線状インベーゾームの形成および活性を研究するための2Dおよび3Dマトリックス

要約

このプロトコルは、ゼラチンとコラーゲンIからなる2D混合マトリックスの調製法と、線状のinvadosomesを研究するための3DコラーゲンIプラグの作成方法を記載しています。これらのプロトコールは、線状のインベルソーム形成、マトリックス分解活性、および初代細胞および癌細胞系の浸潤能力の研究を可能にする。

要約

細胞接着、遊走および浸潤は、多くの生理学的および病理学的過程に関与する。例えば、転移形成中、腫瘍細胞は、血液またはリンパ管に到達するために、侵入して周囲組織を通って遊走するために解剖学的障壁を横切らなければならない。これには、細胞と細胞外マトリックス（ECM）との相互作用が必要である。細胞レベルでは、大部分の癌細胞を含む多くの細胞が、インビトロソームを形成することができ、これはECMを分解するF-アクチンベースの構造である。インバドソームは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）を動員して活性化する突出アクチン構造である。 ECMの分子組成、密度、組織、および剛性は、インベーソーム形成および活性化の制御において重要である。 インビトロで、ゼラチンアッセイは、インベーゾーム分解活性を観察および定量するために使用される標準アッセイである。しかし、変性コラーゲンIであるゼラチンは生理学的マトリックスではない礼儀。 I型コラーゲン線維を用いた新規アッセイを開発し、この生理学的マトリックスがインバドソームの強力な誘導物質であることを実証するために使用した。コラーゲン線維に沿って形成するインベードソームは線状のインバソソームとして知られている。さらに、線状invadosomesの分子分析は、discoidinドメイン受容体1（DDR1）がそれらの形成に関与する受容体であることを示した。これらのデータは、細胞とECMとの間の複雑な相互作用を理解するために、生理学的に関連するマトリックスを使用することの重要性を明確に示している。

概要

細胞外マトリックス（ECM）リモデリングは、血管新生および腫瘍細胞浸潤などの生理学的および病理学的プロセス中に生じる。生理学的状態では、主に造血系由来の多くの細胞型がECM要素を分解することができる。例えば、マクロファージは解剖学的障壁を越えて組織に到達することができ、破骨細胞は骨のマトリックスを分解してカルシウムのホメオスタシスを確実にする。より包括的には、体内のすべてのマトリックスが物理的および化学的特性を維持するために更新されます。癌組織では、腫瘍微小環境組成が変化する。例えば、乳癌および肺癌において、I型コラーゲンは過剰発現され、腫瘍の周囲に蓄積する。さらに、この蓄積は、転移の発生リスクの増加に関連している^1,2 。癌転移は、癌細胞がECMを分解して隣接組織に侵入する能力に依存する。

ザinvadosomesとして知られている特殊なアクチンに富む構造に起因する。この用語は、正常細胞および癌細胞（ 例えば、マクロファージ、内皮細胞、およびMDA-MB-231乳癌細胞株のような癌細胞）にそれぞれ存在するポドソームおよび浸食虫を含む。 インビトロでは、invadosomesは異なる形に構成することができます：点、凝集体、またはロゼット³ 。古典的には、インバソソームは、足場タンパク質Tks5およびコータクチンなどのいくつかのタンパク質を含むF-アクチンコアで構成され、インテグリンおよびビンクリン⁴などの接着プラーク分子で囲まれています。最近、Tks5およびRhoGTPase Cdc42が機能的インベードソーム^5の最小分子サインとして使用できることが示された⁵ 。これらの構造は、MT1-MMPおよびMMP-2 ⁶などの特異的メタロプロテアーゼタンパク質の補充および活性化を介してECMを分解することができる。以前の研究では、I型コラーゲン原線維とI型コラーゲン原線維の特異的受容体であるdiscoidin domain receptor 1（DDR1）との相互作用が、線状のinvadosomesと呼ばれる新しいクラスのinvadosomesの形成につながることを報告しました。線状のinvadosomesは、I型コラーゲン線維⁷に沿って形成される。これらの構造は、MT1-MMP / MMP2の補充および活性化を介してI型コラーゲン線維を分解することができる。さらに、それらの形成は、Tks5およびCdc42 ⁵に依存する。 インビトロで 、本発明者らは、i）蛍光ゼラチン被覆カバースリップ、ii）蛍光I型コラーゲンフィブリルを含む様々なマトリックス要素の組み合わせからなる異なるストラテジーを用いて、線状インベドソームの存在およびその形成および活性⁸におけるDDR1の関与を実証したコーティングされたカバースリップ、およびiii）3DタイプIコラーゲンプラグ。異なるマトリックスの使用のために、我々は研究することができ、キャラクター線形インベードームの形成とその分解活性を調べる7,8。

最後に、侵襲性細胞の生物学をよりよく理解するために、腫瘍微小環境組成の複雑さを模倣する2Dおよび3D培養系のECM成分の組み合わせを使用した。以下は、2Dおよび3D培養系において、カバースリップをゼラチン/ I型コラーゲンでコーティングするためのプロトコールである。

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プロトコル

注：固定する前に、すべてのステップは無菌の層流フードで完了します。

1. 2D行列

注：2次元マトリックスは、インビドソームを形成する細胞のパーセンテージおよび細胞あたりのマトリックス分解面積を決定するために使用される。

図1：プロトコル。ゼラチンおよびコラーゲンIマトリックスを調製するために使用されたプロトコルの要約。ゼラチンマトリックスのみまたはゼラチンおよびコラーゲンI混合マトリックスを作製することが可能である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

1. ゼラチンマトリックス
   注：蛍光ゼラチンマトリックスはマトリックス分解を定量するために使用され、非蛍光ゼラチンはコラーゲンI繊維の接着を促進するために使用されます。蛍光ゼラチンマットまた、ポスドームや侵入馬の研究にも使用されています （ 図1参照）。
   1. 滅菌済みの層流フードの下で、作業領域にパラフィルム（20 cm x 15 cm）を置き、70％エタノールで消毒します。
   2. 分注した約1cm間隔のラインに1mg / mLゼラチンのアリコート20μL液滴;液滴構成については図1を参照してください。
   3. 各20μLのゼラチン液滴をオートクレーブしたガラスカバースリップ（直径12mm）で覆う。
   4. 室温で20分間インキュベートする。ゼラチンが蛍光性の場合は、光から保護してください。
   5. ステップ1.1.3からのカバースリップラインの約1cm下にそれぞれ間隔をおいて、1xリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の0.5％グルタルアルデヒドの40μLの小滴をラインに分けた。
      注意：グルタルアルデヒドは毒性の固定剤です。手袋を着用し、吸入しないこと。
   6. 宝飾鉗子を使用して、各ゼラチン被覆カバースリップをグルタルアルデヒド液滴に移す。
      注：それはParafilmに小さなゼラチン液滴が残っていることは正常です。これを別の実験に再使用しないでください。
   7. 室温で40分間インキュベートする。蛍光カバースリップの場合は、光から保護してください。
   8. 24ウェル細胞培養プレートを取り、500μLの滅菌1×PBSで各ウェルを満たす。各ウェルにカバースリップ（ゼラチン側を上にして）を置く。
   9. それぞれ5分間、1×PBSで2回洗浄する。
      注：このステップでは、カバースリップを実験に使用するか、4℃で1×PBSに保存することができます。非蛍光カバーガラスは1週間保存することができ、蛍光カバースリップは48時間保存することができます。
2. 線維性コラーゲンI型マトリックス
   注：線維状コラーゲンI型マトリックスは、線状のインベルソーム形成および関連するマトリックス分解を研究するために使用される。蛍光コラーゲンIおよび非蛍光ゼラチンカバーガラスの組み合わせを使用して、インベーゾームマーカーをコラーゲン繊維（ 例えば、 F-アクチンi遠赤色チャンネル、赤チャンネルのコラーゲンI、緑チャンネルのTks5、核染色のためのHoechst染料）。他方、非蛍光性コラーゲンIと非蛍光性ゼラチンカバースリップとの組み合わせは、染色されたインベーゾームマーカーの数を最大にするために使用される（ 例えば遠赤色チャネルのF-アクチン、赤色チャネルのコルタクチン、緑色チャネル、および核染色のためのHoechst色素）。最後に、非蛍光コラーゲンIと蛍光ゼラチンカバースリップとの組み合わせを使用して、ゼラチン関連分解（ 例えば遠赤色チャネルのF-アクチン、赤色チャネルのTks5、緑色チャネル、およびHoechst色素核染色の場合）（図1参照）。 Hoechst色素は核を染色するために使用され、使用された細胞系統で定期的に行われるPCR検査に加えて、マイコプラズマ汚染もチェックする。
   1. 蛍光コラーゲンI
      1. ラット尾腱から抽出した市販のコラーゲンIを0.02Nの酢酸菌d。 0.4mg / mLのコラーゲンIの最終濃度で、カバースリップ当たり500μLの溶液を調製するのに必要なコラーゲンIの量を回収する。
      2. コラーゲンI溶液（nx500μL）の最終容量について計算して、10μg/ mLの最終濃度で5-カルボキシxローダミンスクシンイミジルエステルを添加する。
      3. 上下にピペッティングすることにより溶液を混合し、室温から5分間インキュベートし、光から保護する。
      4. カルシウムとマグネシウムを含む1倍ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で最終容量まで希釈し、直接使用する。
   2. 線維性コラーゲンI coverslip
      1. ステップ1.1で予め調製した非蛍光性または蛍光性のゼラチンカバースリップを使用する。
      2. カルシウムとマグネシウムを含む1X DPBSに0.4 mg / mLの最終濃度の蛍光または非蛍光コラーゲンIの溶液を調製する。
      3. 500μLの蛍光性または非蛍光性のコラーゲンI溶液をそれぞれ添加する24ウェル細胞培養プレート中のカバーガラス。
      4. コラーゲンIの重合のために37℃で4時間インキュベートする。
      5. インキュベーション後、余分なコラーゲンIをプレートを傾斜させて除去し、マトリックスの損傷を避けるためにウェルの側面にピペットで（カバースリップ上に直接ではなく）ピペットで移す。
         注：この行列は保存できません。過剰なコラーゲンIを除去した直後に細胞を播種する。

2.細胞の播種、培養時間および固定

1. 細胞の種類に応じて、適切な培地で細胞を調製し、ウェル当たり500μLの最終容量のために細胞を加える。
2. 線状のinvadosomesを形成し、マトリックスを分解する細胞株の能力を特徴付けるために、線状のinvadosome形成および関連する分解活性の動力学を決定するために、コラーゲンIマトリックス上に4時間、12時間および24時間細胞をプレーティングする。
   注： 表1は、細胞株実験室で試験した。

   細胞株	カバースリップあたりの細胞数	線状インベーゾーム定量化のためのマトリックスとの接触時間	線状のインベルソーム分解活性の定量のためのマトリックスとの接触時間
   MDA MB 231	40,000	4時間	12時間
   HUH7	40,000	12時間	24時間
   HEP 3B	40,000	12時間	24時間
   SNU 398	40,000	12時間	24時間
   NIH 3T3 src	30,000	4時間	12時間
   A431	50,000	6時間	24時間
   A549	40,000	12時間	24時間後＃160;
   生	40,000	12時間	12時間
   PAE	40,000	12時間	12時間

   表1：細胞播種およびインキュベーション時間参照。この表は、線状のinvadosomeを研究するために使用される細胞系の非網羅的なリストを提示する。これは、マトリックス上にシードする細胞の数、線状のinvadosomeを観察するのに必要な時間、および関連するマトリックス分解を観察するのに必要な時間を示す。線状のインベルソームは寿命が短い。最大数の細胞において線状のインベルソームを観察するためには、細胞はコラーゲンIマトリックスと短時間接触しなければならない。一方、報告されているゼラチン分解を可視化するためには、細胞はコラーゲンIマトリックスと上記のリストより長い時間接触しなければならない。
3. 細胞培養培地を除去した後、1X PBS中4％パラホルムアルデヒド500μL中でカバースリップを10分間固定する。
4. 1×PBSで2回洗浄する。
5. 4℃で保存し、光から保護する。

3.免疫蛍光

1. 新たに調製した溶液で細胞を10分間浸透させる 1×PBS中の0.2％Triton X-100を含む。このソリューションを再利用しないでください。
2. カバースリップを1×PBSで2回洗浄する。
3. パラフィン（20cm×15cm）をベンチに置きます。
4. 材料表に記載されているように、1×PBS中の4％ウシ血清アルブミン（BSA）中で一次抗体を希釈する。
5. 各1cm間隔で1次抗体溶液50μLを1列に分注する。
6. 各カバースリップを液滴の上に置きます。
7. 光から保護された室温で40分間インキュベートする。
8. インキュベーション期間の後、1×PBSで2回洗浄する。
9. 二次抗体、ファロイジン、およびHoechst色素を4％BSAで1倍に希釈するPBS。
10. 各50μLの小滴を、前に行ったように、カバースリップの第1のラインよりも約1cm下方に配置する。
11. 各カバースリップを液滴の上に置きます。
12. 光から保護された室温で30分間インキュベートする。
13. インキュベーション後、1×PBSで2回洗浄する。
14. 蒸留水で一度洗浄して塩を除去する。
15. カバーガラスをスライドガラスに載せ、重合媒体をマウントします。
16. カバースリップを室温で一晩乾燥させ、顕微鏡から観察する前に光から保護する。

4.定量

図2：線形インベーゾームの定量。このマクロは、FアクチンおよびTks5染色（フォーマット：1,024×1,024）の共焦点画像を必要とする。 （ A ）まず、F-actin画像を開き、マスクを作ってください。 （ B ）次に、openTks5の画像とそれを閾値にします。マクロを適用します。 （ C ）分析結果は2つの表に現れる。細胞あたりの線状のインベルソームの数および細胞内の線状のインベルソームによって使用されるパーセンテージなどの他の情報は、要約表に表示されます。各線形インベーゾームのサイズはResultsテーブルに表示されます。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

1. 線状のinvadosomesを形成する細胞のパーセンテージ
   1. 線状のinvadosomesを形成している細胞を数え、カバースリップ当たり約100個の細胞（テクニカルトリプリケートを使用）。 n = 3でn当たり300個以上の細胞を定量する。
   2. 3つの独立した実験の平均を取ることにより、線状のinvadosomeを形成する細胞のパーセンテージを計算し、900個の定量化された細胞を生じる。
2. 線状のinvadosomeのサイズと細胞あたりの数
   注：FアクチンおよびTks5染色の連続画像を撮影するには、共焦点顕微鏡を使用します。マクロは1,024×1,024のイメージフォーマットに適合しています。
   1. 補完マクロと共にImageJを使用してください。
3. 細胞あたりの分解
   1. 条件ごとに3枚のカバースリップを使用してください。
   2. 蛍光ゼラチンおよびヘキスト染色された核のカバースリップ当たり30枚の画像を取る。
   3. Martin KH らに記載されているように、ImageJソフトウェアを使用する。 ⁹ 。

3Dコラーゲン侵襲アッセイ

図3：浸潤アッセイスキーム。浸潤アッセイプロトコルの要約。コラーゲンIをスクシンイミジルエステル色素と架橋させ、37℃で1時間重合する。細胞をコラーゲンIプラグの上に無血清培地で加える。インサートは、培地wi10％FBSを含む。コラーゲンIプラグは、コントロールの細胞播種1時間後および細胞播種の3日後に実験条件下で固定して、細胞の侵襲能力を決定する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

1. コラーゲンIプラグの準備
   1. 最初の実験では、細胞の種類に応じてゲルへの侵入の動態を決定するために、4時間、12時間、24時間、48時間、および72時間の時間経過を作成する。各実験について、侵襲が起きていない場合、基準時点として1時間の時点を追加する。
   2. コラーゲンI溶液を滅菌層流フード下で氷上で調製する。 3つのボイデンチャンバーインサート用に500μLの溶液を調製する。
   3. 市販のラット - テイルコラーゲンI 1mgを吸引して、最終濃度が2mg / mLのコラーゲンIの溶液を調製する。
   4. 5-カルボキシxローダミンスクシンイミジルエステルをコラーゲンI溶液（この場合、500μL）の最終体積について計算して、1μg/ mLの最終濃度である。
   5. よく混合し、光から保護された滅菌層流フードの下、氷上で5分間インキュベートする。
   6. 50μLの氷冷濾過した10×PBSおよび6.25μLの氷冷1M水酸化ナトリウム（NaOH）を加える。
   7. 式443.75 - xμLのコラーゲンIに従って滅菌水を加える。
   8. ボイデンチャンバーインサートごとに100μLの溶液を加えます。
   9. 重合を可能にするために37℃で1時間インキュベートする。
   10. ウシ胎児血清（FBS）が豊富な細胞培養培地を新しいウェルに加える。これらのウェルにインサートを入れる。
   11. コラーゲンIの上に種子30,000個の細胞を入れ、FBSフリー培地に入れる。
   12. 37℃で細胞を培養した後、コラーゲンIプラグを1×PBS中4％パラホルムアルデヒド中で30分間固定する。
   13. 次のステップを除いて、ステップ3のように完全な免疫蛍光：透過性1分間のPBS中の0.2％Triton X-100で10分間ではなく30分間、一次および二次抗体溶液とそれぞれ1.5時間、40分および30分ではなくインキュベートする。細胞を局在化させるためにF-アクチンまたは核に染色する。
   14. 免疫蛍光の後、外科用メスを使用してインサートの膜を切断し、コラーゲンIプラグをガラス底の皿に注意深く移す。コラーゲンIプラグの上部がガラスと接触していることを確認します。プラグの完全性を維持するために、インサート膜をコラーゲンIのプラグの底に取り付けたままにしておきます。
       注：コラーゲンIプラグは、ガラス底の皿にそのまま残ります。ガラス底部とガラス底部を取り囲むプラスチックとの間の深さは、プラグの厚さに等しい。
   15. コラーゲンIプラグの上にカバースリップを置き、プラグが乾燥しないように重合媒体を用いてマウントする。
   16. コラーゲンIプラグを画像化するために倒立共焦点顕微鏡を使用する;上のプラグは、皿のガラス底部と接触している。
       1. コラーゲンIプラグの頂部から底部までzスタックを取得し、細胞浸潤を視覚化する。細胞がどの程度深くイメージングフィールドに侵入しているかを調べることによって、zスタックの厚さを決定する。 0.25倍のzステップサイズを有する512×512フォーマットの40倍油対物レンズを用いて取得を実行する。
          注：参考のために、播種3日後のMDA-MB-231細胞の平均z-スタックは30μmである。

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結果

ゼラチンとI型コラーゲンの2種類のマトリックス（ 図1と4 ）の組み合わせを使用して、我々は線状のinvadosomeとして知られる新しいタイプのinvadosomeを強調した。これらのマトリックスの標識は、コラーゲンI繊維に沿った線状のインドソーム形成およびそれらの分解能の観察を可能にする（ 図5 ）。侵入性構造の数は、以前に記載?...

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ディスカッション

古典的には、インベーゾームは、細胞が播種される微小環境およびマトリックスに関係なく、インビトロで研究される 。ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、または高密度原繊維コラーゲン（HDFC）を含むいくつかのタイプのマトリックスが現在使用されている。しかしながら、これらはしばしば、細胞が存在し、生理学的に関連しない微環境を代表するものではな?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin solution	Sigma	G1393	Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml
Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate	Molecular probe life technologies	G13186	5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water
Microscope cover glasses	Marlenfeld GmbH & Co	111520	Ø12mm No.1
2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4	Electron microscopy science	15960	Dilute at 0.5 % in sterile water
1x PBS pH 7.4	Gibco by life technologies	10010-015	Use this PBS in all steps before fixation
Collagen I Rat tail	Corning	354236
5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester	Life technologies	C-6125
DPBS 1x + calcium + magnesium	Gibco by life technologies	14040-091
Paraformaldehyde 16% solution	Electron microscopy science	15710	Dilute at 4% in 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x PBS buffer pH 7.4	Ambion	AM9625	Dilute at 1X in water Use in steps after fixation
Tks5 antibody	Santa Cruz	sc-30122	Invadosome markers Dilution : 1/100
Cortactin 4F11 antibody	Millipore	5180	Invadosome markers Dilution :1/100
DDR1 antibody	Cell signaling	5583	Linear invadosome receptor
Dilution :1/100
Phalloidin FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Fibrillary actin marker Dilution :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Nucleus marker Dilution :1/200
Secondary antibodies FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H or FP-647H
Albumin from bovine serum	Sigma	A2153	Dilute at 4% in 1X PBS
Fluoromount G mounting medium	Interchim	FP 483331
ImageJ software	Public domain		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Cell culture insert	Corning	353097	8.0µm pore size / 24 wells
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	221465