Scaling של שתלי כלי דם שהונדס בשיטות מדריכי 3D מודפס ואת שיטת נחת הטבעת

Summary

כלי דם מהונדסים Scalable ישפרו ישימות קליניות. באמצעות מדריכי 3D מודפס ניכרים בקלות, טבעות של שריר חלק בכלי דם נוצרו ומוערמות לצורה צינורי, ויצרו שתל וסקולרית. שתלי יכול להיות בגודל כדי לענות על המגוון של ממדים עורקים אנושיים כלילית פשוט על ידי שינוי גודל המדריך מודפס 3D.

Abstract

מחלת עורקים כלילית נשאר הגורם המוביל למוות, להשפיע על מיליוני אמריקאים. עם חוסר שתלי כלי דם עצמי זמין, שתלים מהונדסים מציעים פוטנציאל גדול עבור טיפול בחולים. עם זאת, שתל כלי דם מהונדס הם בדרך כלל לא ניתן להרחבה בקלות, מחייב וייצור של תבניות מותאמות אישית או צינורות פולימר כדי להתאים לגדלים שונים, המהווים זמן רב ויקר בפועל. עורקי אדם נעו בקוטר לומן מכ 2.0-38 מ"מ עובי קיר מכ 0.5-2.5 מ"מ. יצרנו שיטה, הכינה "שיטת נחת הטבעת", שבו טבעות בגודל משתנות של רקמות של סוג התא הרצוי, מפגינות כאן עם תאי שריר חלק בכלי דם (SMCs), ניתן ליצור באמצעות מדריכים של עמודים מרכזיים לשלוט בקוטר לומן ופצצות חיצוניות להכתיב עובי בדפנות כלי דם. טבעות רקמות אלה נערמים ואז ליצור מבנה צינורי, מחקה את הצורה הטבעית של כלי דם. אורך הכלי יכול בדואר מותאם על ידי פשוט לערום מספר הצלצולים נדרשו מהווה את האורך הדרוש. בעזרת הטכניקה שלנו, רקמות של צורות צינורי, בדומה כלי דם, יכולות להיות מיוצרות בקלות במגוון מידות ואורכות כדי לענות על הצרכים של המרפאה וסבלנית.

Introduction

בטיפול של מחלת לב כלילית (CAD), כלי שייט הדם של החולה עצמו נקצרים כחומר השתל עבור ניתוח מעקפים. עם זאת, לעתים קרובות, חולים אין כלי קיימא לתרום לעצמם, ובמקרים בהם הם עושים, האתר התורם גורם נזק נוסף ניכר ויש לו סיכון רציני לזיהום. ¹ שתלי כלי דם מהונדסים יכול למלא את הצורך הזה. מדרגיות היא בעל חשיבות עליונה עבור כלי הנדסה כדי לענות על המגוון הרחב של דרישות גודל כלי חולה. עם זאת, שיטות קיימות עבור כלי הנדסה אינן להרחבה בקלות, ובדרך כלל דורשות תבנה מחדש של תבניות מורכבות או פיגומי פולימר. רוב מהונדסים שתלי או לנצל פיגום צינורי פולימר כי הוא זרע עם פיברובלסטים וסקולרית, שריר חלק, או תאי אנדותל; או מתגלגל סדין בתא סביב mandrel ליצור צינור רקמות. שני שתלי כלי דם מהונדסים בניסויים קליניים מבוססים על decellularizeפלטפורמת הפולימר-ECM ד. ^{2, 3, 4} שתלי פולימר זמינים לשימוש תיקון כלי הדם כבר ידועים כבעלי בעיות עם patency, אשר יכולים להיווצר כנושא מרכזי עם יישום לטווח ארוך של השתל עם נוכחות פולימר מתמשכת. תבניות Tubular שמשו לפברק כולים הסלולר לחלוטין, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13} אשר נהלים ידרשו עיצוב נוסף וייצור כלי לתבניות מותאמות אישית כדי לייצר כלי במגוון גדל .

השיטה המתוארת במסמך מקיף שיטה חדשנית ליצירת כלי דם מהונדסים להרחבה בקלותשתלי באמצעות מוסיף להתאמה אישית מודפס 3D וצלחות התרבות המסורתית. ¹⁴ תאים הם זורעים לתוך צלחות עם מוסיף של דואר מרכזי ואת מעטפת חיצונית. הפקדים פוסט לומן בקוטר ומאפשרים בשכבת התא עצמית להרכיב לתוך טבעת של רקמות. העובי שולט מעטפת החיצוני של הטבעת, ובכך עובי דופן של הכלי הסופי. טבעות רקמות הושלמו נערמים מכן לטופס צינורי, שתל וסקולרית. היתרון בשיטה זו, המכונה "שיטת הנחת טבעת," היא כי לכל סוג תא חסיד ניתן זורעים לתוך ההגדרה צלחת וטבעות רקמות או צינורות בכל גודל הדרושים ליישום הרצוי יכול להיווצר רק על ידי הוספת מדריך שינוי. טכניקות השוואתיות בטבעות יצירת הנדסת רקמות של רקמות להישאר קשות בקנה מידה, ^{15, 16} מחייב תבנה מחדש של תבניות עבור כל בגודל רצוי. בנוסף, שתל כלי דם שנעשה בשיטה זו ניתן לייצרד ב 2-3 שבועות, כמה שבועות מהר לעומת כלי מהונדסים אחרים. ⁶ עבור המרפאה, התאמה הפעם יכול לעשות הבדל משמעותי בטיפול בחולה המידרדר.

Protocol

1. תא הכנת תרבות

1. לנצל לתאי שריר חלק אנושיים אב עורקים לרכוש מסחרי.
2. שמור על תאים בתקשורת צמיחת תאים שריר חלק מורכב 88.6% 231 התקשורת, 0.1% כל אחת של אינסולין אנושי רקומביננטי (RH-אינסולין), גורם גדילה פיברובלסטים אנושי רקומביננטי (RH-FGF), גורם הגדילה באפידרמיס אנושי רקומביננטי (RH-FGF), וחומצה אסקורבית; ו -5% בכל אחת בסרום שור העובר (FBS) ו- L-גלוטמין; ו 1% אנטיביוטי / antimycotic.
   הערה: כל גורם גדילה, FBS ו L- גלוטמין נרכשים כמו ערכת צמיחת תקשורת וסקולרית.
3. מדיה שינוי כל 48 שעות עד התאים הן כ -90% ומחוברות ומוכנים זריעת רקמות.
4. חנות תאים באינקובטור בין שינויי תקשורת להתרחבות.

2. הכנת הוספת 3D מודפס סיליקון אישית צלחות צורניות

1. השתמש במדפסת 3D מסחרית (למשל, Replicator מיני) עבור 3D ההדפסה מוסיפה הצלחת.
   1. השתמש open עיצוב תוכנת מקור 3D כגון בלנדר ליצור מודלי 3D של החיצוני פגזי הודעות המודפסים.
   2. לייצא את קובץ הנהג של המודל באמצעות פורמט .stl המאפשר ניידות אל התוכנה של מדפסת 3D.
   3. הפק הודעות מודפסות ופצצות חיצוניות באמצעות פולי (חומצה לקטית) נימה (PLA) נטענות לתוך מדפסת 3D.
   4. בעקבות דפוס, לבצע דקות 30 להשרות בתמיסת אתנול 70% -100% לעקר כל הוספה.
2. כן סוכן ריפוי 01:10 לבסס תערובת פולימר של פולי (dimethylsiloxane) פולימר סיליקון (PDMS) ולאפשר לתערובת דגה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
   1. הגדר גדלים בצלחת פטרי משמש קטן (35 מ"מ), בינוני (60 מ"מ), גדול (100 מ"מ).
   2. הוסף 2 מ"ל, 4 מ"ל ו -6 מ"ל של סיליקון דפוקה על כל צלחת קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה, וליצור שכבה דקה על פני כל תחתית של צלחת פטרי.
   3. צור פוסטים עבור הצלחת הקטנה על ידי שפיכת PDMS לתוךצלחת 100 מ"מ עד לגובה של 7 מ"מ ולאפשר לרפא על צלחת חמה ב 60 מעלות צלזיוס למשך כ 2-3 שעות. ואז להשתמש ביופסית 5 מ"מ לחבוט הודעות גליליות. להשתמש בכמות קטנה של PDMS דפוקה כדי לאבטח כל PDMS גליל וכדי במרכז כל צלחת קטנה.
   4. עבור הצלחות ביניים וגדולות, לפני להשלים ריפוי של PDMS בתחתית הצלחת, למקם את ההודעות מודפס 3D 10 מ"מ ו 20 מ"מ קוטר מרכזי לתוך כל הצלחות ביניים וגדולות, בהתאמה. עבור הצלחות הגדולות, בנוסף למקום מעטפת חיצונית מודפס 3D על 66.7 מ"מ equidistance בקוטר מהתפקיד.
      1. אפשר כל מנה לרפא באוויר הפתוח על פלטה חשמלית ב 60 מעלות צלזיוס למשך כ 2-3 שעות, מה שמאפשר 18 שעות עבור degassing של הפולימר. תקן רכיבים מודפסים לצלחת באזור הנאה והכיוון כפי שניתן לראות באיור 1.
   5. הוספת פתרון של אתנול 70% במים מזוקקים 30% במשך 30 דקות לחלק הפנימי של כל PLAtes עבור עיקור ולאחר מכן לכסות כל צלחת.
   6. בזהירות לשאוב אתנול כל צלחת ולאפשר לאוויר יבש.
   7. מסדרים בכל צלחת בארון בטיחות ביולוגית (BSC) ליד כלפי מעלה המכסה, שלה. לחשוף לוחות ומכסים לאור UV תחת BSC במשך 30 דקות כדי להשלים עיקור. טכניקה סטרילית מבוצעת עם כל צעד אחרי חשיפה לקרינת UV.

3. הכנת הידרוג הפיברין, מתזמן עם לתאי שריר חלק ותחזוקה של צלחות

1. מערבבי פתרון של ג'ל הפיברין המכיל מדיה צמיחה + 0.01%-β1 TGF בסכומים של 0.5 מיליליטר, 1.1 מיליליטר ו 1.81 מיליליטר עבור גדלי צלחת קטנים, בינוניים וגדולים, בהתאמה.
   1. הוסף 40 μL, 88.4 μL ו -145 μL של תרומבין, ממלאים של 100 U / mL, לכלי התקשורת של כל צלחת קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה. מערבולת בעדינות כל צלחת ביד כדי להבטיח תרומבין כי הוא מעורב באופן שווה בתוך התקשורת.
   2. לאחר מכן, להוסיף 1601; L, 354 μL ו 580 פיברינוגן μL, ממלאי של 20 מ"ג / מ"ל, טיפה חכם מעגלית לתערובת תרומבין-מדיה על כל צלחת קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה. מערבולת בעדינות ביד כדי להבטיח ערבוב והפצה של הידרוג'ל לתוך שכבה אחידה.
   3. אפשר הידרוג'ל לרפא במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
2. Trypsinize לתאי שריר חלק התרחבה צלחות תרבית תאים 150 מ"מ ו צנטריפוגות פי פרוטוקולים סטנדרטיים. הגלולה וכתוצאה מכך יש resuspended ב 3 מיליליטר של תקשורת בידול מורכבת של 98% - 231 תקשורת, FBS 1% לבין 1% אנטיביוטי / antimycotic.
   1. במרץ לערבב התאים על ידי titrating מעלה ומטה עם טפטפת 2 מ"ל להתפרק בכל גושי תאים. ספירת תאים עם hemocytometer וליצור ההשעיה תא של 2 x 10 ⁶ תאים / מ"ל, 1.0 x 10 ⁷ תאים / מ"ל ו 1.4 x 10 ⁷ תאים / מ"ל עבור צלחות קטנות, ביניים וגדולות, בהתאמה.
   2. הוסף 1 מ"ל של כל int ההשעיה תאOA מקביל 50 חרוטי מיליליטר שכותרתו קטן, בינוני וגדול. הגדרת חרוטים נוספים 50 מיליליטר בצורה הזו כל טבעת רקמה נוספת הרצויה.
   3. הוסף מדיה בידול לכל חרוטי להשיג כרכים זריעת סופי של 2 מ"ל, 4 מ"ל ו 5 מ"ל עבור כל ספינה קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה. ואז, בזהירות pipet את פתרון התא מבחינת ירידה על גבי הידרוג'ל המוכן בכל צלחת מקבילה.
   4. מקום צלחות לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
3. תקשורת בידול שינוי כל 48-72 שעות עבור כל צלחת. במקרה של הצלחת הגדולה, לשנות תקשורת בתחילה לאחר 24 שעות, ולאחר מכן לשנות את זה כל 48-24 שעות כדי לפצות על צפיפות זריעת תא הגדולה.
   1. לאחר 2-4 ימים המצלצלים יהיו נדבקו לחלוטין כלפי לכתוב, להוסיף 10 μL, 20 μL ו -35 μL של-β1 TGF לכל טבעת קטנה, בינונית וגדולה, בהתאמה. לאחר חשיפת TGF-β; 1 ל -24 שעות לפחות, טבעות מוכנות יטופל.

4. אסיפה של כלי דם לבנות ותחזוקה

1. לפני הייצור של מבנה כלי הדם הסופי, מכל מיוחד נוצר כדי להחזיק את הכלי הושלם.
   1. עבור כלי השיט הקטן, ליצור צלחת גבוהה לסידור טבעת על ידי חיתוך קטע 2 אינץ 'את החלק העליון של צינור חרוטי פוליקרבונט 50 מיליליטר, ואז PDMS מדביק את הקצה לחתוך לתוך צלחת 35 מ"מ. השתמש במכסת החרוטים כמו מכסת הצלחת.
   2. עבור הטבעת הגבוהה כלי ביניים וגדולים לערום צלחות, לחתוך צינור פוליקרבונט בקוטר 1.75 אינץ 'לתוך 2.5 סעיפי אינץ לאורכו לשמש קירות הצלחת הגבוהים. לקבלת תחתית הצלחת הגבוהה, לחתוך גיליון פוליקרבונט 0.125 אינץ 'בעובי לחתיכות מעגלות בקוטר 2 אינץ'. באמצעות מלט אקריליק ממס, לחייב את סעיף פוליקרבונט הצינור אל יצירת החתך העגולה. השתמש המכסה של צלחת פטרי 60 מ"מימ כמו המכסה על הצלחת הגבוהה.
   3. 3D pדפס הודעות 5, 10 ו 20 מ"מ בקוטר 50 מ"מ אורך.
   4. הוסף 10 מ"ל של סיליקון דפוקה לכל מיכל. לפני הריפוי המלא של PDMS, מרכזי למקם כל פוסט שנוצר בשלב 4.1.3 לתוך כל מכל קטן, בינוני, גדול.
   5. אפשר לרפא על סט צלחת חם עד 60 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות.
   6. לעקר עם תמיסה של אתנול 70% עם 30% מים מזוקקים במשך 30 דקות.
   7. בזהירות לשאוב אתנול כל מכולה ואז ולאפשר לאוויר יבש BSC. לאחר מכן, לארגן את המכולות בשכונה עם כל צלחת להציב ליד כלפי מעלה המכסה, שלה. לחשוף מכולות לאור UV תחת BSC עבור 30 דקות נוספות עבור עיקור נוסף. השתמש בטכניקה סטרילית עם כל צעד אחרי חשיפה לקרינת UV.
2. בעזרת מלקחיים יפים מאוד, להסיר בזהירות כל טבעת הידרוג'ל שריר חלק בחוזק התגלגלה מהמוצב שלה ולהעביר למכל הגדול יותר בהתאמה שלה עם ההודעות הגבוהות.
   1. השתמש זוגמלקחיים בכל יד ולהרים צד אחד של ההטבעה מהתפקיד, ואחר כך את השני. היזהר כדי להגן ולשמור על לומן.
   2. בצע את ההעברה עם השנייה זה שיטה ריקה, זזה תחילה בצד אחד, אז בצד השני של הטבעת על העמוד הגבוה. שימוש בתנועות עדינות, הדרגתיות, ועבודת circumferentially, לאט לדחוף את הטבעת כלפי מטה על העמוד הגבוה. בהמשך מחסנית טבעות רקמה עד אורך כלי הרצוי הושג, עם כל צלצול הוספת כ 1-2 מ"מ אורך כדי לבנות הושלמה.
3. עם ערימת הטבעת ממוקמת על ההודעות מודפסות 3D גבוהות, להפוך את הצלחת כך בפוסט מקביל עם משטח העבודה.
   1. שימוש micropipette, להוסיף 40, 80 ו -160 μL של תרומבין בריכוז של 100 U / mL בעדינות אל פני השטח החיצוניים של כל כלי שיט קטנים, בינוניים וגדולים, בהתאמה. תוך הוספת תרומבין, לאט לסובב את הצלחת כדי להבטיח אפילו כיסוי של כל המשטחים של המבנה.זה יהיה הבסיס עבור דבק הפיברין מנוצל כדי להבטיח את מבנה מחסנית טבעת בימים הראשונים שלאחר הבנייה.
   2. לאחר מכן, הוסף 40, 80 ו -160 μL של פיברינוגן בריכוז של 20 מ"ג / מ"ל ​​כל מבנה קטן, בינוני, גדול, בהתאמה, באמצעות micropipette בעוד סיבוב לבנות במהירות. תרומבין ו פיברינוגן להגדיר במהירות לג'ל שהיה מוצק מעורב. בשל הזמן הקצר ריפוי, להחיל את פיברינוגן במהירות שווה ככל האפשר.
4. הוסף 20 מ"ל של התקשורת בידול לכל מיכל מחזיק את המבנה. מקום כלי לתוך 37 ° C חממה עד הצורך. שינוי בתקשורת כל 3-5 ימים.

תוצאות

הפגן כאן הוא ייצור של 3 גדלי שתל שונים מהונדסים וסקולרית (איור 1), מראה כי שיטת נחת הטבעת (RSM) הוא ניתן להרחבה. כדי להוכיח את יישימות, 3 גדלים כלי שונים שנבחרו לתאם לגודל כלי האדם בפועל עבור השמאלי הקדמי היורד העורק (קטן; לומן בקוטר = 4 מ"מ)

Discussion

שיטת נחת טבעת מציג יתרונות רבים על פני שיטות לבנות רקמות מהונדסות וסקולרית נוכחיות. RSM ניתן להתאים ליצור כלי אנושי בכל גודל על ידי פשוט התאמה אישית של פגז הפוסט וחיצוני ממדים. השיטה שלנו מאפשרת התפתחות הכלים מהונדסים ללא פולימר המורכב אך ורק של תאים אנושיים במהירות מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody