דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד רקמת האשכים של דג הזברה הזחל, אשר יקל על חקירות של בידול מין דג הזברה ותחזוקה.

Abstract

למרות דג זברה פרא להחזיק מערכת ZZ / ZW מין להגדרה, דג זברה מבוית אבדה את כרומוזום המין. הם מנצלים מערכת קביעת הזוויג polygenic, שבו מספר גנים מופצים ברחבי הגנום קולקטיבי לקבוע את זהותם המין של דגים בודדים. נכון לעכשיו, את הגנים מעורבים בויסות התפתחות בלוטת מין וכיצד הם פועלים להישאר חמקמקים. בדרך כלל, לבודד רקמת אשכים הוא הצעד הראשון כדי לבחון את התהליכים ההתפתחותיים מין. כאן, אנו מציגים הליך לבודד רקמת אשכים מן 17 DPF (הפריה פוסט ימים) ו 25 DPF זחלי דג זברה. רקמת האשכים המבודדת עשויה להיבחן לאחר מכן על ידי פרופיל ביטוי מורפולוגיה גן.

Introduction

קובע המין הנשי המרכזי כרומוזום דג זברה פרא 4 אבד או שונה של דג הזברה המבויתת (זני מעבדה הנפוצים כלומר) ^1. במקום זאת, יש להם מערכת קביעת הזוויג polygenic בליווי גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה, היפוקסיה, זמינות המזון וצפיפות האוכלוסייה. המנגנונים המפורטים של התפתחות מין דג זברה אינם מובנים במלואם. שאלות יסוד כגון כאשר קביעת הזוויג דג זברה מתרחשת, מה אות קביעת המין העיקרית (ים) היא / הם, ואשר גנים להסדיר את הצעד הראשון של טרנספורמציה שַׁחֲלָה להישאר ייענה ^{2, 3.}

בתהליך פיתוח מין דג זברה, בכמה שלבים חשובים הוכרו. בשלב מוקדם של הפיתוח, החל 4 hpf (הפריה פוסט שעות)-תאי נבט בראשיתי (PGCs) עוברים המפרט, הגירה אל הרכס גניטלישִׂגשׂוּג. מספרים PGC ואינטראקציות גומלין בין תאי הנבט תאים סומטיים חשובים בידול שַׁחֲלָה ^4. בשעה 13 DPF (הפריה פוסט ימים), בלוטות המין נמצאים בשלב מובחן. עד 17 DPF, בלוטות המין להתפתח דו-פוטנציאל שחלות הן נקבות וזכרים בעתיד. המעבר תלוי-אפופטוזיס מן השחלה אל האשכים מתחילים בגיל 21 כדי 25 DPF ועשוי להימשך מספר שבועות. עד 35 DPF, המין של בלוטת המין נקבע וייצור תא מין ספציפי מין מתנהל בשני השחלות ואשכים ^{5, 6, 7.}

נכון להיום, גנים ומנגנוני מועמד מגוונים של קביעת הזוויג הוצעו. פרוטאומיקה וניתוח transcriptomic הצליחו לבודד גנים רבים עם הביטוי דימורפית מינית גנים אלה נוצלו כדי ללמוד בידול מין דג הזברה ^{8, 9, 10.} לדוגמה, ב דג הזברה הזחל, הגן cyp19a1a מתבטא במיוחד בשחלה אך לא את האשך ^{11, 12.} בנוסף, גן AMH מתבטא בחולשה בתאי granulosa הזקיק בשחלה, אבל מאוד בתאי testis Sertoli ^13. לעומת זאת, הגן ושה מתבטא באופן רציף בתאי הרבייה של שני דג הזברה הנשית והגברית, מה שהופך אותו סמן שַׁחֲלָה מתאים ^{14, 15.}

חקירת רמות ביטוי הגנים האשכים הוא קריטי כדי להבין את המנגנון המולקולרי של קביעת הזוויג והבחנה במיוחד בשלב הדו-פוטנציאל השחלה ^{3, 9.} עם זאת, גודלו הקטן של דג הזברה הזחל והאשכים קטנים בהתאמה לסבך את הבידוד של gonadal רקמות לניתוח מולקולרי נוסף. מחקרים קודמים השתמשו גזורים באזור תא מטען כולו בין opercula ואת הנקבוביות אנאליות ^16. הכנה זו, למרות בלוטות מין המכיל, מורכבת של רקמות ואיברים מרובים. לחלופין, חיות טרנסגניות עם הביטוי GFP שַׁחֲלָה ספציפיים כגון ושה: EGFP שימשו לבידוד רקמת האשכים באמצעות תא מופעל הקרינה מיון (FACS) ו ללכוד לייזר דיסקציה מיקרו ^{17, 18.} אבל היישום הנרחב שלהם מוגבל. כאן, אנו מתארים תהליך פשוט לבודד רקמת האשכים מן דג הזברה הזחל ב 17 DPF ו 25 DPF. אנחנו מדגימים את המיקום של בלוטות המין ביחס לאיברים אחרים ולבודד את בלוטות המין ללא פגע מורפולוגית הרקמות הסובבות. אנחנו מראים עוד את הגנים ספציפיים שַׁחֲלָה כגון ושה cyp19a1a מבוטאים מאוד בלוטות המין המבודדות לעומת רקמת תא המטען באמצעות PCR כמוני (ניתוח qPCR). הפרוטוקול הנוכחי מאפשר זיהוי, בידוד, טיהור RNA והגברה של גנים ספציפיים אשכים מן דג זברת זחל, ובכך מאפשר ניתוח מולקולרי הבא של רקמת אשכי ^19.

Protocol

ניסויים הזברה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת פודאן ושימוש. זברה הועלתה וגדלה על פי נהלים קבועים ^20.

1. הכנות

1. טפחו 17 DPF ו 25 DPF דג הזברה הזחל
   1. העברה 2 זכרים ו 2 דג זברה מבוגר נקבה (בריאה, 3 עד 6 חודשים, זן מעבדת AB) ועד טנק המעבר בשעות אחר הצהריים המאוחרים לפני יום המעבר. להפריד בין זכרים לנקבות עם מחסום. למחרת בבוקר, לרענן את המים במיכל ולהסיר את המחסום כדי לאפשר להם להזדווג. אסוף ביצים 100 מ"מ פטרי מנות 1 עד 2 שעות לאחר ההפריה.
   2. שמור על 40 העוברים בתוך צלחת 100 מ"מ עם המדיום העובר 40 מ"ל (EM) ב 28.5 מעלות צלזיוס במהלך תקופת ההתפתחות המוקדמת (4 ימים) ולרענן את EM פעמיים ביום. עבר זחלי 1 טנקי L (40 זחלים למי מערכה 300 מיליליטר) ולהאכיל עם rotifers החי (אספקה ​​מלאה, פעמים ביום) לאחר 5 DPF.Feed ארטמיה חיה במקום דיאטה rotifer לאחר 10 DPF. מעבירים את הדג לתוך מערכת המים במחזור מחדש ב 14 DPF ^21.
   3. תרים דג הזברה הזחל במערכת המים במחזור מחדש עד 17 DPF או 25 DPF. ודא מחזור אור / חושך הוא 14/10 h ו pH ערך של מים במערכת הוא על 7.2. מדדו את אורך הגוף של 17 DPF (5.5 כדי 6.8 מ"מ) ו 25 DPF (8 עד 11 מ"מ) זחלי ^22.
2. כן 2% צלחות אגרו לנתיחה.
   1. הוספת אגר 4 גרם ל 200 מ"ל מים סטריליים. מחממים את התערובת במיקרוגל עד שהוא הופך שקוף.
   2. מצנן את הפתרון אגר במשך כ 15 דקות, ואז לשפוך אותו לתוך 60 מנות מ"מ קוטר פטרי (כ 1/3 נפח של הצלחת). אחסן את הצלחות אגרו הקרושה ב 4 מעלות צלזיוס.

2. פרוטוקול 1: לנתח את רקמת האשכים של 17 ו 25 DPF זחלים

1. להוסיף קרח כתוש לתוך הטנק כדי להרדים 17 זחלי DPF. העברתזחלים הרדימו עד 100 מ"מימ מקוררים צלחת פטרי עם 30 הפתרון של המ"ל הקר Ringer. שמור את הדגים וטופחו על ידי פתרון של מקורר Ringer עבור 15 דקות לפחות כדי להרדים את זחלי במלואה.
2. מעבירים את הזחלים לצלחת אגר precooled בכפית פלסטיק קטנה. לצלול הגוף דג שלם 10 מ"ל מקורר בתמיסת רינגר בעדינות ולהניח אותה על צדה.
3. לעשות את הפעולות הבאות מתחת לשדה הראייה של מיקרוסקופ סטריאו 25x. הצמד את תא המטען דגים עם פינצטה עבור ייצוב. תולשים את הבטן אורכית מפי הטבעת אל הלב עם זוג אחר של פינצטה. הסר בעדינות את העור והשרירים בצד אחד של הגוף על מנת לחשוף את האיברים הפנימיים.
4. הסר את מסת איברי גחון בשלפוחית ​​השחייה בזהירות. למנוע נזק שַׁחֲלָה המצורפת בשלפוחית ​​השחייה.
5. חותך את הקשר בין בשלפוחית ​​השחייה והגוף קדמי. משוך החוצה בשלפוחית ​​השחייה כולו רקמות האשכים בעדינות.
   הערה: ברוב המקרהים, רקמת האשכים ב 17 DPF מכיל לרקמות אפיתל protonephridium. הם אינם מופרדים בקלות זה מזה, אבל 25 DPF זה ניתן להפריד בקלות. אֶשֶׁך מחובר גם אל פי הטבעת. צומת עם אשך שמאל וימין מחוברים זה לזה על פי הטבעת תהיה גלויה בבירור.
6. להשתמש בפינצטה כדי להפריד את רקמת האשכים בקפידה מתוך בשלפוחית ​​השחייה ולנקות את רקמות השומן שמסביב.
7. מיד להעביר את רקמת האשכים מבודדת כדי צינור צנטריפוגות prechilled 1.5 מ"ל המכיל 200 הפתרון של μL Ringer. שמור את הצינור על קרח עד שכל רקמות האשכים מופרדות מן הזחלים.
8. לנתח את בלוטות המין של 25 DPF זחלי כמתואר בשלבים 2.1 - 2.7.

3. פרוטוקול 2: לנתח ביטוי גנים של רקמות האשכים המבודדות

1. חלץ RNA הכולל רקמות אשכי הזחל.
   1. העברת רקמות אשכים המבודדות עד 1 חדש RNase חינם.5 מ"ל צינור ולהסיר בתמיסת רינגר. להוסיף 100 פתרון תמס μL. וורטקס עד הרקמות הם lysed לחלוטין.
   2. בצע את הליך חילוץ RNA הכולל על פי הוראות היצרן.
   3. להוסיף 1/10 נפח DNase 10x ואני חיץ 1 μL של DNase אני לפתרון RNA ומערבבים בעדינות. דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   4. הוספת ריאגנט איון DNase 1/10 נפח לפתרון RNA. דגירה של 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. מדדו את הריכוז של RNA הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
2. בצע סינתזה cDNA הראשון גדיל
   1. השתמש אוליגו (DT) תחל -linker לבצע סינתזה cDNA הראשון גדיל בעקבות פרוטוקול של ייצור. להוסיף 1 עד 2 מיקרוגרם של RNA לנפח התגובה הכולל 20 μL.
   2. דגירת פתרון התגובה עבור 90 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. לסיים את התגובה על ידי חימום על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   3. להוסיף 1 μL RNase H אל cDNA כךlution להסרת RNA שיורית. מערבבים בעדינות צנטריפוגות במשך 10 שניות על ~ 13,000 g x. דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 20 μl מים חינם nuclease. חנות ב -70 מעלות צלזיוס.
3. בצע פלורסנט PCR כמותי
   1. בצעו qPCR על מערכת Cycler עם צבע פלואורסצנטי. השתמש תנאי אופני PCR הבאים: 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 s, C ° TM-5 עבור 15 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 30 s. השתמשו רצפים פריימר כדלקמן: AMH (FWD: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (FWD: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (FWD: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), ושה (FWD: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) ו β-אקטין (FWD: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) ^19.

תוצאות

והניתוחים של בלוטות המין בוצעו על דג הזברה הזחל זן AB. איור 1 מציג רקמת האשכים טיפוסית של דג הזברה הזחל ב 17 DPF ו 25 DPF. ראשית, העור והשרירים של צד אחד של הבטן הוא חתכו לחשוף את האיברים הפנימיים. לאחר הסרת המסה של איברים פנימיים, בשלפוחית ​​...

Discussion

דג הזברה הפכה מודל עוצמה והוא משמש באופן נרחב בפיתוח ומחקר הקשורות למחלה. השיטות לבידוד איברי דג זברה מבוגרת כגון מוח, לב, בלוטת מין, ו בכליות, תועדו היטב ^{23, 24, 25.} בשל גודלו הקטן שיפוץ דינמי של הרקמות האשכים של דג הזברה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish 100 mm	Corning	430167	For embryo incubation
20x EM			For a 1 L needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl·2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4·7H2O.
1x EM			Dilute 20x EM in distilled water
AGAROSE G-10	Gene	121985	For preparing the 2% agar plates
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026	For RNA isolation
Meter glass	Shen Bo	250 ml	For preparing the 2% agar plates
Microwave Oven	Midea	M1-211A	For heating the AGAR
Tweezer DUMONT#5INOX	World Precision Instrument	500341	For dissection
Stereomicroscope	Motic	SMZ168	For dissection
Pure water equipment	Millipore
Ringer’s solution			For a 1 L needed: Add 6.78 g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette	Samco	202, 204
Metal bath	QiLinbeier		Model GL-150
Microscope	Leica	M205 FA	For photomicrograph
Centrifuge	Eppendorf	5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	For DNA digestion in the RNA solution
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	For first-strand cDNA synthesis
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	This product is a Taq DNA polymerase-based 2x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer	Ne Drop	OD-2000+	Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 Hamburg	gene expression profiling