Вскрытие Личинки данио гонадная ткани

Резюме

Здесь мы приводим протокол для выделения гонад ткани личиночного данио, что облегчит исследования данио половой дифференциации и обслуживание.

Аннотация

Хотя дикие данио обладают / ZW определением пола ZZ, одомашненные данио потеряли половую хромосому. Они используют полигенную систему определения пола, где несколько генов, распределенных по всему геному совместно определяют половые тождества отдельных рыб. В настоящее время гены участвуют в регуляции развития гонад и как они работают остаются неуловимыми. Как правило, выделение гонадной ткани является первым шагом изучить половые процессы развития. Здесь мы представляем процедуру, чтобы изолировать гонады ткани от 17 дения (дней после оплодотворения) и 25 DPF данио личинок. Изолированная гонадная ткань может быть затем изучена с помощью морфологии и экспрессии генов профилирования.

Введение

Основным фактором , определяющим женского пола в диком данио хромосоме 4 теряется или изменяется в одомашненных данио (например , общие штаммы лаборатории) ^1. Вместо этого они имеют полигенную систему определения пола сопровождается экологическими факторами, такие как температура, гипоксия, наличие пищи и плотность населения. Детальные механизмы развития данио пола до конца не изучены. Фундаментальные вопросы , такие как , когда происходит данио определение пола, что основной сигнал определения пола (ы) является / являются, и какие гены регулируют первый шаг преобразования гонад остаются не заполнено ^{2, 3.}

В процессе развития данио пола, несколько важных этапов были признаны. На ранней стадии развития, начиная с 4 часов после оплодотворения (ч после оплодотворения) эмбриональные-клетки (ПКА) претерпевают спецификации, переход к генитальному хребту ипролиферация. PGC число и взаимные взаимодействия между зародышевыми клетками и соматическими клетками имеют важное значение для дифференциации гонад ^4. В 13 денье (дней после оплодотворения), гонады находятся в недифференцированной стадии. К 17 денье, гонады развиваются в два раза потенциальных яичников у обоих будущих самок и самцов. Апоптоз-зависимый переход от яичника к семеннику начинается с 21 до 25 дения и может продолжаться в течение нескольких недель. К 35 денье, пол гонады была определена и секс конкретного производства гамет ведется в обоих яичников и семенников ^{5, 6, 7.}

На сегодняшний день, были предложены различные гены и механизмы определения пола кандидатов. Протеомика и анализ транскриптомного выделили множество генов с половым диморфизмом экспрессией и эти гены были использованы для изучения половой дифференциации в данио ^{8, 9, 10.} Например, в личиночной данио, ген cyp19a1a специфически экспрессируется в яичниках , но не в семенниках ^{11, 12.} Кроме того, ген АМГА слабо выражен в овариальных фолликулах зернистых клеток, но сильно в клетках Сертоли семенников ^13. В противоположность этому , ген васа непрерывно выражается в зародышевых клетках как женского и мужского данио, что делает его подходящим маркером гонад ^{14, 15.}

Исследование гонадных уровней экспрессии генов важно понять молекулярный механизм определения пола и дифференциации , особенно в би-потенциал яичников стадии ^{3, 9.} Однако небольшой размер личиночной данио и, соответственно, мелких гонад осложнить изоляцию gonadaл ткани для дальнейшего молекулярного анализа. Предыдущие исследования использовали расчлененные весь регион магистрального между opercula и анальной порой ^16. Этот препарат, хотя, содержащие гонады, состоит из нескольких тканей и органов. Альтернативно, трансгенные животные с выражением GFP гонад специфические , такие как Vasa: были использованы EGFP для изоляции гонадной ткани с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS) и лазерного захвата микро-рассечение ^{17, 18.} Но их широкое применение ограничено. Здесь мы опишем простую процедуру, чтобы изолировать гонад ткани от личиночной данио в 17 денье и 25 денье. Мы демонстрируем позицию гонад по отношению к другим органам и изолировать морфологический интактные гонады от окружающих тканей. Мы также показываем , гонады специфических генов , такие как Vasa и cyp19a1a высоко выражены в изолированных гонадах по сравнению с магистральной тканью через количественный ПЦР (КПЦР) анализа. Настоящий протокол позволяет идентификации, выделения, очистки РНК и амплификации специфических генов гонад из личиночной данио, тем самым позволяя последующего молекулярного анализа гонадной ткани ^19.

протокол

Эксперименты рыбок данио утверждены Институциональный уходу и использованию животных комитета Fudan Университетской. Рерио были подняты и разводят в соответствии со стандартными процедурами ^20.

1. Подготовка

1. Выращивают 17 DPF и 25 DPF личиночной данио
   1. Передача 2 мужчин и 2 взрослые женщины данио (здоровые, от 3 до 6 месяцев, лаборатория Аб Стрейн) в резервуар пересечения во второй половине дня до дня пересечения. Отдельные самцы и самки с барьером. На следующее утро, обновить резервуар для воды и удалить барьер, чтобы дать им возможность спариваться. Сбор яиц в 100 Мм Петри Петри 1 до 2 ч после оплодотворения.
   2. Хранить около 40 эмбрионов в 100 мм пластины с 40 мл среды эмбриона (ЭМ) при 28,5 ° C в течение раннего периода развития (4 дня) и обновить EM два раза в день. Передача личинок в 1 л танков (40 личинок в 300 мл воды в системе) и кормить с живыми коловраток (полный питания, два раза в день) после того, как 5 денье.Поток живой артемии вместо коловратки диеты после 10 дения. Перенести рыбу в рециркуляции воды системы в 14 денье , ^21.
   3. Повысить личиночный данио~d в рециркуляции водной системы до 17 дения или 25 дения. Убедитесь, что цикл свет / темнота в 14/10 ч и рН значение системы воды составляет около 7,2. Измерьте длину тела 17 дения ( от 5,5 до 6,8 мм) и 25 дения ( от 8 до 11 мм) ²² личинок.
2. Приготовьте 2% агар для рассечения.
   1. Добавить 4 г агара к 200 мл стерильной воды. Смесь нагревают в микроволновой печи, пока он не станет прозрачным.
   2. Охлаждают раствор агара в течение приблизительно 15 мин, а затем залить его в 60 мм в диаметре чашки Петри (приблизительно 1/3 объема пластины). Хранить затвердевший агар при температуре 4 ° С.

2. Протокол 1: Рассеките гонадные ткани 17 и 25 DPF Личинки

1. Добавить измельченный лед в бак обезболить 17 личинок DPF. Передачаанестезировали личинки до 100 мм охлажденных чашек Петри с раствором 30 мл охлажденного Рингера. Хранить рыбу инкубировали в растворе охлажденного Рингера в течение по крайней мере 15 минут, чтобы полностью обезболить личинки.
2. Передача личинок к предварительно охлажденной агаровой пластине с небольшой пластиковой ложкой. Погрузите все тело рыбы в 10 мл охлажденный раствор Рингера и аккуратно положите его на бок.
3. Выполните следующие действия в соответствии с видением поля 25X стерео микроскопа. Закрепить ствол рыбы с помощью пинцета для стабилизации. Rip брюшка в продольном направлении от заднего прохода к сердцу с другим пинцетом. Аккуратно снимите кожу и мышцы на одной стороне тела, чтобы выставить внутренние органы.
4. Снимите массу органов вентральных в плавательном пузыре тщательно. Избегайте повреждение гонады, прикрепленную к плавательному пузырю.
5. Отрезать связь между плавательным пузырем и передней тела. Вытянуть весь плавательный пузырь и гонады ткани мягко.
   Примечание: В большинстве случаевс, гонадная ткань в 17 дении содержит окружающую эпителиальную ткань и protonephridium. Они не легко отделяются друг от друга, но в 25 денье, он может быть легко отделена. Гонад также подключен к анусу. Сочленение с левой и правой гонады соединены друг с другом на заднем проходе будет отчетливо виден.
6. Используйте пинцет, чтобы аккуратно отделить гонады ткани от плавательного пузыря и очистить окружающие ткани жировой ткани.
7. Сразу передачи выделенной гонадной ткани на prechilled 1,5 мл центрифужной пробирки, содержащей 200 мкл раствором Рингера. Держите трубку на льду, пока все гонад ткани не отделяются от личинок.
8. Проанализируйте гонадах 25 DPF личинок, как описано в пунктах 2.1 - 2.7.

3. Протокол 2: Анализ экспрессии генов обособленных гонадных ТКАНЕЙ

1. Экстракт тотальной РНК из личиночных тканей гонад.
   1. Передача изолированных гонадных тканей к новому РНКазы 1.5 мл трубки и удалить раствор Рингера. Добавьте 100 мкл раствора для лизиса. Вихревой до тканей полностью лизированы.
   2. Выполните полную процедуру экстракции РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
   3. Добавить 1/10 объема 10х ДНКазы I буфера и 1 мкл ДНКазы I к решению РНК и осторожно перемешать. Инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С.
   4. Добавьте 1/10 объема реагента ДНКазы инактивации в растворе РНК. Инкубируют в течение 10 мин при 70 ° С. Измерение концентрации общей РНК с использованием спектрофотометра. Хранить при -20 ° C.
2. Выполнение первой цепи синтеза кДНК
   1. Используйте олиго (дТ) линкер праймера для выполнения первой цепи кДНК синтеза в соответствии с протоколом изготовления. Добавить 1 до 2 мкг РНК до общего объема реакционной до 20 мкл.
   2. Инкубируйте реакционный раствор в течение 90 мин при 45 ° C. Завершение реакции при нагревании при температуре 70 ° С в течение 5 мин.
   3. Добавить 1 мкл РНКазы H в кДНК такlution для удаления остатков РНК. Осторожно перемешать и центрифугировать в течение 10 с при ~ 13000 х г. Инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С. Добавьте 20 мкл нуклеазы свободной воды. Хранить при температуре -70 ° С.
3. Выполните флуоресцентный количественный ПЦР
   1. Выполните КПЦР в системе ЦИКЛОВАТЕЛЯ с флуоресцентным красителем. Используйте следующие ПЦР условия велосипедного: 35 циклов при 95 ° С в течение 15 с, Tm-5 ° C в течение 15 с, 68 ° С в течение 30 с. С помощью праймеров последовательностей следующим образом : АМГ (Fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; REV: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (Fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; REV: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (вперед: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; REV: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), васа (вперед: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; REV: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) и β-актина (вперед: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; REV: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) ^19.

Результаты

Рассечений гонад были выполнены на Аб Стрейн личиночной данио. На рисунке 1 показана типичная гонадной ткани личиночной данио в 17 денье и 25 денье. Во-первых, кожа и мышцы одной стороны живота разрезают, чтобы обнажить внутренние органы. После удаления м?...

Обсуждение

Данио стал мощной моделью и широко используется в разработках и исследовании заболеваний, связанные с. Методы выделения органов у взрослых данио , таких как мозг, сердце, гонады и почки, были хорошо документированы ^{23, 24, 25.} Из-за небольшо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish 100 mm	Corning	430167	For embryo incubation
20x EM			For a 1 L needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl·2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4·7H2O.
1x EM			Dilute 20x EM in distilled water
AGAROSE G-10	Gene	121985	For preparing the 2% agar plates
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026	For RNA isolation
Meter glass	Shen Bo	250 ml	For preparing the 2% agar plates
Microwave Oven	Midea	M1-211A	For heating the AGAR
Tweezer DUMONT#5INOX	World Precision Instrument	500341	For dissection
Stereomicroscope	Motic	SMZ168	For dissection
Pure water equipment	Millipore
Ringer’s solution			For a 1 L needed: Add 6.78 g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette	Samco	202, 204
Metal bath	QiLinbeier		Model GL-150
Microscope	Leica	M205 FA	For photomicrograph
Centrifuge	Eppendorf	5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	For DNA digestion in the RNA solution
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	For first-strand cDNA synthesis
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	This product is a Taq DNA polymerase-based 2x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer	Ne Drop	OD-2000+	Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 Hamburg	gene expression profiling