Un capteur basé aptamère pour non chélaté Gadolinium (III)

Résumé

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Résumé

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Introduction

L'importance croissante de l' imagerie par résonance magnétique (IRM) dans le diagnostic clinique, qui est limitée par la sensibilité inhérente de la technique, a entraîné la croissance rapide de la recherche dans le développement de nouveaux agents de contraste à base de gadolinium (GBCAs) ^1. GBCAs sont des molécules qui sont administrés pour améliorer la qualité de l' image, et ils ont généralement la structure chimique d'un ion trivalent de gadolinium (Gd ³⁺⁾ coordonné à un ligand polydenté. Cette complexation est d' une importance critique que non chélaté Gd ³⁺ est toxique; elle a été impliquée dans le développement d' une fibrose néphrogénique systémique chez certains patients souffrant d'une maladie rénale ou une insuffisance ^2. Par conséquent, la détection de l'ion libre aqueuse contribue à assurer la sécurité des GBCAs. La présence de non chélaté Gd ³⁺ dans des solutions GBCA est souvent le résultat d'une réaction incomplète entre le ligand et l'ion, la dissociation du complexe, ou déplacement par d' autres cations métalliques biologiques ^3.

Parmi les différentes techniques actuellement utilisées pour déterminer la présence de Gd ^3+, ceux qui comptent sur la chromatographie et / ou spectrométrie de rang le plus élevé en termes de polyvalence et l' applicabilité ^4. Parmi les points forts sont une grande sensibilité et la précision, la capacité d'analyser différentes matrices d'échantillons (y compris le sérum humain ^5, l' urine et les cheveux ^6, les eaux usées ^7, et des formulations d'agent de contraste ^8), et la quantification simultanée de plusieurs ³⁺ complexes Gd (une liste des études avant 2013 est décrite dans un examen complet par Telgmann et al.) ^4. Le seul inconvénient est que plusieurs de ces méthodes nécessitent instrumentations (telles que la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif) ⁴ que certains laboratoires ne peuvent pas avoir accès. Dans le contexte de nouvelle découverte GBCA à la recherche et les niveaux de preuve de concept, arProcédé basé spectroscopique-elatively plus commode, rapide et économique (par exemple, l'absorption UV-visible ou de fluorescence) peut servir comme une alternative intéressante. Avec ces applications à l' esprit, un capteur à base d'aptamères-fluorescent pour aqueuse Gd ³⁺ a été développé ^9.

L'aptamère (Gd-aptamère) est une longue molécule d'ADN simple brin 44-base avec une séquence spécifique de bases qui a été isolé à travers le processus d'évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) ^9. Afin d' adapter l'aptamère dans un capteur fluorescent, un fluorophore est attaché à l'extrémité 5 'du brin, qui est ensuite hybridée avec un brin de trempe (QS) par l' intermédiaire de 13 bases complémentaires (figure 1). QS est marquée avec une molécule de désactivateur noir à l'extrémité terminale 3 '. En l'absence de Gd ^3+, le capteur (Gd-capteur), composé d'un rapport 1: Gd-aptamère et QS taupe 2 respectivement, auront un minimum d' émission de fluorescence due to le transfert d'énergie à partir du fluorophore à l'agent de neutralisation. L'addition d' une solution aqueuse Gd ³⁺ va déplacer le QS à partir du Gd-aptamère, ce qui entraîne une augmentation de l' émission de fluorescence.

Figure 1. Le capteur (Gd-capteur) qui se compose de l'aptamère 44-base longue (Gd-aptamère) marqué avec de la fluorescéine (un fluorophore) et le 13-base à long trempe brin (QS) marqués avec dabcyl (un quencher foncé) . En l'absence de Gd3 ⁺ non chélaté, la fluorescence de la sonde est minime. Avec addition de Gd ^3+, le déplacement du QS se produit et une augmentation de l' émission de fluorescence est observée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Il est à l'heure actuelle, une méthode basée sur spectroscopique communément utilisé pour détectertion aqueuse ³⁺ Gd. Cet essai utilise la molécule xylénol orange, qui subit un changement de la longueur d' onde d'absorption maximale de 433 à 573 nm lors de la chélation de l'ion ^10. Le rapport de ces deux maxima d' absorbance peut être utilisée pour quantifier la quantité de non chélaté Gd ^3+. Le capteur de l'aptamère est une alternative (peut aussi être complémentaire) pour le dosage xylénol orange, alors que les deux méthodes ont différentes conditions de réaction (telles que le pH et la composition des solutions tampons utilisées), les sélectivités cibles, les plages linéaires de quantification et les modalités de détection ^9.

Protocole

NOTE: L'eau moléculaire de qualité biologie est utilisé dans toutes les préparations de tampon et de solution. Tous les tubes jetables (microtubes et PCR) et embouts de pipettes sont DNase et RNase. S'il vous plaît consulter la fiche de données de sécurité (FDS) pour tous les produits chimiques avant de les utiliser. L'utilisation des équipements de protection individuelle (EPI) est fortement recommandé.

1. Préparation des aptamères Stock Solutions

1. Achetez 2 brins de polydésoxynucléotide commercialement. Commandez les deux brins avec purification par chromatographie liquide haute performance (CLHP).
   Volet 1 (Gd-aptamère):
   5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Volet 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
2. Dissoudre chaque brin dans l'eau pour faire 100 uM individuels solutions mères du Gd-aptamère et QS.
3. Conserver ces solutions à -20 ° C. Les solutions sont stables à ce jour, pendant 3 ans.
4. Pour minimiser freezcycles e-dégel, stocker les solutions mères à 10 aliquotes ul.

2. Préparation du 2 x Gd capteur Solution

1. Préparer le tampon d'essai (HEPES 20 mM, MgCl2 ₂ mM, NaCl 150 mM, KCl 5 mM). Ajuster le pH à ~ 7,4 avec NaOH et HCl, et filtrer à travers des filtres en haut de la bouteille stériles jetables avec 0,2 um membrane PES. Stocker dans des flacons stériles. Si filtrée et stockée correctement (à température ambiante), le tampon est stable jusqu'à présent, pendant 2 ans.
2. Diluer 1 pl de la solution Gd-aptamère stock (de l'étape 1.2) et 2 ul de la solution mère QS (de l'étape 1.2) dans 497 pi du tampon de dosage. Bien mélanger à l'aide d'un vortex. Leurs concentrations dans la solution Gd-capteur 2x sont 200 nM et 400 nM, respectivement.
   NOTE: Le volume de la solution de Gd-capteur 2x préparé dans cette étape est de 500 ul, ce qui est suffisant pour tester 6 - 7 pour différentes concentrations de Gd ³⁺ pour la courbe d'étalonnage et des solutions d'agent de contraste(étape 3). Chaque échantillon donnera des puits en double dans une plaque à 384 puits.
   1. Ajuster le volume de la solution de Gd-2x capteur en fonction du nombre de solutions ^de Gd qui doit être testé.
3. Transférer la solution Gd-capteur 2x en 9 tubes PCR, avec 50 ul dans chaque tube. Placer les tubes dans un cycleur thermique.
4. Réglez le programme dans le cycleur thermique pour chauffer la solution dans les tubes à 95 ° C, maintenir pendant 5 min, puis refroidir lentement les solutions à 25 ° C pendant environ 15 min (au taux de ~ 0,05 à 0,1 ° C / s). Le cycle de chauffage et de refroidissement est d'assurer une hybridation optimale entre le Gd-aptamère et le QS. résultats d'hybridation partielles trempe incomplète et un arrière-plan supérieur de fluorescence du capteur. Si un cycleur thermique ne sont pas disponibles, mener à bien ce processus en utilisant un bain d'eau chaude à la place.
5. Une fois refroidi à 25 ° C, utiliser immédiatement la solution, ou de garder dans le cycleur thermique (jusqu'à environ 2 h) avant d'être prêt à êtreutilisé. Quand un bain d'eau est utilisée pour le chauffage, laisser les tubes dans le bain que l'eau se refroidit lentement à la température ambiante.

3. Construire la courbe d'étalonnage de la fluorescence et de détection de la présence de non chélaté Gd ³⁺ dans une solution de Gd Agent de contraste

1. Dissoudre GdCl ₃ solide dans le tampon d'essai (le même tampon que dans l' étape 2.1).
2. Grâce à une dilution en série, préparer 100 pi chacun de 6 solutions différentes Gd ³⁺ dans des tubes de microcentrifugation à deux des concentrations finales désirées pour la courbe d'étalonnage (2x solutions).
   1. Par exemple, pour construire un étalonnage pour 0 (tampon seul, sans GdCl _3), 50, 100, 200, 400 et 800 nM de Gd ^3+, de préparer des solutions contenant 0, 100, 200, 400, 800 et 1 600 nm de l'ion. Assurez - vous d'inclure toujours le «blanc» avec 0 nM Gd ³⁺ en tant que témoin négatif.
3. Dissoudre l'agent de contraste à être testéed dans le tampon d'essai. Préparer 2 ou 3 concentrations différentes des solutions d'agent de contraste par dilution en série.
   REMARQUE: Test 3 concentrations différentes de la solution d'agent de contraste est recommandée. Ceci permet d'assurer que ces concentrations se situent dans la plage linéaire. Si les échantillons testés ne pas afficher une relation linéaire, réduisent les concentrations de l'agent de contraste utilisé.
4. Prenez les tubes PCR contenant la solution 2x Gd-capteur de l'étape 2.5 sur le cycleur thermique.
5. Ajouter 50 ul de chaque solution ³⁺ Gd de l' étape 3.2 dans 6 des tubes PCR 9 contenant la solution 2x Gd-capteur. Mélanger par pipetage de haut en bas. Chaque tube PCR contient maintenant la concentration souhaitée de Gd ³⁺ à tester, 100 nM Gd-aptamère, et 200 nM QS.
6. Les tubes de PCR restant contenant la solution de Gd-capteur 2x, ajouter 50 ul des solutions d'agent de contraste à l'étape 3.3. Bien mélanger en pipetant plusieurs fois.
7. Incuber les solutions dans les tubes de PCR pour environ 5 min à température ambiante. Ils peuvent être laissés au repos jusqu'à 30 min.
8. Transférer 45 ul de chaque tube dans une plaque à 384 puits. Chaque tube PCR donnera des puits en double.
9. Notez la fluorescence de chaque puits sur un lecteur de plaques. Le fluorophore (FAM) utilisé dans la conception Gd-capteur a excitation et d'émission maxima de 495 et 520 nm, respectivement, comme indiqué sur le site Web du fournisseur. Choisissez excitation et d'émission des longueurs d'onde ou des filtres appropriés selon que le lecteur de plaques est monochromator- ou à base de filtre.
10. Tracer le graphique de la fluorescence en unités de fluorescence arbitraires (AFU) contre la concentration de Gd ^3+.
11. Tracer le graphique que le changement de fluorescence de pliage contre la concentration de Gd ^3+. Calculer la variation de fluorescence de pli en divisant le AFU de chaque concentration par l'AFU de la solution « en blanc» (avec 0 nM de Gd ^3+). Le changement de fluorescence de pliage permettra le normalization des résultats, si l'affichage de certains AFU de périodique (différents jours, etc.) variations.
12. Comparer l'émission de fluorescence de la solution contenant l'agent de contraste et le «blanc», ce qui est une solution contenant 0 nM GdCl ₃ (tampon uniquement).
    REMARQUE: une plus grande fluorescence de la solution GBCA implique la présence de non chélaté Gd3 ^+, ce qui peut nécessiter une purification supplémentaire de l'agent de contraste. Le montant de la présente ^de non chélaté Gd peut être estimée en utilisant la courbe d'étalonnage construite à l' étape 3.10 ou 3.11.

Résultats

Une variation typique de la fluorescence de la solution de Gd-capteur , en présence de Gd3 ⁺ non chélaté est représenté sur la figure 2. L'émission peut être tracée comme la variation de fluorescence de pliage (figure 2A) ou de la fluorescence brute de lecture (figure 2B) en unités arbitraires (AFU). Les deux parcelles donnent des courbes d'étalonnage très similaires avec une gamme linéaire pour des concent...

Discussion

À l' aide du capteur à base de Gd-aptamère, une augmentation de l' émission de fluorescence qui est proportionnelle à la concentration de Gd3 ⁺ non chélaté est observée. Pour minimiser la quantité d'échantillon utilisée, l'essai peut être exécuté dans une microplaque à 384 puits avec un volume d'échantillon total de 45 ul par puits. Dans cette conception, le choix de la fluorescéine (FAM) et dabcyl (Dab) a été principalement basée sur le coût des réactifs; pour modifi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well