Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolamento de tecido gonadal dos peixes-zebra larval, o que irá facilitar as investigações de diferenciação sexual peixe-zebra e manutenção.

Resumo

Embora peixe-zebra selvagem possuem um / ZW sistema de determinação do sexo ZZ, peixe-zebra domesticados perderam do cromossoma sexual. Eles utilizam um sistema de determinação do sexo poligénica, onde vários genes distribuídos ao longo do genoma determinar colectivamente as identidades do sexo de cada peixe. Atualmente, os genes envolvidos na regulação do desenvolvimento das gônadas e como eles funcionam ainda imperceptíveis. Normalmente, o isolamento de tecido gonadal é o primeiro passo para examinar os processos de desenvolvimento sexuais. Aqui, nós apresentamos um processo para isolar tecido gonadal de 17 dpf (dias após a fertilização) e 25 dpf larvas de peixe-zebra. O tecido gonadal isolado pode ser posteriormente examinada por morfologia e a expressão do gene de perfis.

Introdução

O principal determinante do sexo feminino em selvagem cromossoma peixe-zebra 4 for perdido ou modificado no peixe-zebra domesticado (por exemplo estirpes de laboratório comuns) ^1. Em vez disso, eles têm um sistema de determinação do sexo poligénica acompanhados por factores ambientais tais como a temperatura, a hipoxia, a disponibilidade de alimentos e densidade populacional. As modalidades específicas do desenvolvimento sexual peixe-zebra não são totalmente compreendidos. As questões fundamentais, tais como quando a determinação do sexo do peixe-zebra ocorre, o que o sinal de determinação do sexo primário (s) é / são, e que os genes regulam o primeiro passo de transformação das gónadas permanecem sem resposta ^{2, 3.}

No processo de desenvolvimento sexual peixe-zebra, várias etapas importantes foram reconhecidos. Na fase inicial de desenvolvimento, a partir de 4 HPF (horas após a fertilização) células germinativas primordiais (PGCs) submeter a especificação, a migração para e crista genitalproliferação. Números PGC e interacções recíprocas entre as células germinativas e células somáticas são importantes para a diferenciação gonadal ^4. Aos 13 dpf (dias após a fertilização), as gónadas estão em fase indiferenciada. Por 17 dpf, as gônadas desenvolver em bi-potenciais ovários em ambos os sexos futuras. A transição dependente de apoptose a partir de ovário de testículo começam em 21 a 25 dpf e pode continuar durante várias semanas. Por 35 dpf, o sexo da gónada foi determinada e a produção de gâmetas específicos do sexo está em curso em ambos os ovários e de testículos de ^{5, 6, 7.}

Até à data, diversos genes e os mecanismos de determinação do sexo candidatos têm sido propostos. Proteomics e análise do transcriptoma isolaram muitos genes com expressão dimorfismo sexual e estes genes foram utilizados para estudar diferenciação sexual em peixes-zebra ^{8, 9, 10.} Por exemplo, no peixe-zebra larval, o gene cyp19a1a é especificamente expresso no ovário mas não no testículo ^{11, 12.} Além disso, o gene AMH é fracamente expressa nas células da granulosa de folículos do ovário, mas fortemente em células de Sertoli de testículos ^13. Em contraste, o gene de vasa é continuamente expressa nas células germinativas de ambos peixe-zebra macho e fêmea, tornando-o um marcador adequado gonadal ^{14, 15.}

Investigar os níveis de expressão do gene gonadais é fundamental para compreender o mecanismo molecular de determinação e diferenciação sexual, especialmente na fase de ovário bi-potencial ^{3, 9.} No entanto, o pequeno tamanho do peixe-zebra larval e, correspondentemente, pequenas gónadas complicam o isolamento da gónadal tecido para outras análises moleculares. Estudos anteriores usados dissecado região do tronco inteiro entre o opercula e poros anal ^16. Esta preparação, embora contendo gónadas, consiste em vários tecidos e órgãos. Em alternativa, os animais transgénicos com expressão da GFP específica para-gonadal, tais como vasa: EGFP foram usadas para o isolamento de tecido gonadal através de células activadas por fluorescência (FACS) e captura de laser de micro-dissecção ^{17, 18.} Mas a sua aplicação generalizada é limitado. Aqui, descrevemos um procedimento simples para isolar o tecido gonadal dos peixes-zebra larval em 17 dpf e 25 dpf. Nós demonstramos a posição das gónadas no que diz respeito a outros órgãos e isolar as gónadas morfologicamente intactas a partir dos tecidos circundantes. Mostramos ainda mais os genes específicos de gónadas, tais como vasos e cyp19a1a são altamente expresso nas gônadas isolado em comparação com o tecido do tronco por meio de PCR quantitativa (qPCR) análise. O presente protocolo permite a identificação, o isolamento, a purificação de ARN e amplificação de genes específicos gonadais de peixe-zebra larval, permitindo assim a análise molecular subsequente de tecido gonadal ^19.

Protocolo

experiências peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Fudan. Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com os procedimentos padrão ^20.

1. Preparações

1. Cultivar a 17 dpf e 25 dpf peixe-zebra larval
   1. Transferência 2 do sexo masculino e 2 do peixe-zebra adultos do sexo feminino (saudável, 3 a 6 meses de idade, a estirpe de laboratório AB) para um tanque de passagem no final da tarde do dia antes do cruzamento. Separar os machos e fêmeas com uma barreira. Na manhã seguinte, atualizar a água do tanque e remova a barreira para permitir-lhes para acasalar. Coleta de ovos em 100 mm placas de Petri de 1 a 2 horas após a fertilização.
   2. Mantenha a cerca de 40 embriões numa placa de 100 mm, com 40 mL de meio de embrião (EM) a 28,5 ° C durante o período de desenvolvimento inicial (dia 4) e atualizar a EM duas vezes por dia. Transferência das larvas para tanques 1 L (40 larvas para 300 mL de água) e sistema alimentar com rotíferos vivos (alimentação total, duas vezes por dia) após a 5 dpf.Alimente camarão de água salgada ao vivo em vez de dieta rotíferos após 10 dpf. Transferir o peixe em água do sistema de recirculação em 14 dpf ^21.
   3. Elevar peixe-zebra larval no sistema de água de recirculação até 17 dpf ou 25 dpf. Assegurar o ciclo de luz / escuro de 14/10 h é e valor de pH de água do sistema é de cerca de 7,2. Medir o comprimento de corpo de 17 dpf (5,5-6,8 mm) e 25 dpf (8 a 11 mm) ²² larvas.
2. Preparar 2% placas de agar para a dissecção.
   1. Adicionar 4 g de agar a 200 mL de água estéril. Aqueça a mistura em um forno de microondas até que fique transparente.
   2. Arrefece-se a solução de agar durante cerca de 15 min, depois despejar 60 mm de diâmetro placas de Petri (aproximadamente 1/3 do volume da chapa). Armazenar as placas de agar solidificadas a 4 ° C.

2. Protocolo 1: Dissecar o tecido gonadal de 17 e 25 dpf Larvas

1. Adicione gelo picado para o tanque para anestesiar 17 larvas dpf. transferir olarvas anestesiados para um 100 mm refrigeradas placa de Petri com solução de 30 ml de solução fria de Ringer. Manter o peixe incubadas em solução de Ringer geladas durante pelo menos 15 min para anestesiar completamente as larvas.
2. Transferência das larvas para uma placa de ágar pré-arrefecida com uma pequena colher de plástico. Submerge todo o corpo do peixe em 10 mL refrigeradas solução de Ringer e suavemente colocá-lo sobre o seu lado.
3. Fazer as seguintes operações sob o campo de visão do 25X microscópio estéreo. Prender o tronco peixe com uma pinça para estabilização. Rasgar o abdômen longitudinalmente a partir do ânus para o coração com outro par de pinças. Remova cuidadosamente a pele e os músculos de um lado do corpo para expor os órgãos internos.
4. Retire a massa de órgãos ventral à bexiga natatória com cuidado. Evitar danos na gónada ligado à bexiga natatória.
5. Cortar a ligação entre a bexiga natatória e corpo anterior. Retire toda a bexiga natatória e tecido gonadal suavemente.
   NOTA: Na maioria dos casoss, o tecido gonadal em 17 dpf contém circundante tecido epitelial e protonephridium. Eles não são facilmente separadas uma da outra, mas a 25 dpf pode ser facilmente separada. O gonadal também está ligado ao ânus. A junção com gônada esquerda e direita ligados uns aos outros no ânus será claramente visível.
6. Utilizar uma pinça para separar cuidadosamente o tecido gonadal da bexiga natatória e limpar os tecidos adiposos adjacentes.
7. Imediatamente transferir o tecido gonadal isolado para um tubo de centrífuga previamente arrefecido de 1,5 ml contendo solução de 200 ul da campainha. Manter o tubo em gelo até que todos os tecidos gonadais são separados a partir das larvas.
8. Dissecar as gónadas de 25 dpf larvas, tal como descrito nas etapas 2.1 - 2.7.

3. Protocolo 2: Analisar Gene Expression dos isolados tecidos Gonadais

1. Extrair o ARN total a partir dos tecidos gonadais larvares.
   1. Transferir os tecidos gonadais isolado para uma nova isenta de RNase 1.5 mL de tubo e remover a solução de Ringer. Adicionar 100 de solução de lise. Vortex até que os tecidos são completamente lisadas.
   2. Executar o procedimento da extracção total de ARN de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Adicionar 1/10 volume de 10x ADNase I de tampão e 1 mL de ADNase I para a solução de ARN e misturar suavemente. Incubar durante 20 min a 37 ° C.
   4. Adicionar 1/10 volume de reagente de inactivao de DNase à solução de ARN. Incubar durante 10 min a 70 ° C. Medir a concentração do ARN total utilizando um espectrofotómetro. Armazenar a -20 ° C.
2. Realizar a síntese de ADNc de primeira cadeia
   1. Usar um-ligante iniciador oligo (dT) para realizar a síntese da primeira cadeia de cDNA, seguindo o protocolo do fabricante. Adicionar 1 a 2 ug de RNA para um volume total de reacção de 20 uL.
   2. Incubar a solução de reacção durante 90 minutos a 45 ° C. Terminar a reacção por aquecimento a 70 ° C durante 5 min.
   3. Adicionar 1 mL de ARNase H para o cDNA assimlução para remover o ARN residual. Misturar suavemente e centrifuga-se durante 10 s a 13000 x g ~. Incubar durante 20 min a 37 ° C. Adicionar 20 ul de água livre de nuclease. Armazenar a -70 ° C.
3. Executar PCR quantitativa fluorescente
   1. Execute qPCR em um sistema cycler com um corante fluorescente. Use as seguintes condições de ciclos de PCR: 35 ciclos a 95 ° C durante 15 s, Tm-5 ° C durante 15 s, 68 ° C durante 30 s. Use sequências iniciadoras como se segue: a HAM (Fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (Fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (Fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (Fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) e β-actina (Fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) ^19.

Resultados

Dissecções das gónadas foram realizadas na AB strain peixe-zebra larval. A Figura 1 mostra tecido gonadal típico de peixe-zebra de larvas no 17 dpf e 25 dpf. Em primeiro lugar, a pele e os músculos de um lado do abdômen é cortado para expor os órgãos internos. Depois de retirar a massa dos órgãos internos, a bexiga natatória, juntamente com a gônada permanecer no tronco. O gonadal foi ligado ao lado ventral da bexiga natatória (seta na

Discussão

O peixe-zebra tornou-se um modelo poderoso e é amplamente utilizado no desenvolvimento e investigação relacionada com a doença. Os métodos para o isolamento de órgãos no peixe-zebra adulto, tais como tumores do cérebro, coração, gônadas e rim, foram bem documentados ^{23, 24, 25.} Devido ao pequeno tamanho e remodelação dinâmica dos tecidos gonadais no peixe-zebra larval, o isolamento de tecido gonadal é uma tarefa ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish 100 mm	Corning	430167	For embryo incubation
20x EM			For a 1 L needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl·2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4·7H2O.
1x EM			Dilute 20x EM in distilled water
AGAROSE G-10	Gene	121985	For preparing the 2% agar plates
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026	For RNA isolation
Meter glass	Shen Bo	250 ml	For preparing the 2% agar plates
Microwave Oven	Midea	M1-211A	For heating the AGAR
Tweezer DUMONT#5INOX	World Precision Instrument	500341	For dissection
Stereomicroscope	Motic	SMZ168	For dissection
Pure water equipment	Millipore
Ringer’s solution			For a 1 L needed: Add 6.78 g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette	Samco	202, 204
Metal bath	QiLinbeier		Model GL-150
Microscope	Leica	M205 FA	For photomicrograph
Centrifuge	Eppendorf	5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	For DNA digestion in the RNA solution
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	For first-strand cDNA synthesis
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	This product is a Taq DNA polymerase-based 2x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer	Ne Drop	OD-2000+	Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 Hamburg	gene expression profiling