3Dプリントガイドとリングスタッキング法を用いたエンジニア血管移植片のスケーリング

要約

スケーラブルな設計された血管は、臨床適用性を改善するであろう。簡単にかなりの3Dプリントガイドを使用して、血管平滑筋のリングは、血管移植片を形成し、筒状に作成して積層しました。移植片は、単純に、3Dプリントガイドサイズを変更することによってヒト冠状動脈寸法の範囲を満たすような大きさにすることができます。

要約

冠動脈疾患は、数百万人のアメリカ人に影響を与え、死の主要な原因です。利用可能な自家血管移植片の不足により、人工移植片は、患者の治療のための大きな可能性を提供します。しかし、操作された血管移植片は、一般に容易に拡張されない時間がかかり、高価な練習を構成する、異なるサイズをカスタマイズするためにカスタムモールドまたはポリマーチューブの製造を必要とします。人間の動脈は、約2.0〜38ミリメートルから約0.5〜2.5ミリメートルから壁の厚さで内腔直径の範囲です。我々は、血管平滑筋細胞（SMC）とここに実証所望の細胞型の組織の可変サイズのリングは、内腔の直径を制御するために、中央ポストのガイドを使用して作成することができる」は、環スタッキング法」と呼ばれるメソッドを作成しましたそして、外殻は、血管壁の厚さを決定します。これらの組織のリングは、その後、血管の自然な形状を模倣、管状構造物を作成するために積層されています。容器の長さがbのことができますeは、単に必要な長さを構成するのに必要な環の数を積層して合わせ。私達の技術を用いて、血管に類似した管状の形態の組織は、容易に診療所および患者のニーズを満たすために寸法および長さの多様で製造することができます。

概要

冠動脈疾患（CAD）の処置において、患者自身の血管バイパス手術用移植材料として回収します。しかし、多くの場合、病気の患者は、自分自身に寄付する実行可能な船を持っていない、と彼らが行う場合には、ドナー部位は、かなりの追加的な害を引き起こし、感染の重大なリスクがあります。 ¹操作された血管移植片は、この必要性を満たすことができます。スケーラビリティは、患者の血管のサイズ要件の広い範囲を満たすために、エンジニアリング船の最も重要です。しかし、エンジニアリング船舶のための本方法は、容易に拡張されず、一般的に複雑な金型またはポリマー足場の再製造を必要とします。ほとんどの操作された移植片血管線維芽細胞、平滑筋、または内皮細胞を播種されたポリマー管状足場を利用してのいずれか。または組織管を作成するために、マンドレルの周りに細胞シートをロール。臨床試験における二工学血管移植片は、脱細胞化に基づいていますDポリマー-ECMプラットフォーム。血管の修復に使用できる^2、3、4ポリマー移植片は、既に持続ポリマーの存在とグラフトの長期適用の主な課題として生じる可能性が開存性の問題を有することが知られています。管状の型は様々なサイズで血管を生成するためにカスタムモールドのための追加の設計及びツールの製造を必要とする手順、完全に細胞容器を製造するために使用される^{5、6、7、8、9、10、11、12、13}れています。

本明細書に記載される方法は、容易に拡張操作血管を作成するための新規な技術を包含しますカスタマイズ可能な3Dプリント挿入と伝統的な培養プレートを使用して移植片。 ¹⁴細胞は、中央ポストと外殻のインサートを有するプレートに播種します。ポストコントロールは直径ルーメンと自己集合組織のリングにに細胞単層を可能にします。リングの外殻を制御する厚さ、および最終的な容器のこのように壁の厚さ。完成した組織のリングは、その後、管状血管移植片を形成するように積層されています。この方法の利点は、「リングスタッキング法」と呼ばれる任意の接着細胞タイプは、単に修正ガイドを挿入することによって生成することができるプレートの設定および組織環または所望の用途に必要な任意のサイズの管に播種することができることです。組織のリングを作成する組織工学における比較技術は^、15、スケールに難しいまま各所望の大きさのために金型の再製造を必要とする^16。さらに、この方法を用いて作製血管グラフトを生産することができ2-3週間でdは、数週間では速く、他の操作された容器に比べて。 ^図6は、診療所では、この時間のずれが悪化している患者の治療に有意な差を作ることができます。

プロトコル

1.細胞培養の準備

1. 商業的に購入したヒト大動脈平滑筋細胞を利用します。
2. 88.6％とからなる平滑筋細胞増殖培地中で細胞を維持する231培地、0.1％の組換えヒトインスリン（RH-インスリン）、組換えヒト線維芽細胞増殖因子（RH-FGF）、組換えヒト上皮細胞増殖因子（RH-FGF）の各々アスコルビン酸; 5％ウシ胎児血清（FBS）およびL-グルタミンの各;そして、1％抗生物質/抗真菌剤。
   注：各増殖因子、FBSおよびL-グルタミンは、血管メディア増殖キットとして購入されます。
3. 細胞が約90％コンフルエントと組織播種のための準備が整うまで、メディアごとに48時間を変更します。
4. 拡張のためのメディアの変化との間でインキュベーター中で細胞を保管してください。

3Dプリント挿入とカスタムシリコーン成形プレートの調製

1. 3Dは、プレートインサートを印刷するための市販の3Dプリンタ（ 例えば 、レプリケータミニ）を使用します。
   1. オペアンプを使用してください印刷された外殻とポストの3Dモデルを作成するために、このようなブレンダーとしてソースの3D設計ソフトウェアアン。
   2. 3Dプリンタのソフトウェアへの移植を可能に.STLフォーマットを経由して、モデルのドライバファイルをエクスポートします。
   3. 3Dプリンターにロードされたポリ（乳酸）フィラメント（PLA）を使用して印刷柱と外殻を生成します。
   4. 次の印刷、30分を行う各インサートを滅菌するために、70％-100％のエタノール溶液に浸します。
2. ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）のシリコーンポリマーのポリマー混合物をベースと室温で10分間脱気し、混合物を可能に1:10の硬化剤を準備します。
   1. 、（35ミリメートル）小さい（60ミリメートル）、中間、および大規模（100ミリメートル）として使用シャーレのサイズを定義します。
   2. 2 mLを、4 mLおよびそれぞれ、小中間および大プレートに未硬化のシリコーンの6 mLを加え、シャーレの底面全体を横断薄層を作成します。
   3. PDMSを注ぐことにより、小さなプレートのための投稿を作成します。7mm高さの100mmプレートとは、約2~3時間、60℃のホットプレート上で硬化させます。次に、円筒状の支柱をパンチアウトするために5ミリメートル生検パンチを使用します。各PDMSシリンダーを確保し、各小板の中央にするために、未硬化PDMSの少量を使用してください。
   4. プレートの底にPDMSの硬化を完了する前に、中間および大規模なプレートについては、3Dはそれぞれ、各中間および大型プレートに集中直径ポスト10ミリメートルと20ミリメートルを印刷置きます。大規模なプレートの場合は、さらに3Dプリント外殻をポストから直径等距離では約66.7ミリメートルを置きます。
      1. 各皿は、ポリマーの脱ガスのための18時間を可能にする、約2〜3時間、60℃のホットプレート上で大気中で硬化させます。 図1に見られるように、適切な領域と向きでプレートに印刷されたコンポーネントを修正しました。
   5. すべてのPLAの内部に30分間、30％の蒸留水で70％エタノール溶液を添加その後、滅菌のためのTESと各プレートをカバーしています。
   6. 慎重に各プレートからのエタノールを吸引空気乾燥させ。
   7. その蓋、フェイスアップの隣に生物学的安全キャビネット（BSC）内の各プレートを配置します。滅菌を完了するために30分間BSCの下でUV光にプレートし、蓋を公開します。滅菌技術は、UV曝露後のすべての工程を用いて行われます。

平滑筋細胞とプレートのメンテナンスで播種フィブリンハイドロゲルの調製、

1. それぞれ、小中間および大型プレートサイズの0.5 mLを、1.1 mLおよび1.81ミリリットルの量の成長培地+ 0.01％のTGF-β1を含むフィブリンゲル溶液を混ぜます。
   1. それぞれ、100 U / mLのストックから、それぞれ、小中間および大型プレートのメディアに、40μL、88.4μLとトロンビンの145μLを追加します。ゆっくりとそのトロンビンが均等にメディア内で混合されていることを確認するために手で各プレートを旋回させます。
   2. 次に、160を追加1; L、354μLおよび580μLのフィブリノゲンは、20 mg / mlでの在庫から、滴下円それぞれ、小中間および大プレートにトロンビンメディア混合物に、それぞれ。ゆっくりでも層に混入し、ヒドロゲルの分布を確認するために手で旋回。
   3. ヒドロゲルは、室温で10〜15分間硬化させます。
2. 標準的なプロトコルに従って、平滑筋の150mm細胞培養プレート中で増殖する細胞と遠心分離をトリプシン処理。 231培地、1％FBSおよび1％抗生物質/抗真菌 - 得られたペレットを98％からなる分化培地3mLに再懸濁されるべきです。
   1. 積極的に任意の細胞塊を破壊するために2 mLのピペットで上下に滴定により細胞を混ぜます。血球計数器を用いて細胞をカウントし、/ mLで、小中間および大型プレート用、それぞれ2×10 ⁶細胞/ mL、1.0×10 ⁷細胞/ mLおよび1.4×10 ⁷細胞の細胞懸濁液を作成します。
   2. 各細胞懸濁液intの1 mLを加え50 mLコニカルに対応するOAは、小さな中間および大型の標識。希望するそれぞれの追加の組織のリングのために、このように、追加の50 mLコニカルを設定します。
   3. それぞれ、各小中間および大血管のための2 mLを、4 mLおよび5 mLの最終播種量を得るために、各円錐形に分化培地を追加します。その後、慎重に滴ずつそれぞれ対応するプレートで準備ヒドロゲルの上に細胞溶液をピペット。
   4. 37℃インキュベーターで5％CO ₂に代えプレート。
3. 分化培地を各プレート毎に48〜72時間を変更します。より大きな板の場合には、大細胞播種密度を補償することごとに48から24時間を変更した後、24時間後に最初にメディアを変更します。
   1. リングが完全にポストに向かって収縮していますように2〜4日後に、それぞれ、各小中間および大きいリングに10μL、20μLおよびTGF-β1の35μLを追加します。 TGF-βへの曝露後; 1、少なくとも24時間、リングを扱うことする準備が整いました。

血管構築とメンテナンスの4アセンブリ

1. 最終的な血管構造物の製造前に、特殊な容器が完成容器を保持するために作成されます。
   1. 小血管のために、50mLのポリカーボネートコニカルチューブの上から2インチのセクションを切断することにより、リングの積み重ねのための背の高い板を作成し、PDMS 35ミリメートルプレートにカットエッジを接着。プレートの蓋として円錐形の蓋を使用してください。
   2. プレートを積み重ね、中間および大血管背の高いリングのために、背の高い板壁として機能するように縦方向に2.5インチのセクションに1.75インチの直径のポリカーボネートチューブをカット。背の高いプレート底部は、2インチ直径の円形片に0.125インチ厚のポリカーボネートシートを切断します。アクリル溶剤セメントを使用して、円形の切​​断片をポリカーボネート管部分に結合します。背の高い板用の蓋として60ミリメートルのペトリ皿から蓋を使用してください。
   3. 3DのpRINTポスト5、直径10から20mm、長さ50mm。
   4. 各コンテナに未硬化のシリコーンの10ミリリットルを追加します。 PDMSの完全な硬化に先立ち、中央にそれぞれ、小さな中間、および大規模な容器にステップ4.1.3で作成した各ポストを配置します。
   5. 2-3時間、60℃にホットプレートセットに硬化させます。
   6. 30分間、30％蒸留水で70％エタノール溶液で滅菌します。
   7. 慎重に各容器からエタノールを吸引した後、BSCで空気乾燥させ。次に、その蓋、フェイスアップの隣に配置、各プレートとフード内のコンテナを配置します。さらに滅菌のための追加の30分間BSCの下でUV光にコンテナを公開します。 UV照射後のすべてのステップで滅菌技術を使用してください。
2. 非常に微細な鉗子を使用して、慎重にそのポストから各きつく巻か平滑筋ヒドロゲルリングを削除し、背の高いポストとその対応するより大きな容器に移します。
   1. のペアを使用しますそれぞれの手で鉗子とは、ポストからリングの片側を持ち上げ、その後、他の。内腔を保護し、維持するために注意してください。
   2. 背の高いポストに最初の1辺、リングのもう一方の側をスライドさせる、この両手方式で転送を実行します。穏やかな、緩やかな動きを使用して、円周方向に働いて、ゆっくりと背の高いポストの上にリングを押し下げます。所望の血管の長さは、各リングが完了構築物の長さの約1〜ミリ加えると、得られるまで、続いて組織リングスタック。
3. ポストは、作業面と平行になるように背の高い3Dプリントポスト上に位置決めリングのスタックを使用すると、プレートを回します。
   1. マイクロピペットを用いて、それぞれ、各小中間および大血管の外表面に軽く100 U / mLの濃度でトロンビンの40、80および160μLを追加します。トロンビンを添加しながら、ゆっくりと構築物の全ての表面の均一な被覆を確実にするためにプレートを回転させます。これは、構築後の初期日にリングスタック構造体を固定するために利用フィブリン糊のベースになります。
   2. 次に、迅速に構築体を回転させながらマイクロピペットを用いて、それぞれ、各小中間、および大規模な構築物の20mg / mLの濃度でフィブリノゲンの40、80および160μLを追加します。トロンビンおよびフィブリノーゲンはすぐに一度混合固いゲルに設定してください。短い硬化時間に、可能な限り迅速かつ均等にフィブリノゲンを適用します。
4. 構築物を保持する各コンテナに分化培地の20 mLを加え。 37℃のインキュベーターに置き容器が必要になるまで。 3〜5日毎のメディアを変更します。

結果

ここで実証されたリングスタッキング法（RSM）がスケーラブルであることを示し、3つの異なる工学血管移植片の大きさ（ 図1）の製造です。適用性を証明するために、3つの異なる容器のサイズは、動脈左前のため、実際の人間の血管サイズに相関を選択した（小;直径ルーメン= 4ミリメートル^）17、（中間;直径ルーメン= 10ミリメートル?...

ディスカッション

リングスタッキングメソッド現在の血管組織工学構築物の技術上の複数の利点を提供します。 RSMは、単にポストと外殻寸法をカスタマイズすることによって、任意の大きさの人間の血管を生成するように適合され得ます。私たちの方法は、ヒトの細胞でのみ構成されるポリマーフリー工学血管の開発を可能にし、迅速に身体の自然な創傷治癒過程で見つかった支持体材料を劣化させます。ポ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody