матрицей коллагена I в течение короткого периода времени. С другой стороны, чтобы иметь возможность визуализировать сообщаемую деградацию желатина, клетки должны находиться в контакте с матрицей коллагена I в течение более длительного периода времени, чем те, которые перечислены выше.
3. После удаления клеточной культуральной среды,Фиксируйте покровные стекла в течение 10 минут в 500 мкл 4% параформальдегида в 1X PBS.
4. Промыть дважды с помощью 1x PBS.
5. Хранить при температуре 4 ° C, защищенной от света.

3. Иммунофлуоресценция

1. Пермеабилизируйте клетки в течение 10 мин свежеприготовленным раствором 0,2% Triton X-100 в 1x PBS. Не используйте это повторно.
2. Вымойте покровные стекла дважды с помощью 1x PBS.
3. Поместите кусочек парафильма (20 см x 15 см) на скамейку.
4. Разбавляют первичное антитело в 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS, как описано в таблице материалов .
5. Аликвоте 50 мкл капель раствора первичного антитела в линии, каждый из которых расположен примерно на расстоянии 1 см друг от друга.
6. Поместите каждое покровное стекло на каплю.
7. Инкубируйте в течение 40 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
8. После инкубационного периода дважды промывают 1 × PBS.
9. Разбавьте вторичное антитело, фаллоидин и краситель Hoechst в 4% BSA в 1xPBS.
10. Аликвота 50 мкл капель смеси, каждая из которых расположена на расстоянии примерно 1 см ниже первой линии покровных, как это было сделано ранее.
11. Поместите каждое покровное стекло на каплю.
12. Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре, защищенной от света.
13. После инкубации дважды промывают 1 × PBS.
14. Промыть один раз дистиллированной водой для удаления солей.
15. Установите покровные стекла на стеклянный предмет с полимеризационной монтажной средой.
16. Позвольте покровным сухим на ночь при комнатной температуре, защищенном от света, до микроскопии.

4. Количественные оценки

Рисунок 2: Линейная количественная оценка инвадосом. Макрос требует конфокальных изображений окрашивания F-актина и Tks5 (формат: 1024 × 1024). ( A ) Сначала откройте изображение F-actin и сделайте маску. ( B ) Затем, откройтеИзображение Tks5 и пороговое значение. Примените макрос. ( C ) Анализируемые результаты появятся в двух таблицах. Количество линейных инвадомоз на ячейку и другая информация, такая как процентная область, используемая линейными инвадомами в ячейке, будет представлена ​​в Сводной таблице. Размер каждой линейной инвадусомы будет в таблице «Результаты». Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Процент клеток, образующих линейные инвадосомы
   1. Подсчитайте клетки, образующие линейные интрадосомы, приблизительно 100 клеток на покровное (используйте технические трипликаты). Количественное определение не менее 300 клеток на n, с n = 3.
   2. Рассчитайте процент клеток, образующих линейные интрадосомы, взяв среднее из трех независимых экспериментов, в результате чего получилось 900 квантованных клеток.
2. Линейный размер и количество интрадосом на ячейку
   ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте конфокальный микроскоп для получения последовательных изображений пятен F-actin и Tks5. Макрос адаптирован к формату изображения 1024 × 1024.
   1. Используйте ImageJ с дополнительным макросом.
3. Деградация на ячейку
   1. Используйте три покровных стекла для каждого состояния.
   2. Возьмите 30 изображений на покровное стекло флуоресцентного желатина и ядра, окрашенные Hoechst.
   3. Используйте программное обеспечение ImageJ, как описано в Martin KH et al. ⁹ .

5. Анализ 3D-коллагеновых инвазий

Рисунок 3: Схема анализа вторжения. Резюме протокола анализа вторжения. Коллаген I сшивают с сукцинимидиловым сложным эфиром и полимеризуют в течение 1 часа при 37 ° С. Клетки добавляют в среду, не содержащую сыворотки, поверх вилки коллагена I. Вставка помещается в среду wiГо 10% FBS. Замки коллагена I фиксируются через 1 час после посева клеток в контроле и через 3 дня после посева клеток в экспериментальном состоянии для определения способности к всасыванию клеток. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Подготовка коллагена I
   1. Проведите курс времени 4 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч для первого эксперимента, чтобы определить кинетику инвазии в гель в соответствии с типом клетки. Для каждого эксперимента добавьте 1-часовую точку времени в качестве опорного момента времени, когда не происходит вторжения.
   2. Подготовьте раствор коллагена I на льду под стерильным ламинарным капотом. Подготовьте 500 мкл раствора для 3 вкладышей камеры Boyden.
   3. Аспирируйте 1 мг коммерческого коллагена I крысиного хвоста I для приготовления раствора с конечной концентрацией 2 мг / мл коллагена I.
   4. Добавить 5-карбокси-х-родамин-сукцинимидиловый эфир приКонечная концентрация 1 мкг / мл, рассчитанная для конечного объема раствора коллагена I (в данном случае 500 мкл).
   5. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 мин на льду под стерильным ламинарным вытяжным потолком, защищенным от света.
   6. Добавить 50 мкл ледяного, фильтрованного 10X PBS и 6,25 мкл ледяного 1 М гидроксида натрия (NaOH).
   7. Добавить стерильную воду по формуле 443,75 - х мкл коллагена I.
   8. Добавьте 100 мкл раствора на вставку камеры Boyden.
   9. Инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C, чтобы обеспечить полимеризацию.
   10. Добавить клеточную культуральную среду, обогащенную фетальной бычьей сывороткой (FBS) в новые лунки; Помещают в эти колодцы.
   11. Семя 30 000 клеток на вершине коллагена I подключают к среде, свободной от FBS.
   12. После культивирования клеток при 37 ° C зафиксируйте пробку коллагена I в течение 30 минут в 4% параформальдегиде в 1x PBS.
   13. Полная иммунофлюоресценция, как на этапе 3, за исключением следующих этапов: пермеабилиZe с 0,2% Triton X-100 в 1x PBS в течение 30 мин, а не 10 мин; Инкубируют с первичными и вторичными растворами антител в течение 1,5 ч каждый, а не через 40 мин и 30 мин соответственно. Пятно для F-актина или ядер для локализации клеток.
   14. После иммунофлюоресценции используйте скальпель для обрезания мембраны вставки и осторожно переносите коллагеновую пробку I на тарелку со стеклянным дном. Убедитесь, что верхняя часть штекера коллагена I находится в контакте со стеклом. Держите вставную мембрану, прикрепленную к нижней части штекера коллагена I, чтобы поддерживать целостность вилки.
       ПРИМЕЧАНИЕ. Коллагеновая вилка остается неповрежденной в тарелке со стеклянным дном. Глубина между дном стекла и пластиком, окружающим стекло, эквивалентна толщине вилки.
   15. Поместите покровное стекло на пробку коллагена I и смонтируйте с помощью полимеризующей монтажной среды, чтобы предотвратить высыхание вилки.
   16. Используйте инвертированный конфокальный микроскоп для изображения пробки коллагена I; вершинаВилка находится в контакте со стеклянным дном блюда.
       1. Приобретайте z-стопку сверху вниз коллагена I, чтобы визуализировать вторжение клеток. Определите толщину z-стека, исследуя, насколько глубоко клетки вторгаются в область визуализации. Выполняйте приобретения с масляным объективом 40X в формате 512 x 512 с шагом z-шаг 0,25 мкм.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Для справки средний z-стек для клеток MDA-MB-231 через 3 дня после посева составляет 30 мкм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя комбинацию двух типов матриц, желатина и коллагена I типа ( рис. 1 и 4 ), мы выделили новый тип инвадомоз, известный как линейные интрадосомы. Маркировка этих матриц позволяет наблюдать формирование линейной инвадосомы вдоль волокон коллаген?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Классически интрадосомы изучаются in vitro без учета микроокружения и матрицы, на которой покрыты клетки. В настоящее время используются несколько типов матриц, включая желатин, фибронектин, витронектин или фибриллярный коллаген высокой плотности (HDFC) ^{7 , ...}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin solution	Sigma	G1393	Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate	Molecular probe life technologies	G13186	5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
Microscope cover glasses	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12mm No.1
2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4	Electron microscopy science	15960	Dilute at 0.5 % in sterile water
1x PBS pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	Use this PBS in all steps before fixation
Collagen I Rat tail	Corning	354236
5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester	Life technologies	C-6125
DPBS 1x + calcium + magnesium	Gibco by life technologies	14040-091
Paraformaldehyde 16% solution	Electron microscopy science	15710	Dilute at 4% in 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x PBS buffer pH 7.4	Ambion	AM9625	Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
Tks5 antibody	Santa Cruz	sc-30122	Invadosome markers Dilution : 1/100
Cortactin 4F11 antibody	Millipore	5180	Invadosome markers Dilution :1/100
DDR1 antibody	Cell signaling	5583	Linear invadosome receptor
Dilution :1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrillary actin marker Dilution :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Nucleus marker Dilution :1/200
Secondary antibodies FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H or FP-647H
Albumin from bovine serum	Sigma	A2153	Dilute at 4% in 1X PBS
Fluoromount G mounting medium	Interchim	FP 483331
ImageJ software	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Cell culture insert	Corning	353097	8.0µm pore size / 24 wells
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	221465