Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

Zusammenfassung

Skalierbare engineered Blutgefäße würde klinische Anwendbarkeit zu verbessern. Mit leicht ansehnliche 3D-gedruckte Führer, Ringe der glatten Gefäßmuskulatur wurden in eine röhrenförmige Form erstellt und gestapelt, ein Gefäßtransplantat zu bilden. Die Transplantate können so bemessen sein, um den Bereich der menschlichen Koronararterie Dimensionen gerecht zu werden, indem einfach die 3D-gedruckten Führungsgröße zu verändern.

Zusammenfassung

Koronare Herzkrankheit bleibt eine Haupttodesursache, Millionen von Amerikanern beeinflussen. Mit dem Mangel an autologe Gefäßtransplantate zur Verfügung, bietet entwickeln Transplantate großes Potenzial für die Behandlung des Patienten. Allerdings sind dazu entworfen Gefßtransplantate im Allgemeinen nicht leicht skalierbar, erfordern Herstellung von kundenspezifischen Formen oder Polymerrohren, um verschiedene Größen anzupassen, eine zeitraubende und kostspielige Praxis bilden. Menschliche Arterien erstrecken sie im Lumendurchmesser von etwa 2,0 bis 38 mm und in der Wandstärke von etwa 0,5-2,5 mm. Wir haben ein Verfahren geschaffen, das „Ring-Stacking-Methode“ bezeichnet wird, in der variable Größe Ringe von Geweben der Zelltypen gewünscht wird, hier gezeigt mit vaskulären glatten Muskelzellen (SMCs), kann unter Verwendung von Führungen der Führungsstangen erzeugt wird Lumendurchmesser zu steuern, und Außenschalen Gefäßwanddicke zu diktieren. Diese Geweberinge werden dann mit einem rohrförmigen Konstrukt zu erzeugen gestapelt, um die natürliche Form eines Blutgefäßes nachahmt. Die Fahrzeuglänge kann be durch einfaches Stapeln der Anzahl der Ringe zugeschnitten erforderlich benötigt, um die Länge zu bilden. Mit unserer Technik, Gewebe von röhrenförmigen Formen, ähnlich einem Blutgefäß, kann leicht in einer Vielzahl von Abmessungen und Längen hergestellt werden, um die Bedürfnisse der Klinik und Patienten gerecht zu werden.

Einleitung

Bei der Behandlung der koronaren Herzkrankheit (KHK), eine eigene Blutgefäße des Patienten werden als Implantatmaterial für Bypass-Operation entnommen wurden. Doch oftmals, kranke Patienten haben keine tragfähige Schiffe selbst zu spenden, und in Fällen, in denen sie das tun, bewirkt, dass der Spenderstelle erheblichen zusätzlichen Schaden und hat ein ernsthaftes Risiko für eine Infektion. ¹ Engineered Gefäßtransplantaten könnte diesen Bedarf zu füllen. Skalierbarkeit ist von größter Bedeutung für das Engineering Schiffe, um die breite Palette von Patienten Gefäßgröße Anforderungen zu erfüllen. vorliegenden Verfahren für technische Gefäße sind jedoch nicht leicht skalierbar und erfordern in der Regel remanufacture von komplexen Formen oder Polymergerüsten. Die meisten engineered Transplantate entweder ein Polymer Rohrgerüst verwenden, die mit vaskulären Fibroblasten, glatten Muskelzellen oder Endothelzellen ausgesät wird; oder eine Zelle Blechrollen um einen Dorn einer Geweberohr zu schaffen. Zwei engineered Gefäßtransplantate in klinischen Studien basieren auf einer Dezellularisierend Polymer-ECM-Plattform. ^{2, 3, 4} Polymer - Transplantate zur Verwendung in der Gefäßreparatur verfügbar sind bereits zu haben Probleme mit der Durchgängigkeit bekannt, die als ein wichtiges Thema mit langfristigen Anwendung eines Transplantats mit einer anhaltenden Polymer Präsenz entstehen könnten. Rohrformen verwendet wurden vollständig zelluläre Gefäße herzustellen, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13} , die Verfahren der zusätzlichen Entwurfs- und Werkzeugherstellung für individuelle Formen benötigen , um würde Gefäße in einer Vielzahl von Größen zu produzieren .

Das beschriebene Verfahren umfasst hier eine neue Technik für leicht skalierbar engineered vaskulären SchaffungTransplantate anpassbare 3D-Druckplatten und traditionellen Kulturplatten verwendet wird. ¹⁴ Zellen werden in Platten mit Einsätzen aus einem zentralen Pfosten und Außenschale. Die post-Kontrollen Lumendurchmesser und ermöglicht die Zellschicht zur Selbstorganisation zu einem Ring von Gewebe. Die Außenschale steuert Dicke des Rings und somit Wandstärke des fertigen Behälters. Abgeschlossene Gewebe Ringe werden dann mit einem rohrförmigen, Gefäßtransplantat zu bilden, gestapelt. Der Vorteil dieser Methode, bezeichnet als die "Ring Stapelverfahren", ist, dass jede adhärenten Zelltyp in den Plattenaufbau und Gewebe Ringe oder Rohre jeder Größe, die für die gewünschte Anwendung ausgesät werden können, können durch einfaches Modifizieren Führungseinsätzen erzeugt werden. Vergleichstechniken im Tissue Engineering schaffen Ringe des Gewebes bleiben schwierig zu Skala, ^{15, 16} erfordern remanufacture von Formen für jede gewünschte Größe. Zusätzlich machte Gefäßtransplantate mit dieser Methode produzieren werden könnend in 2-3 Wochen, mehrere Wochen schneller im Vergleich zu anderen engineered Gefäßen. ⁶ Für die Klinik, diesmal Diskrepanz kann einen wesentlichen Unterschied in der Behandlung eines Patienten verschlechtert machen.

Protokoll

1. Zellkultur Vorbereitung

1. Nutzen Sie die menschliche Aorta-Glattmuskelzellen im Handel erworben.
2. Pflegen Zellen in Glattmuskelzellwachstumsmedium, bestehend aus 88,6% 231 Medien, jeweils 0,1% von rekombinantem Humaninsulin (rh-Insulin), rekombinanten humanen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (rH-FGF), rekombinanten humanen epidermalen Wachstumsfaktor (rH-FGF), und Ascorbinsäure; und jeweils 5% fötales Rinderserum (FBS) und L-Glutamin; und 1% Antibiotikum / Antimykotikum.
   HINWEIS: Jeder Wachstumsfaktor, FBS und L-Glutamin als Gefäß Medien Wachstum Kit erworben.
3. Ändern Medien alle 48 Stunden, bis die Zellen sind etwa 90% konfluent und bereit für die Gewebe Aussaat.
4. Shop-Zellen in einem Inkubator in zwischen Medienwechsel für die Expansion.

2. Herstellung von 3D-Druckeinsätze und kundenspezifische Silikon geformten Platten

1. Verwenden Sie einen kommerziellen 3D - Drucker (zB Replicator Mini) für 3D - Druck der Platteneinsätze.
   1. Verwenden Sie op3D-Design-Software en Quelle wie Blender die 3D-Modelle der bedruckten Außenschalen und Beiträge zu erstellen.
   2. Exportieren Sie die Treiberdatei des Modells über eine .stl Format für die Portabilität für die Software des 3D-Druckers ermöglicht.
   3. Produzieren gedruckt Pfosten und Außenschalen unter Verwendung von Poly (milchsäure) Filament (PLA) in den Drucker geladen 3D.
   4. Nach dem Drucken, führen eine 30-minütige in einer 70% -100% Ethanollösung einweichen jeder Einsatz zu sterilisieren.
2. Vorbereiten eines Härtungsmittels 01.10 Polymermischung aus Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) Siliconpolymer zu stützen und um die Mischung zu entgasen bei Raumtemperatur für 10 min ermöglichen.
   1. Definieren Petrischale Größen verwendet als kleine (35 mm), Zwischenprodukt (60 mm) und große (100 mm).
   2. In 2 ml, 4 ml und 6 ml nicht gehärteten Silikon auf jeder kleinen, mittleren und großen Platte, bzw., und erstellen Sie eine dünne Schicht über den gesamten Boden der Petrischale.
   3. Erstellen Sie Beiträge für die kleine Platte von PDMS in ein Eingießen100 mm Platte auf eine Höhe von 7 mm und ermöglichen für etwa 2-3 Stunden bei 60 ° C auf einer heißen Platte zu härten. Dann mit einem 5 mm Biopsiestanze zylindrischen Pfosten auszuzustanzen. Verwenden, um eine kleine Menge an ungehärtetem PDMS zu sichern jeden PDMS Zylinder und zu der Mitte jeden Plättchens.
   4. Für die Zwischen- und großen Platten vor an der Unterseite der Platte Härtung der PDMS vervollständigen, Ort, um die 3D-Druckstifte 10 mm und 20 mm im Durchmesser zentrisch in jeder Zwischen und großen Platten, respectively. Für die großen Platten, legen zusätzlich eine 3D-gedruckten Außenschale etwa 66,7 mm im Durchmesser Äquidistanz von der Post.
      1. Erlauben Jedes Gericht im Freien auf einer heißen Platte zu härten bei 60 ° C für etwa 2-3 Stunden, für 18 Stunden zur Entgasung des Polymers. Fix gedruckten Komponenten auf die Platte in dem richtigen Bereich und die Orientierung , wie in Abbildung 1 zu sehen ist .
   5. Eine Lösung aus 70% Ethanol mit 30% destilliertem Wasser 30 Minuten lang auf die Innenseite aller plates für die Sterilisation und dann decken jede Platte.
   6. aspirieren vorsichtig das Ethanol aus jeder Platte und an der Luft trocknen lassen.
   7. Ordnen Sie jede Platte in einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) neben dem Deckel, dem Gesicht nach oben. Expose Platten und Deckel mit UV-Licht unter dem BSC 30 Minuten Sterilisation zu vervollständigen. Sterile Technik wird bei jedem Schritt nach UV-Bestrahlung durchgeführt.

3. Herstellung von Fibrinhydrogels, mit glatten Muskelzellen und Wartung von Platten Seeding

1. Mischen Sie eine Lösung von Fibrin-Gel mit Wachstumsmedium + 0,01% TGF-β1 in den Mengen von 0,5 ml, 1,1 ml und 1,81 ml für kleine, mittlere und große Plattengrößen sind.
   1. Werden 40 & mgr; l, 88,4 & mgr; l und 145 & mgr; l Thrombin, aus einem Vorrat von 100 U / ml, zu den Medien jedes kleinen, mittleren und großen Platte, respectively. Vorsichtig schwenken jede Platte mit der Hand, dass Thrombin, um sicherzustellen, gleichmäßig in den Medien gemischt wird.
   2. Als Nächstes fügen 1601 L, 354 & mgr; l und 580 & mgr; l Fibrinogen, aus einem Vorrat von 20 mg / ml, tropfenweise kreisförmig auf die Thrombin-Medien-Gemisch zu jedem kleinen, mittleren und großen Platte auf. Vorsichtig schwenken Mischen von Hand und Verteilung des Hydrogels in einer gleichmäßigen Schicht zu gewährleisten.
   3. Erlauben Hydrogel für 10-15 Minuten bei Raumtemperatur aushärten.
2. Trypsinize glatten Muskelzellen in 150 mm-Zellkulturplatten und zentrifugieren erweitert nach Standardprotokollen. Das resultierende Pellet sollte in 3 ml Differenzierungsmedium resuspendiert werden, bestehend aus 98% - 231 Medien, 1% FBS und 1% Antibiotikum / Antimykotikum.
   1. Energisch Zellen mischen durch Titration nach oben und unten mit einer 2-ml-Pipette alle Zellklumpen aufzubrechen. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer und schaffen eine Zellsuspension von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml, 1,0 x 10 ⁷ Zellen / ml und 1,4 x 10 ⁷ Zellen / ml für kleine, mittlere und große Platten, respectively.
   2. 1 ml jeder Zellsuspension intoa 50 ml konischen entsprechend markierten kleinen, mittleren und großen. Legen Sie zusätzlich 50 ml konischen auf diese Weise für jeden weiteren Gewebering gewünscht werden.
   3. In jeder konischen Differenzierung Medien bis zur endgültigen Aussaat Volumen von 2 ml zu erhalten, 4 ml und 5 ml für jeden kleinen, mittleren und großen Gefäße sind. Dann Pipettieren vorsichtig die Zelllösung tropfenweise auf der Oberseite des hergestellten Hydrogels in jeder entsprechenden Platte.
   4. Ort Platten in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2.
3. Ändern Differenzierung Medien alle 48-72 Stunden für jede Platte. Bei der größeren Platte, Medien zunächst nach 24 Stunden ändern, dann alle 48 bis 24 Stunden für die große Zelle Aussaatdichte zu kompensieren ändern.
   1. Nach 2-4 Tagen wie die Ringe vollständig in Richtung der Post unter Vertrag haben wird, mit 10 & mgr; l, 20 & mgr; l und 35 & mgr; l von TGF-β1 zu jedem kleinen, mittleren und großen Ring sind. Nach Exposition gegenüber TGF-β; 1 für mindestens 24 Stunden, Ringe sind bereit behandelt werden.

4. Montage von Vascular Konstruieren und Wartung

1. Vor der Herstellung des endgültigen Gefäßkonstrukt ist ein spezialisierter Container erstellt den fertigen Behälter zu halten.
   1. Für den kleinen Schiff, ein großer Teller für Ringstapel erstellen, indem ein 2-Zoll-Abschnitt von der Spitze eines 50-ml-Polycarbonat konische Röhrchen schneiden und dann PDMS die Schnittkante in eine 35-mm-Platte kleben. Verwenden Sie den konischen Deckel als Plattendeckel.
   2. Für die Zwischen- und großen Behälter hoch Ringplatten stapeln, schneiden Sie ein 1,75-Zoll Durchmesser Polycarbonatrohr in 2,5-Zoll-Abschnitte in Längsrichtung als die hohen Plattenwände zu dienen. Für die hohen Plattenboden, geschnitten, um eine 0,125 Zoll dicke Polycarbonatfolie in 2-Zoll-Durchmesser-Kreis Stücke. Mit Acryl-Klebe, binden das Polycarbonat Rohrabschnitt an dem kreisförmigen Schnittstück. Verwenden Sie den Deckel aus einer 60 mm Petrischale als Deckel für die hohe Platte.
   3. 3D-pRINT Beiträge 5, 10 und 20 mm im Durchmesser und 50 mm in der Länge.
   4. 10 ml ungehärtetem Silikon zu jedem Behälter. Vor der vollständigen Aushärtung des PDMS, legen Sie zentral jeden in Schritt geschaffene 4.1.3 in jedem kleinen, mittleren und großen Behälter.
   5. Lassen Sie auf einer heißen Platte Set für 2-3 Stunden auf 60 ° C zu heilen.
   6. Sterilisieren mit einer Lösung von 70% Ethanol mit 30% destilliertem Wasser für 30 Minuten.
   7. aspirieren vorsichtig das Ethanol aus jedem Behälter und lassen Sie in der BSC an der Luft trocknen. Als nächstes wird mit jeder Platte neben dem Deckel, dem Gesicht nach oben platziert, um die Behälter in der Motorhaube anordnen. Expose Behälter mit UV-Licht unter der BSC für weitere 30 Minuten für die weitere Sterilisation. Verwenden Sie sterile Technik bei jedem Schritt nach der UV-Exposition.
2. Mit sehr feinen Pinzette vorsichtig entfernen sich eng gerollte glatten Muskulatur Hydrogel Ring von seinem Posten und Transfer zu seinem entsprechenden größeren Behälter mit den hohen Beiträgen.
   1. Verwenden Sie ein Paarin jeder Hand Zange und heben Sie eine Seite des Rings von der Post, und dann die andere. Achten Sie darauf, zu schützen und das Lumen aufrechtzuerhalten.
   2. Führen Sie die Übertragung mit diesem zweihändige Verfahren wird zunächst eine Seite schieben und dann auf der anderen Seite des Rings auf den hohen Beitrag. Durch sanfte, schrittweise Bewegungen, und am Umfang arbeiten, drücken Sie langsam den Ring nach unten auf den hohen Beitrag. Anschließend Ringe stapeln Gewebe, bis die gewünschte Schiffslänge erhalten wurde, wobei jeder Ring Zusatz von ca. 1-2 mm Länge bis zum fertigen Konstrukt.
3. Mit dem Ring-Stack auf den hohen 3D-gedruckten Pfosten positioniert ist, drehen Sie die Platte, so dass die Post parallel mit der Arbeitsfläche ist.
   1. Mit einer Mikropipette, dann werden 40, 80 und 160 & mgr; l Thrombin in einer Konzentration von 100 U / mL sanft auf die Außenfläche jeder kleinen, mittleren und großen Gefäße, respectively. Während die Thrombin Zugabe langsam drehen die Platte Abdeckung aller Oberflächen des Konstrukts, um sicherzustellen, sogar.Dadurch wird die Basis für die Fibrinkleber sein, den Ringstapel Konstrukt in den ersten Tagen nach dem Bau verwendet zu sichern.
   2. Anschließend fügen in einer Konzentration von 20 mg / mL 40, 80 und 160 & mgr; l Fibrinogen in jedem kleinen, mittleren und großen Konstrukt jeweils mit einer Mikropipette, während das Konstrukt schnell dreht. Das Thrombin und Fibrinogen schnell in ein festes Gel gesetzt einmal gemischt. Aufgrund der Zeit kurzen Aushärtezeit, wenden Sie das Fibrinogen so schnell und gleichmäßig wie möglich.
4. 20 ml Differenzierungsmedium zu jedem Behälter, die das Konstrukt halten. Platz Gefäße in einen 37 ° C Inkubator ° bis benötigt. Ändern Medien alle 3-5 Tage.

Ergebnisse

Nachgewiesene hier ist die Herstellung von 3 verschiedenen engineered Gefäßimplantat Größen (Abbildung 1), die zeigen , dass der Ring Stapelverfahren (RSM) skalierbar ist. Um zu beweisen , Anwendbarkeit, die 3 verschiedene Gefäßgrößen Korrelat tatsächlichen menschlichen Gefäßgröße für den linken vorderen absteigenden Arterie gewählt (klein; Lumendurchmesser = 4 mm) ^17, absteigend Aorta (Zwischen; Lumendurchmesser = 10 mm) und aufste...

Diskussion

Der Ring Stapelverfahren stellt mehrere Vorteile gegenüber aktuellen Gefäßgewebe manipulierten Konstrukts Techniken. Die RSM können menschliche Gefäße jeder Größe durch einfaches Anpassen der Post und Außenschale Abmessungen zu schaffen angepasst werden. Unsere Methode ermöglicht die Entwicklung von polymerfreien konstruierte Schiffe, die ausschließlich aus menschlichen Zellen zusammengesetzt und schnell Trägermaterial in der körpereigenen natürlichen Wundheilungsprozess gefunden zu verschlechtern. Polymer...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody