Unchelated Gadolinium için bir Aptamer tabanlı Sensörü (III)

Özet

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Özet

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Giriş

Tekniğin doğal duyarlılığı ile sınırlıdır klinik tanı, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) artan önemi, yeni gadolinyum bazlı kontrast maddeler (GBKM'lerin) ¹ geliştirilmesine yönelik araştırma hızlı büyüme sonuçlandı. GBKM'lerin görüntü kalitesini artırmak için tatbik edilmektedir moleküllerdir ve bunlar genellikle çok dişli bir ligand ile koordine bir üç değerli gadolinyum iyonu (Gd ³⁺⁾ kimyasal yapıya sahiptir. Bu kompleksleşme toksik ³⁺ unchelated Gd gibi kritik öneme sahiptir; böbrek hastalığı veya yetmezliği ² olan bazı hastalarda nefrojenik sistemik fibrozis gelişiminde rolü olduğu bilinmektedir. Sonuç olarak, sulu serbest iyon tespit GBKM'lerin güvenliğini sağlamada etkili olduğunu. GBCA Çözeltilerin unchelated Gd ³⁺ varlığı genellikle ligand ve iyon kompleksinin ayrışma veya displacemen arasında bir tam olmayan reaksiyon sonucudiğer biyolojik metal katyonları ³ ile t.

Şu Gd ^3+, çok yönlülük ve uygulanabilirliği ⁴ açısından kromatografi ve / veya spektrometre en yüksek değerli dayalı olanlar varlığını tespit etmek için kullanılan çeşitli teknikler arasında. Onların güçlü yanları arasında yüksek hassasiyet ve doğruluk, (bir liste ve çoklu Gd ³⁺ komplekslerin eşzamanlı ölçümü (insan serumu ^5, idrar ve saç ^6, atıksu ⁷ ve kontrast ajan formülasyonları ⁸ dahil) çeşitli numune matrisleri analiz yeteneği olan çalışmaların 2013 öncesinde Telgmann ve diğ.) ⁴ kapsamlı bir inceleme açıklanmaktadır. Tek dezavantajı bu yöntemlerden birkaç bazı laboratuvarlar erişimi olmayabilir (örneğin indüktif eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi gibi) instrumentations ⁴ gerektirir olmasıdır. araştırma ve kanıt-of-concept seviyelerinde, ar de roman GBCA keşif kapsamındaelatively daha rahat, hızlı ve uygun maliyetli spektroskopik tabanlı bir yöntem (örneğin UV-Vis absorpsiyon veya floresan gibi) değerli bir alternatif olarak hizmet verebilir. Akılda bu uygulamalar sayesinde, sulu Gd ³⁺ için bir floresan aptamer tabanlı sensör ⁹ geliştirilmiştir.

Aptamer (Gd-aptamerin) üstel zenginleştirme (SELEX) ⁹ tarafından ligandların sistematik evrim süreci boyunca izole edildi bazların spesifik dizisi ile bir 44 baz uzunluğunda tek iplikli bir DNA molekülüdür. Floresan sensör içine aptamer uyarlamak için, bir flüorofor, sonra 13 tamamlayıcı bazlar (Şekil 1) aracılığı ile su verme telinin (QS) ile hibridize olan telin, 5 'ucuna eklenir. QS 3 'ucunda bir karanlık söndürücü molekülü ile etiketlenir. 1 oluşan Gd ^3+, sensör (Gd-sensör) yokluğunda, sırasıyla: Gd-aptamer ve QS 2 mol oranı, en az floresans emisyon nedeniyle t olacaktırquencher için fluorofordan o enerji transferi. Sulu Gd ³⁺ eklenmesi floresan emisyonunda bir artışa neden, Gd-aptamer gelen QS ettirilir.

Floresein (bir fluorofor) ve DABCYL ile etiketlenmiş 13 baz uzunluğunda söndürme iplikçik (QS) ile etiketlenmiş 44 baz uzunluğunda aptamer (Gd-aptamer) (koyu söndürücü) oluşur Şekil 1. sensörü (Gd-sensör) . Unchelated Gd ³⁺ yokluğunda, algılayıcının flüoresan az. Gd ³⁺ eklenmesiyle, QS yerinden oluşur ve floresan emisyonunda bir artış gözlenmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Günümüzde vardır, yaygın bir şekilde kullanılan spektroskopik bazlı yöntem algılama içinSulu Gd ³⁺ ing. Bu tahlil iyonunun ¹⁰ şelasyon üzerine 433 nm 573 ila maksimum absorpsiyon dalga boyu bir kayma uğrar molekül ksilenol turuncu kullanır. Bu iki emilimi maksimum oranı unchelated Gd ³⁺ miktarını belirlemek için kullanılabilir. iki yöntem, hedef seçicilik, miktarının doğrusal aralıkları ve algılama yöntemlerinin (örneğin pH ve kullanılan tampon çözeltilerin bileşiminde gibi) farklı reaksiyon koşullarına sahip olarak aptamer sensörü, ksilenol turuncu tahlil alternatif (aynı zamanda tamamlayıcı olabilir) 'dir ^9.

Protokol

Not: Moleküler biyoloji dereceli su Tüm tampon ve çözelti preparatlar kullanılır. Tüm atılabilir tüpleri (mikrosantrifüj ve PCR) ve pipet uçları DNase- ve RNaz-ücretsiz. Kullanmadan önce tüm kimyasalların malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) danışın. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) kullanılması önemle tavsiye edilir.

Aptamer Stok çözeltiler hazırlanması 1.

1. Ticari polydeoxynucleotide 2 ipliklerini satın alın. yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırma her iki hat sipariş.
   1 (Gd-aptamer) Strand:
   5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Dizin 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / 3 '
2. Gd-aptamer ve QS 100 uM bireysel hisse senedi çözümleri yapmak için su her telini eritin.
3. -20 ° C'de bu çözümleri saklayın. çözümler şimdiye kadar, 3 yıl boyunca stabildir.
4. Freez en aza indirmek içinE-çözülme döngüleri, 10 ul alikotları stok solüsyonları saklayın.

2x Gd-sensör Çözüm 2. Hazırlık

1. Deney tamponu hazırlayın (20 mM HEPES, 2 mM _MgCI2, 150 mM NaCI, 5 mM KCI). NaOH ve HCl ile pH değeri için ~ 7.4 ayarlayın ve 0.2 um PES membran ile steril tek kullanımlık şişe üst filtreler aracılığıyla filtre. Steril şişelerde saklayın. filtre edilmiş ve (oda sıcaklığında) saklandığı takdirde, tampon, şimdiye kadar, 2 yıl stabildir.
2. deney tamponu 497 uL ve (adım 1.2 dan itibaren) QS stok solüsyonu 2 uL (adım 1.2 dan itibaren) Gd-aptamer stok solüsyonu 1 mcL seyreltin. bir girdap kullanarak iyice karıştırın. 2x Gd sensör çözelti içindeki konsantrasyonu, sırasıyla, 200 nM ve 400 nM.
   NOT: - kalibrasyon eğrisi ve kontrast madde çözümleri için ³⁺ Gd 7 değişik konsantrasyonlarda bu adımda hazırlanan 2x Gd-sensör çözeltisinin hacmi 6 test etmek için yeterli 500 uL olduğunu(Aşama 3). Her bir numune, 384 oyuklu plaka çoğaltma kaynaklarıdır verecektir.
   1. Test edilmelidir GD ³⁺ çözümlerin sayısına göre 2x Gd-sensör çözümünün ses seviyesini ayarlayın.
3. Her tüpe 50 uL ile 9 PCR tüpleri içine 2x Gd-sensör çözüm aktarın. bir termal döngü tüpler yerleştirin.
4. 95 ° C'ye kadar tüplere çözelti ısı termal döngü programı alan 5 dakika tutun ve daha sonra yavaş yavaş oranında (15 dakika ~ boyunca 25 ° C'ye kadar soğumaya çözüm ~ 0,05-0,1 ° C / s). Isıtma ve soğutma çevrimi Gd-aptamer ve QS arasında optimal hibridizasyon sağlamaktır. eksik söndürme ve sensör daha yüksek bir eşiğe Kısmi melezleme sonuçları. Bir termal döngü cihazı kullanılabilir durumda değilse, bunun yerine sıcak su banyosu kullanılarak bu süreci yürütmek.
5. Bir kez 25 ° C'ye kadar soğutuldu, hemen çözüm kullanmak, veya hazır olana kadar (yaklaşık 2 saat kadar) termal döngüleyici içinde tutmakKullanılmış. Bir su banyosu ısısı için kullanıldığında, su yavaş yavaş oda sıcaklığına soğurken, banyo tüpleri bırakın.

3. Floresan Kalibrasyon eğrisi oluşturmadan ve Gd kontrast maddesi çözeltisi içinde ³⁺ Unchelated Gd varlığını tespit

1. Deney tamponu içinde bir katı GdCl ₃ (adım 2.1 ile aynı tamponu) içinde çözülür.
2. Seri seyreltme yoluyla, kalibrasyon eğrisi (2x çözümleri) için nihai istenen konsantrasyonlarda iki katı 100 uL mikrosantrifüj tüpler 6 farklı Gd ³⁺ çözümleri her hazırlamak.
   1. Örneğin, 0 bir kalibrasyon oluşturmak için, 50, 100, 200, 400 (Resim GdCl ₃ sadece tampon), ve Gd ³⁺ 800 nM, 0, 100, 200, 400, 800, 1600 nM içeren çözeltiler hazırlanması iyonu. Emin negatif kontrol olarak 0 nM Gd ³⁺ ile 'boş' her zaman dahil olun.
3. Test için kontrast ajanı çözülürdeney tamponu içinde ed. Seri seyreltme ile kontrast maddesi çözeltilerinin 2 ya da 3 farklı konsantrasyondan hazırlayın.
   NOT: kontrast madde solüsyonu 3 farklı konsantrasyonlarda test tavsiye edilir. Bu durum, bu konsantrasyon, doğrusal aralığı içinde olduğunu sağlamaktır. doğrusal bir ilişki göstermez test örnekleri, kontrast madde konsantrasyonlarını azaltmak durumunda kullanılır.
4. termal döngü dışına adım 2.5 den 2x Gd-sensör çözeltisi içeren PCR tüpleri atın.
5. 2x Gd-sensör çözeltisi içeren 9 PCR tüpleri 6 içine adım 3.2 her Gd ³⁺ çözeltisi 50 uL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Her bir PCR tüpü artık istenen Gd ³⁺ konsantrasyonunu test etmek için, 100 nM Gd-aptamer ve 200 nM QS içerir.
6. 2x Gd-sensör çözeltisi içeren Kalan PCR tüpleri için, adım 3,3 kontrast madde çözümleri 50 mcL ekleyin. yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın.
7. s inkübeOda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika için PCR tüplerine Çözeltileri. En fazla 30 dakika süreyle beklemeye bırakıldı olabilir.
8. 384 oyuklu bir plakaya her bir tüpe 45 uL aktarın. Her bir PCR tüpü yinelenen kuyu verecektir.
9. Bir levha okuyucu üzerinde her bir floresan kaydedin. tedarikçinin Web sitesinde listelenen Gd-sensör tasarımında kullanılan fluorofor (FAM), sırasıyla 495 ve 520 nm eksitasyon ve emisyon maxima vardır. levha okuyucu monochromator- veya filtre bazlı olmasına bağlı olarak, uygun eksitasyon ve emisyon dalga boylarını veya filtreler seçin.
10. Gd ³⁺ konsantrasyonuna karşı keyfi floresan birimlerinin (AFU) floresan grafiği çizilir.
11. Gd ³⁺ konsantrasyonuna karşı floresan kat değişikliği olarak grafik çizilir. (Gd 0 nM ³⁺⁾ ile 'boş' çözümün AFU her konsantrasyon AFU bölerek floresan katlık değişime hesaplayın. floresan kat değişim n sağlayacaktırSonuçların ormalization, AFU ekran bazı periyodik (farklı günlerde, vb) varyasyonlar gerekir.
12. 0 nM GdCl ₃ (sadece tampon) içeren çözüm kontrast maddeyi içeren çözeltinin ve 'boş', floresan emisyonunu karşılaştırın.
    Not: GBCA çözeltisinin bir daha yüksek floresans kontrast madde, daha fazla saflandırma gerektirebilir unchelated Gd ³⁺ varlığını ima eder. Unchelated Gd ³⁺ miktarı, adımı 3.10 veya 3.11 inşa kalibrasyon eğrisi kullanılarak tahmin edilebilir.

Sonuçlar

Unchelated Gd ³⁺ mevcudiyetinde Gd sensör çözeltisi tipik bir floresans değişimi, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Emisyon flüoresan kat değişim (Şekil 2A) ya da rasgele birimlerde okuma ham floresans (Şekil 2B) olarak grafiğe edilebilir (SKB). Her iki araziler> 3 uM sinyalin 1 uM ve doygunluk altında Gd konsantrasyonları için doğrusal aralık ³⁺ ile çok benzer kalibrasyon eğrileri elde. Saptam...

Tartışmalar

Aptamer göre Gd-sensörü, gözlenen unchelated Gd ³⁺ konsantrasyonu ile orantılıdır flüoresan emisyonunda bir artışa kullanılması. Kullanılan örnek miktarı en aza indirmek için, deney, göz başına 45 uL toplam numune hacmi olan bir 384-çukurlu bir mikrolevhadaki çalıştırılabilir. Bu tasarımda, floresein (FAM) ve DABCYL (Dab) seçimi öncelikle reaktiflerin maliyeti dayanmaktadır; emisyon dalga boyu, floroforun farklı eşleştirme değiştirme ve söndürücü ¹¹ kullanılab...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well