A escala do Engineered enxertos vasculares Usando 3D Impresso Guides and the Ring método de empilhamento

Resumo

vasos sanguíneos engenharia escaláveis ​​iria melhorar a aplicabilidade clínica. Usando guias impresso-3D facilmente consideráveis, anéis de músculo liso vascular foram criados e empilhados para uma forma tubular, formando um enxerto vascular. Enxertos podem ser dimensionados para atender toda a gama de dimensões das artérias coronárias humanas, simplesmente mudando o tamanho guia impresso-3D.

Resumo

A doença arterial coronariana continua a ser uma das principais causas de morte, que afeta milhões de americanos. Com a falta de enxertos vasculares autólogos disponíveis, os enxertos de engenharia oferecem um grande potencial para o tratamento do paciente. No entanto, os enxertos vasculares de engenharia em geral, não são facilmente escaláveis, exigindo o fabrico de moldes de mercadorias ou tubos de polímero, de modo a personalizar a tamanhos diferentes, constituindo um demorado e dispendioso prática. artérias humanas variam em diâmetro luminal de cerca de 2,0-38 mm e espessura de parede de cerca de 0,5-2,5 mm. Criámos um método, denominado o "Anel método de empilhamento," em que os anéis de tamanhos variáveis ​​de tecido do tipo de célula desejado, aqui demonstrado com células do músculo liso vascular (CML), pode ser criada usando guias de postes centrais para controlar o diâmetro do lúmen e camadas externas de ditar a espessura da parede do vaso. Estes anéis de tecido são então empilhadas para criar uma construção tubular, que imita a forma natural de um vaso sanguíneo. O comprimento do vaso pode be adaptada por empilhamento simplesmente o número de toques necessários para constituir o comprimento necessário. Com a nossa técnica, os tecidos de formas tubular, semelhante a um vaso sanguíneo, pode ser facilmente fabricado numa variedade de dimensões e comprimentos para satisfazer as necessidades do paciente e clínica.

Introdução

No tratamento de doença arterial coronária (CAD), próprios vasos sanguíneos de um paciente são colhidas como material de enxerto para a cirurgia de bypass. No entanto, muitas vezes, pacientes doentes não têm vasos viáveis ​​para doar a si mesmos, e nos casos em que eles fazem, o local doador causa dano adicional considerável e tem um sério risco para a infecção. ¹ enxertos vasculares Engineered poderia preencher essa necessidade. A escalabilidade é de extrema importância para as embarcações de engenharia, a fim de satisfazer a vasta gama de requisitos de tamanho vaso do paciente. No entanto, os métodos actuais para os navios de engenharia não são facilmente escaláveis, e tipicamente requer refabrique de moldes complexos ou andaimes de polímero. A maioria engenharia enxertos quer utilizar um andaime tubular polímero que é semeada com fibroblastos, músculo liso vascular, ou células endoteliais; ou enrolamento de uma folha de células em torno de um mandril para criar um tubo de tecido. Dois enxertos vasculares artificiais nos ensaios clínicos são baseadas em um decellularized plataforma de polímero de ECM. ^{2, 3, 4} enxertos de polímero disponíveis para utilização na reparação vascular já são conhecidos por terem problemas com a permeabilidade, o que poderia surgir como um grande problema com aplicação a longo prazo de um enxerto com uma presença polímero sustentado. Moldes tubulares têm sido usados para fabricar completamente vasos celulares, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,} que os procedimentos que exigem adicional de design e fabricação de ferramentas para moldes personalizados, a fim de produzir navios em uma variedade de tamanhos .

O método aqui descrito envolve um nova técnica para criar vascular manipulado facilmente escaláveisenxertos usando inserções impressas em 3D customizáveis ​​e placas de cultura tradicionais. ¹⁴ As células são cultivadas em placas com inserções de um posto central e casca exterior. Os controlos pós de diâmetro de lumen e permite que a monocamada de células para auto-montar em um anel de tecido. A casca exterior controlos espessura do anel, e, assim, a espessura da parede do recipiente final. anéis de tecido concluídas são então empilhados para formar um tubular, enxerto vascular. A vantagem do presente método, o denominado "anel método de empilhamento," é que qualquer tipo de célula aderente pode ser semeadas em placa a configuração e anéis de tecido ou tubos, de qualquer tamanho necessário para a aplicação desejada pode ser gerada por simples modificação inserções guia. Técnicas comparativas em tecido anéis de engenharia Criação de tecidos permanecem difíceis de escala, ^{15, 16} requerendo remanufatura de moldes para cada tamanho desejado. Além disso, os enxertos vasculares feita utilizando este método pode ser produzird em 2-3 semana, várias semanas mais rápido em comparação com outros vasos de engenharia. ⁶ Para a clínica, este tempo de discrepância pode fazer uma diferença significativa no tratamento de um paciente deterioração.

Protocolo

1. Cultura de Células Preparação

1. Utilizar células musculares lisas da aorta humana adquiridos comercialmente.
2. células em meio de crescimento de células de músculo liso compostas de 88,6% Manter a 231 meios de comunicação, 0,1% cada de insulina recombinante humana (rh-insulina), factor de crescimento de fibroblastos humano recombinante (rh-FGF), factor de crescimento epidérmico humano recombinante (rh-FGF), e ácido ascórbico; e 5% de cada soro fetal de bovino (FBS) e L-glutamina; e 1% de antibiótico / antimicótico.
   NOTA: Cada factor de crescimento, de FBS e L-glutamina são adquiridas como um kit de meio de crescimento vascular.
3. Mudança de mídia a cada 48 horas, até que as células são cerca de 90% confluentes e pronto para a semeadura de tecidos.
4. células de loja em uma incubadora entre mudanças de suporte para a expansão.

2. Preparação de 3D Impresso Inserções e Silicone personalizado moldado Plates

1. Use uma impressora 3D comercial (por exemplo, Replicator Mini) para 3D imprimir as inserções de placas.
   1. use open software de design de fonte 3D, como Blender para criar os modelos 3D dos exteriores conchas e mensagens impressas.
   2. Exporte arquivo de driver do modelo através de um formato .stl permitindo a portabilidade para software da impressora 3D.
   3. Produzem mensagens impressas e camadas externas usando poli filamento (ácido láctico) (PLA) carregados na impressora 3D.
   4. Na sequência de impressão, execute a 30 minutos de molho em uma solução de etanol a 100% a 70% para esterilizar cada inserção.
2. Prepara-se uma agente de cura à base 01:10 mistura de polímeros de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) de polímero de silicone e permitir que a mistura para desgaseificar à temperatura ambiente durante 10 min.
   1. Definir tamanhos de petri prato utilizados como pequena (35 mm), intermediário (60 mm), e grande (100 mm).
   2. Adicionar 2 ml, 4 ml e 6 ml de silicone não curado para cada pequeno, médio e grande placa, respectivamente, e criar uma camada fina em todo o fundo da placa de Petri.
   3. Criar postos para a pequena placa por vazamento PDMS em um100 milímetros placa de uma altura de 7 mm e deixar curar numa placa quente a 60 ° C durante cerca de 2-3 horas. Em seguida, use um perfurador de biópsia de 5 mm para perfurar para fora mensagens cilíndricas. Usar uma pequena quantidade de PDMS não curado para fixar cada PDMS cilindro e para o centro de cada pequena placa.
   4. Para as placas intermédias e grandes, antes de completar a cura do PDMS na parte inferior da placa, colocar as mensagens impressas 3D 10 mm e 20 mm de diâmetro centralmente em cada um pratos intermédios e grandes, respectivamente. Para as grandes placas, adicionalmente, colocar um 3D impresso casca exterior cerca de 66,7 mm de diâmetro eqüidistância do post.
      1. Permitir que cada prato para curar ao ar livre numa placa quente a 60 ° C durante cerca de 2-3 horas, permitindo que 18 horas para a desgaseificação do polímero. Fix componentes impressos para a placa na região adequada e orientação, como visto na Figura 1.
   5. Adicionar uma solução de 70% de etanol com 30% de água destilada durante 30 minutos, para o interior de todos PLAtes para a esterilização e, em seguida, cobrir cada placa.
   6. Aspirar cuidadosamente o etanol a partir de cada placa e deixar secar ao ar.
   7. Arrume cada prato em uma cabine de segurança biológica (BSC) ao lado de sua tampa, virado para cima. Expor pratos e tampas à luz UV sob o BSC durante 30 minutos para completar a esterilização. técnica estéril é realizada a cada passo após a exposição UV.

3. Preparação de fibrina hidrogel, semeando com células musculares lisas e manutenção de placas

1. Misturar uma solução de gel de fibrina contendo meio de crescimento + 0,01% de TGF-β1 nas quantidades de 0,5 mL, 1,1 mL e 1,81 mL de tamanhos pequenos, intermediários e grande placa, respectivamente.
   1. Adicionar 40 ul, 88,4 uL e 145 uL de trombina, a partir de um stock de 100 U / ml, para os meios de comunicação de cada pequena, intermédia e de grande placa, respectivamente. Agite cuidadosamente cada placa à mão para garantir que a trombina é uniformemente misturado dentro da mídia.
   2. Em seguida, adicione 1601; L, 354 mL e 580 mL de fibrinogénio, de um estoque de 20 mg / mL, gota a gota circular à mistura de trombina-media a cada pequeno, médio e grande placa, respectivamente. Agite suavemente com a mão para assegurar a mistura e distribuição do hidrogel em uma camada uniforme.
   3. Permitir hidrogel curar durante 10-15 minutos à temperatura ambiente.
2. Tripsinizar as células musculares lisas expandido em placas de cultura de células de 150 mm e de centrífuga de acordo com protocolos padrão. O sedimento resultante deve ser ressuspenso em 3 mL de meio de diferenciação que consiste em 98% - 231 de suporte, 1% de FBS e 1% de antibiótico / antimicótico.
   1. Misture vigorosamente células titulando cima e para baixo com uma pipeta 2 mL para quebrar quaisquer aglomerados de células. Contar as células com um hemocitómetro e criar uma suspensão de células de 2 x 10 ⁶ células / ml, 1,0 x 10 ⁷ células / ml e 1,4 x 10 ⁷ células / mL para pequenas, intermediários e grandes placas, respectivamente.
   2. Adicionar 1 mL de cada int suspensão de célulasoa correspondente 50 mL cônica rotulado pequeno, médio e grande porte. Configurar um 50 mL cônico adicional desta forma para cada anel de tecido adicional desejado.
   3. Adicionar meios de diferenciação para cada cónica para se obter volumes de semeadura finais de 2 mL, 4 mL e 5 mL para cada pequeno, médio e grande vaso, respectivamente. Em seguida, pipeta com cuidado a solução de células gota a gota por cima do hidrogel preparado em cada uma das placas correspondente.
   4. Colocar as placas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
3. media de diferenciação mudam a cada 48-72 horas para cada placa. No caso de a placa maior, alterar meios inicialmente após 24 horas, em seguida, mudá-lo a cada 48-24 horas, para compensar a grande densidade de sementeira de células.
   1. Após 2-4 dias, como os anéis terá completamente contratado em direção ao poste, adicionar 10 mL, 20 mL e 35 mL de TGF-β1 a cada pequeno, médio e grande anel, respectivamente. Após a exposição a TGF-β; 1 durante pelo menos 24 horas, os anéis estão prontos para ser manuseado.

4. Montagem de Vascular Construir e Manutenção

1. Antes do fabrico do construto vascular final, de um recipiente especializado é criada para manter o recipiente preenchido.
   1. Para o pequeno recipiente, criar uma placa de alto para empilhamento anel cortando uma secção de 2 polegadas fora do topo de um tubo cónico de 50 ml de policarbonato, e, em seguida, cola-PDMS a borda de corte numa placa de 35 mm. Utilizar a tampa cónica como a tampa da placa.
   2. Para o navio anel de altura intermediária e grande empilhamento de placas, corte um tubo de policarbonato diâmetro de 1,75 polegadas para 2,5 polegadas seções longitudinalmente para servir como as paredes de chapa de altura. Para o fundo da placa de altura, corte uma folha de policarbonato 0,125 polegadas de espessura em pedaços círculo de diâmetro de 2 polegadas. Usando o acrílico cimento solvente, vincular a seção de tubo de policarbonato para a peça de corte circular. Utilizar a tampa de uma placa de Petri 60 milímetros como a tampa para o prato de altura.
   3. 3D pmensagens de Rint 5, 10 e 20 mm de diâmetro e 50 mm de comprimento.
   4. Adicionar 10 ml de silicone não curado em cada recipiente. Antes da cura completa do PDMS, coloque centralmente cada post criado no passo 4.1.3 em cada pequeno, médio e grande recipiente.
   5. Deixa-se curar em um conjunto de placa quente a 60 ° C durante 2-3 horas.
   6. Esteriliza-se com uma solução de etanol a 70% com 30% de água destilada durante 30 minutos.
   7. Aspirar cuidadosamente o etanol a partir de cada recipiente e depois deixar secar ao ar na BSC. Em seguida, organizar os recipientes na capa com cada placa colocada ao lado de sua tampa, virado para cima. Expor recipientes à luz UV sob o BSC para um período adicional de 30 minutos para mais de esterilização. Use técnica estéril a cada passo após a exposição UV.
2. Utilizando uma pinça muito finas, retire cuidadosamente cada anel hidrogel músculo liso bem enrolado do seu posto e transferir para o seu correspondente recipiente maior com as mensagens de altura.
   1. Use um par deforceps em cada mão e levantar um dos lados do anel do post, e depois o outro. Tenha o cuidado de proteger e manter o lúmen.
   2. Executar a transferência com este método de duas mãos, deslizando um primeiro lado, então o outro lado do anel para o poste de altura. Usando movimentos graduais suaves, e trabalhando em circunferência, empurre lentamente o anel para baixo para o cargo de altura. Subsequentemente empilhar anéis de tecido até que tenha sido obtido o desejado comprimento do navio, com cada anel adicionando aproximadamente 1-2 mm de comprimento para a construção concluída.
3. Com a pilha de anel posicionado sobre as mensagens impressas em 3D altas, virar a placa para que o post é paralelo com a superfície de trabalho.
   1. Usando uma micropipeta, adicionar 40, 80 e 160 mL de trombina a uma concentração de 100 U / mL suavemente para a superfície exterior de cada pequena, intermédia e grandes vasos, respectivamente. Enquanto a adição de trombina, rodar lentamente a placa para assegurar uma cobertura uniforme de todas as superfícies da construção.Isto irá ser a base para a cola de fibrina utilizado para fixar a construção de pilha anel nos dias iniciais após a construção.
   2. Em seguida, adicionar 40, 80 e 160 ul de fibrinogénio a uma concentração de 20 mg / mL a cada pequena, intermédia, e grande construto, respectivamente, utilizando uma micropipeta enquanto se rodam a construção rapidamente. A trombina e fibrinogênio definir rapidamente em um gel firme, uma vez misturado. Devido ao curto tempo de cura, aplicar o fibrinogénio mais rapidamente e mais uniformemente possível.
4. Adicionar 20 ml de meio de diferenciação para cada recipiente contendo a construção. vasos local em um 37 ° C incubadora até que seja necessário. Mudança de mídia a cada 3-5 dias.

Resultados

Demonstrada aqui é a fabricação de 3 tamanhos diferentes de engenharia vascular do enxerto (Figura 1), mostrando que o método de empilhamento Ring (RSM) é escalável. Para provar aplicabilidade, os 3 tamanhos diferentes vaso escolhido correlato ao tamanho real vaso humano para a artéria descendente anterior (pequeno; diâmetro luminal = 4 mm) ^17, aorta descendente (intermediário; diâmetro luminal = 10 mm) e aorta ascendente (grande; lúmen...

Discussão

The Ring método de empilhamento apresenta várias vantagens sobre engenharia de tecidos técnicas construto vasculares atuais. O RSM pode ser adaptado para criar vasos humanos de qualquer tamanho, simplesmente personalizar o post e casca exterior dimensões. O nosso método permite o desenvolvimento de vasos de engenharia isentos de polímero constituídas unicamente por células humanas e rapidamente degradar material de suporte encontrado em processo de cicatrização da ferida natural do corpo. enxertos de polímero...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody