חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)

Summary

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Abstract

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Introduction

החשיבות הגוברת של דימות תהודה מגנטית (MRI) באבחון קליני, אשר מוגבל על ידי רגישות הטבועה של הטכניקה, הביאה את הצמיחה המהירה של המחקר על פיתוח של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום רומן (GBCAs) ^1. GBCAs הם מולקולות אשר מנוהלים על מנת לשפר את איכות התמונה, ובדרך כלל יש להם את המבנה הכימי של יון גדוליניום trivalent (ה ³⁺⁾ מתואם ליגנד polydentate. Complexation זה הוא בעל חשיבות קריטית כפי שהקב"ה unchelated ³⁺ הוא רעיל; זה כבר לידי ביטוי בהתפתחות של סיסטיק מערכתית nephrogenic בחלק מהחולים עם מחלת כליות או אי ספיקת ^2. כתוצאה מכך, הקולט את היון חינם המימי הוא סייע להבטיח את שלומם של GBCAs. הנוכחות של ³⁺ unchelated הקב"ה בפתרונות GBCA לעתים קרובות היא תוצאה של תגובה מלאה בין ליגנד ואת יון, דיסוציאציה של המתחם, או displacement ידי קטיונים מתכת ביולוגיים אחרים ^3.

בין מספר טכניקות המשמשות כיום לקביעת הנוכחות של קב"ה ^3+, שמסתמך על כרומטוגרפיה ו / או דרגת ספקטרומטריית הגבוהה ביותר מבחינת צדדיות ותחולה ^4. בין שאר מעלותיו שלהם גבוהה רגישות ודיוק, היכולת לנתח מטריצות מדגם שונות (כולל בסרום אדם ^5, שתן ושיער ^6, שפכים ^7, ועל ניסוחים חומר ניגוד ^8), ואת כימות סימולטני של מתחמי ה ³⁺ מרובים (הרישום של מחקרים קודמים עד 2013 מתוארת סקירה מקיפה על ידי Telgmann et al.) ^4. החסרון היחיד הוא כי כמה שיטות אלה דורשים instrumentations (כגון מצמידי אינדוקטיבי ספקטרומטריית פלזמה המונית) ⁴ כי מעבדות מסוימות עשויות לא תהיינה גישה. במסגרת גילוי GBCA רומן על מחקר הוכחה של קונספט רמות, arelatively יותר נוחה, מהירה, וחסכוני שיטה מבוססת ספקטרוסקופיות (כגון ספיג או קרינת UV-Vis) עשויה לשמש אלטרנטיבה יקרה. בעזרת יישומים אלה בחשבון, חיישן פלורסנט מבוסס aptamer עבור מימיית אלוקים ³⁺ פותח ^9.

Aptamer (חס-aptamer) הוא מולקולת DNA חד-גדילי ארוך 44-בסיס עם רצף של בסיסים כי היה מבודד בתהליך האבולוציה שיטתית של ligands על ידי העשרה מעריכי (Selex) ^9. כדי להתאים את aptamer לתוך חיישן ניאון, fluorophore מחוברת התחנה הסופית '5 של גדיל, אשר הוא הכלאה ואז עם גדיל מרווה (QS) באמצעות 13 בסיסים משלימים (איור 1). QS מתויג עם מולקולת מרווה בחושך ב 3 התחנה הסופית '. בהיעדר ה ^3+, החיישן (חס-חיישן), מורכב ביחס של 1: 2 חפרפרת של הקב"ה-aptamer ו QS בהתאמה, יהיה t בשל פליטת קרינה מינימאליתo העברת אנרגיה מן fluorophore אל מרווה. התוספת של מימית אלוקים ³⁺ יהיה לעקור את QS מן הקב"ה-aptamer, וכתוצאה מכך גידול פליטת הקרינה.

איור 1. החיישן (חס-חיישן) שמורכב של aptamer הארוך 44-הבסיס (-aptamer ה ') מתויג עם והעמסה (א fluorophore) ואת גדיל המרווה ארוך 13-בסיס (QS) מתויג עם dabcyl (א מרווה כהה) . בהעדר unchelated אלוקים ^3+, הקרינה של החיישן היא מינימלית. עם תוספת של הקב"ה ^3+, עקירה של QS מתרחשת וגידול פליטת הקרינה הוא ציין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יש כרגע, אחד נפוצה מבוסס ספקטרוסקופיות שיטה לזהותing ³⁺ אלוקים מימי. Assay זו משתמשת תפוז xylenol מולקולה, אשר עוברת שינוי אורך הגל קליטה מקסימלית מפני 433 עד 573 ננומטר על קלאציה אל יון ^10. יחס מקסימום ספיגת שני אלה יכולים לשמש כדי לכמת את כמות unchelated אלוקים ^3+. חיישן aptamer מהווה חלופה (יכול להיות גם משלים) אל assay הכתום xylenol, כמו שתי השיטות יש תנאי תגובה שונים (כגון pH ורכב של תמיסות בופר בשימוש), selectivities היעד, טווח ליניארי של כימות, ואופני זיהוי ^9.

Protocol

הערה: מי כיתה וביולוגיה מולקולריים משמשים בכל הכנות חיץ פתרון. כל הצינורות הפנויים (microcentrifuge ו- PCR) וטיפי pipet הם DNase- ו RNase חינם. יש להתייעץ עם גיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל הכימיקלים לפני השימוש. שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) מומלץ בחום.

1. הכנת פתרונות מניות Aptamer

1. לרכוש 2 קווצות polydeoxynucleotide מסחרית. להזמין שני גדילים עם טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC).
   גדיל 1 (-aptamer ה '):
   5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3 "
   סטרנד 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
2. ממיסים כל קווצה מים לעשות 100 פתרונות מניות בודדות מיקרומטר של aptamer-ה 'ואת QS.
3. אחסן פתרונות אלה ב -20 ° C. הפתרונות הם יציבים עד כה, במשך 3 שנים.
4. כדי למזער FreeZדואר ההפשרה מחזורים, לאחסן את פתרונות המניות ב 10 aliquots μL.

2. הכנת הפתרון-חיישן ה 2x

1. הכן את החיץ assay (20 HEPES מ"מ, 2 מ"מ MgCl _2, 150 מ"מ NaCl, KCl 5 מ"מ). התאם את ה- pH ל ~ 7.4 עם NaOH ו HCl, ולסנן דרך מסננים העליון בקבוק חד פעמי סטרילי עם קרום 0.2 מיקרומטר PES. אחסן בבקבוקים סטריליים. אם מסונן מאוחסן כראוי (בטמפרטורת החדר), למאגר יציב עד כה, עבור 2 שנים.
2. לדלל 1 μL של פתרון ה-aptamer המניות (משלב 1.2) ו -2 μL של פתרון המניות QS (משלב 1.2) ב 497 μL של חיץ assay. מערבבים היטב בעזרת מערבולת. הריכוזים שלהם בפתרון ה-חיישן 2x הם 200 ננומטר ו 400 ננומטר, בהתאמה.
   הערה: היקף הפתרון ה-חיישן 2x מוכן בשלב זה הוא 500 μL, וזה מספיק כדי לבדוק 6 - 7 ריכוזים שונים של אלוקים ³⁺ עבור עקומת הכיול ואת הפתרונות חומר ניגוד(שלב 3). כל דגימה תיתן בארות כפולות צלחת 384 גם.
   1. כוון את עוצמת הקול של פתרון 2x אלוקים-החיישן פי מספר פתרונות ³⁺ האלוקים שצריך להיבדק.
3. מעבירים את הפתרון-חיישן ה 2x ל -9 צינורות PCR, עם 50 μL לתוך צינור אחד. מניחים את צינורות Cycler תרמית.
4. הגדר את תוכנית Cycler התרמית כדי לחמם את הפתרון המוצע עבור צינורות עד 95 מעלות צלזיוס, להחזיק למשך 5 דקות, ואז לאט לאט לקרר את פתרונות ל -25 מעלות צלזיוס מעל ~ 15 דקות (בשיעור של ~ 0.05 - 0.1 ° C / ים). מחזור החימום וקירור הוא להבטיח הכלאה אופטימלית בין aptamer-ה 'ואת QS. תוצאות הכלאה חלקית מרווה שלמה קרינת רקע גבוהה של החיישן. אם Cycler תרמית אינו זמין, לבצע את התהליך הזה באמצעות אמבט מים חמים במקום.
5. לאחר מצונן עד 25 מעלות צלזיוס, מיד להשתמש הפתרון, או לשמור Cycler התרמית (עד כ 2 שעות) עד מוכן להיותמְשׁוּמָשׁ. כאשר באמבט מים משמש למערכות החימום, לעזוב את הצינורות באמבטיה כמו המים מתקררים לאט לטמפרטורת חדר.

3. בניית עקומת כיול הקרינה לאיתור נוכחות של הקב"ה Unchelated ³⁺ בתמיסה של חומר ניגוד אלוקים

1. ממיסים GdCl ₃ מוצק למאגר assay (אותו למאגר כמו בשלב 2.1).
2. באמצעות דילול סדרתי, להכין 100 μL כל אחד 6 פתרונות ³⁺ שוני אלוקים צינורות microcentrifuge ב כפול הריכוזים הרצויים הסופיים עבור עקומת הכיול (2x פתרונות).
   1. לדוגמה, כדי לבנות כיול עבור 0 (מאגר בלבד ללא GdCl _3), 50, 100, 200, 400, ו -800 ננומטר של הקב"ה ^3+, להכין תמיסות המכילות 0, 100, 200, 400, 800, ו -1,600 ננומטר של היון. הקפד תמיד לכלול את "אטומים" עם 0 ננומטר אלוקים ³⁺ כמו שליטה שלילית.
3. ממיסים את חומר ניגוד להיות מבחןאד למאגר assay. כן 2 או 3 ריכוזים שונים של פתרונות חומר ניגוד דרך דילול סדרתי.
   הערה: בדיקת 3 ריכוזים שונים של פתרון חומר ניגוד מומלצת. זו היא להבטיח כי ריכוזים אלה נמצאים בטווח ליניארי. אם בדגימות שנבדקו אינו מציג קשר לינארי, הקטינו את הריכוזים של חומר הניגוד בשימוש.
4. קח את צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן משלב 2.5 מתוך Cycler התרמית.
5. הוסף 50 μL של כל פתרון ה ³⁺ משלב 3.2 לתוך 6 מתוך 9 צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. כל צינור PCR מכיל כעת את הריכוז הרצוי של הקב"ה ³⁺ להיבדק, 100 ננומטר אלוקים-aptamer, ו -200 ננומטר QS.
6. אל צינורות הנותרים PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן, להוסיף 50 μL של פתרונות חומר ניגוד משלב 3.3. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים.
7. דגירה שלolutions בתוך צינורות PCR במשך כ 5 דקות בטמפרטורת החדר. הם עשויים להיות שנותרו לעמוד עד 30 דקות.
8. העבר 45 μL של כל צינור לתוך צלחת 384 גם. כל צינור PCR ייתן בארות כפולות.
9. רשום את הקרינה של כל אחד גם על קורא צלחת. Fluorophore (FAM) המשמש לעיצוב חיישן-ה 'יש מקסימום עירור ופליטה של ​​ננומטר 495 ו -520 בהתאמה, כמפורט באתר האינטרנט של הספק. בחר אורכי גל עירור ופליטה מתאימים או מסנן תלויים אם הצליח-הקורא monochromator- או מסנן מבוסס.
10. שרטט את הגרף של קרינה ביחידות קרינה שרירותיות (עפו) נגד ריכוז של קב"ה ^3+.
11. שרטט את הגרף כמו שינוי לקפל הקרינה נגד ריכוז של הקב"ה ^3+. חשב את השינוי לקפל הקרינה על ידי חלוקת עפו של כל ריכוז ידי עפו של הפתרון "אטומים" (עם 0 ננומטר של הקב"ה ^3+). השינוי לקפל קרינה יאפשר עבור normalization של התוצאות, צריך התצוגה עפה עת מסוימת (בימים שונים, וכו ') וריאציות.
12. השווה את פליטת הקרינה של תמיסה המכילה חומר הניגוד ו 'ריק', המהווה את התמיסה המכילה 0 ננומטר GdCl ₃ (מאגר בלבד).
    הערה: קרינה גבוהה יותר של פתרון GBCA מרמזת על הנוכחות של unchelated אלוקים ^3+, אשר עשוי להצריך טיהור נוספת של חומר הניגוד. הכמות הנוכחית ³⁺ unchelated האלוקים ניתן להעריך באמצעות עקומת הכיול נבנתה בשלב 3.10 או 3.11.

תוצאות

שינוי קרינה אופייני הפתרון ה-החיישן בנוכחות unchelated אלוקים ³⁺ מוצג באיור 2. הפליטה ניתן להתוות כשינוי לקפל פלואורסצנטי (איור 2 א) או את קרינת הגלם לקרוא (תרשים 2B) ביחידות כלשהן (עף). מגרשי שני להניב עקומות כיול דומות מאוד ?...

Discussion

שימוש בחיישן ה-מבוסס aptamer, גידול פליטת קרינה כי היא יחסית ריכוז unchelated אלוקים ³⁺ הוא ציין. כדי למזער את כמות מדגם, assay ניתן לרוץ microplate 384 גם עם נפח דגימה כולל של 45 μL לכל טוב. בתכנון זה, הבחירה של והעמסה (FAM) ו dabcyl (DAB) התבססה בעיקר על העלות של החומרים הכימיים; כדי לשנות את ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well