Масштабирование Engineered сосудистых трансплантатов С помощью 3D печатных руководств и кольцо Метод Stacking

Резюме

Масштабируемые сконструированные кровеносные сосуды позволит улучшить клиническую применимость. Использование легко значительных 3D-печатных руководств, были созданы и уложены в трубчатую форму, образуя сосудистый трансплантат кольца гладких мышц сосудов. Прививки могут быть рассчитаны для удовлетворения широкого круга размеров коронарных артерий человека путем простого изменения 3D печатных размеров руководство.

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца остается основной причиной смерти, страдают миллионы американцев. При отсутствии аутологичных сосудистых трансплантатов доступных, сконструированные трансплантаты предлагают большой потенциал для лечения пациентов. Тем не менее, сконструированные сосудистых трансплантатов, как правило, не легко масштабируемой, требуя производство нестандартных форм или полимерных труб для того, чтобы настроить на различные размеры, составляющие по времени и больших затрат практики. Человеческие артерии имеют диаметр просвета от примерно 2.0-38 мм и толщиной стенки от примерно 0.5-2.5 мм. Мы создали метод, называемый "Ring Stacking метод", в которой переменные кольца размера ткани нужного типа клеток, продемонстрированную здесь с клеток гладких мышц сосудов (SMCS), могут быть созданы с помощью направляющих постов центра для контроля диаметра просвета сосуда и внешние оболочки диктовать толщину стенки сосуда. Эти кольца тканей затем сложены, чтобы создать трубчатую конструкцию, имитируя естественную форму кровеносного сосуда. Длина судна может бе скроены просто укладывания количество звонков, необходимых для образования необходимой длины. С помощью нашей техники, ткани трубчатых форм, подобных кровеносного сосуда, могут быть легко изготовлены в различных размеров и длины для удовлетворения потребностей клиники и пациента.

Введение

При лечении ишемической болезни сердца (ИБС), у пациента в собственные кровеносные сосуды собирают в качестве трансплантационного материала для шунтирования. Тем не менее, часто, больные не имеют жизнеспособных судов, чтобы пожертвовать собой, а также в тех случаях, когда они делают, сайт донор вызывает значительный дополнительный вред и имеет серьезный риск для инфекции. ¹ Engineered сосудистых трансплантатов может удовлетворить эту потребность. Масштабируемость имеет первостепенное значение для инженерных судов в целях удовлетворения широкого спектра требований к размеру сосуда пациента. Тем не менее, современные методы инженерных судов, не легко масштабируются, и как правило, требуют сложных перерабатывать форм или полимерных каркасов. Большинство инженерии трансплантаты либо используют полимерный трубчатый помост, который засевают с сосудистыми фибробласты, гладкие мышцы, или эндотелиальных клеток; или подвижного сотового листа вокруг оправки для создания трубки ткани. Два сконструированные сосудистых трансплантатов в клинических испытаниях, основаны на decellularized платформы полимер-ECM. ^{2, 3, 4} полимерные трансплантатов доступны для использования в сосудистой реконструкции уже известно, имеют проблемы с проходимостью, которые могут возникнуть в качестве одной из основных проблем при длительном применении трансплантата с наличием устойчивого полимера. Трубчатые формы были использованы для изготовления полностью вакуолей, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13} , какие процедуры требует дополнительных проектирование и изготовление инструмента для пользовательских форм для того , чтобы производить сосуды в различных размерах ,

Описанный здесь способ включает в себя новый метод для создания легко масштабируемой сконструированную сосудистуютрансплантатов с помощью настраиваемых 3D печатных пластин и традиционной культуры пластин. ¹⁴ Клетки высевают на пластины со вставками из центрального поста и внешней оболочки. Почтовые управления диаметр просвета сосуда и позволяет Клеточный монослой к самосборке в кольцо ткани. Внешняя оболочка управления толщина кольца, и, таким образом, толщина стенки окончательного судна. Заполненные кольца тканей затем уложены с образованием трубчатого трансплантата, сосудистая. Преимущество этого метода, называют "Кольцо Stacking Method", является то, что любой клейкий тип клеток может быть посеяны в установку пластины и тканевых колец или труб любого размера, необходимого для требуемого применения могут быть получены путем простого изменения направляющих вставок. Сравнительные методы в тканевой инженерии Создание колец ткани по- прежнему трудно масштабе, ^{15, 16} требует перерабатывать пресс - форм для каждого нужного размера. Кроме того, сосудистые трансплантаты с использованием этого метода можно производитьd через 2-3 недели, через несколько недель быстрее по сравнению с другими спроектированных судов. ⁶ Для клиники, на этот раз несоответствие может иметь существенное значение при лечении ухудшающейся пациента.

протокол

1. Культура клеток Приготовление

1. Использование аортальных гладкомышечных клеток человека, приобретенные на коммерческой основе.
2. Поддержание клеток в гладкой мышечной среде для роста клеток, состоящих из 88,6% 231 средств массовой информации, 0,1% каждого из рекомбинантного человеческого инсулина (РЗ-инсулин), рекомбинантный фактор роста фибробластов человека (РЗ-FGF), рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста (РЗ-FGF), и аскорбиновая кислота; и 5% каждой из эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и L-глутамин; и 1% антибиотик / противогрибковым.
   Примечание: Каждый фактор роста, FBS и L-глутамина приобретаются в виде комплекта роста медиа-сосудистой.
3. Изменение среды каждые 48 часов, пока клетки около 90% сплошности и готовы к посеву ткани.
4. Храните клетки в инкубаторе в между изменениями медиа для расширения.

2. Подготовка 3D печатных вкладышей и на заказ Силиконовые Вагонка Плиты

1. Использование коммерческих 3D - принтер (например, репликатор Mini) для 3D печати пластины - вставки.
   1. Используйте опан источника 3D проектирования программного обеспечения, таких как Blender для создания 3D-моделей печатных внешних оболочек и постов.
   2. Экспорт файла драйвера в модели через формат .stl что позволяет портативности к программному обеспечению 3D-принтера.
   3. Произведите напечатанные сообщения и внешние оболочки с использованием поли (молочной кислоты) нити (PLA), загруженные в 3D-принтер.
   4. После печати, выполнить за 30 минут замочить в 70% -100% -ного раствора этанола для стерилизации каждой вставки.
2. Приготовьте 1:10 отвердитель в базировать полимерную смесь поли (диметилсилоксан) (PDMS) силиконовый полимер, и дают смеси дегазировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
   1. Определить Петри размеров тарелки, используемые в качестве малого (35 мм), средний (60 мм) и большой (100 мм).
   2. Добавляют 2 мл, 4 мл и 6 мл неотвержденного силикон для каждого малого, среднего и большого пластины, соответственно, и создать тонкий слой по всей нижней части чашки Петри.
   3. Создание сообщения для маленькой пластины путем заливки PDMS в100 мм пластины на высоту 7 мм и позволяют вылечить на горячей плите при температуре 60 ° С в течение приблизительно 2-3 часов. Затем с помощью трепанобиопсия 5 мм выбивать цилиндрические сообщения. Используйте небольшое количество неотвержденного PDMS, чтобы обеспечить каждый цилиндр PDMS и к центру каждой небольшую тарелку.
   4. Для средних и больших пластин, до полного отверждение PDMS в нижней части пластины, поместите 3D отпечатанным сообщений 10 мм и диаметром 20 мм по центру друг в средних и больших пластин соответственно. Для больших пластин, дополнительно разместить 3D-печатная наружная оболочка около 66,7 мм в диаметре равноудаленности от должности.
      1. Разрешить каждое блюдо, чтобы вылечить в открытом воздухе на горячей плите при температуре 60 ° С в течение приблизительно 2-3 часов, что позволяет 18 часов для дегазации полимера. Фикс печатные компоненты к пластине в собственном регионе и ориентации , как показано на рисунке 1.
   5. Добавляют раствор 70% -ного этанола с 30% дистиллированной воды в течение 30 минут к внутренней стороне всех PLATES для стерилизации, а затем покрывают каждую пластину.
   6. Тщательно аспирата этанола из каждой пластины и дайте высохнуть на воздухе.
   7. Расположить каждую пластину в шкафу биологической безопасности (BSC) рядом с его крышкой, лицевой стороной вверх. Защиту пластины и крышки с УФ-светом под КБС в течение 30 минут до полной стерилизации. Стерильная техника выполняется с каждым шагом после воздействия УФ-излучения.

3. Получение фибрина гидрогеля, Посев с гладкомышечных клеток и поддержание пластин

1. Смешайте раствор фибринового геля, содержащего ростовую среду + 0,01% TGF- 1 в количестве 0,5 мл, 1,1 мл и 1,81 мл для малых, средних и больших размеров пластин соответственно.
   1. Добавить 40 мкл, 88,4 мкл и 145 мкл тромбина из запаса 100 ед / мл, в средствах массовой информации каждого малого, среднего и большого пластины соответственно. Аккуратно водоворот каждую пластину вручную, чтобы убедиться, что тромбин равномерно смешивается в средствах массовой информации.
   2. Затем добавьте 1601; L, 354 мкл и 580 мкл фибриногена, из запаса 20 мг / мл, по каплям циркулярно к тромбин-медиа смеси каждого малого, среднего и большого пластины соответственно. Аккуратно водоворот вручную, чтобы обеспечить смешивание и распределение гидрогеля в даже слой.
   3. Разрешить гидрогель вылечить в течение 10-15 минут при комнатной температуре.
2. Trypsinize гладкие мышечные клетки разлагаются в 150 мм клеточных культур пластин и центрифуге в соответствии со стандартными протоколами. Полученный в результате осадок ресуспендируют в 3 мл дифференцировки, состоящей из 98% - 231 средства массовой информации, содержащей 1% FBS и 1% антибиотика / противогрибкового.
   1. Энергично перемешайте клетки титрованием вверх и вниз с помощью пипетки 2 мл, чтобы разбить любые скопления клеток. Граф клеток с гемоцитометра и создать клеточную суспензию 2 х 10 ⁶ клеток / мл, 1,0 х 10 ⁷ клеток / мл и 1,4 х 10 ⁷ клеток / мл для малых, средних и больших пластин, соответственно.
   2. Добавить 1 мл каждой клеточной суспензии Intоа соответствующие 50 мл коническую маркированы маленький, средний и большой. Установка дополнительно 50 мл коническую таким образом, для каждого дополнительного кольца ткани желаемого.
   3. Добавить дифференцировки к каждому коническими, чтобы получить окончательные объемы засева 2 мл, 4 мл и 5 мл для каждого малого, среднего и большого сосуда, соответственно. Затем осторожно пипеткой раствора клеточного каплям поверх приготовленного гидрогеля в каждой соответствующей плите.
   4. Место пластины в инкубатор при 37 ° С и 5% CO _2.
3. Изменение дифференцировки каждые 48-72 часов для каждой пластины. В случае большей пластины, изменение средств массовой информации первоначально через 24 часа, а затем изменить его каждые 48-24 часов, чтобы компенсировать большой плотности посева клеток.
   1. Через 2-4 дня, как кольца будет полностью заключен в направлении поста, добавляют 10 мкл, 20 мкл и 35 мкл TGF- 1 для каждого малого, среднего и большого кольца, соответственно. После контакта с TGF-бета; 1, по крайней мере, 24 часов, кольца готовы быть обработаны.

4. Монтаж Vascular строительство и техническое обслуживание

1. До изготовления конечной сосудистой конструкции, специализированный контейнер создается для хранения заполненный сосуд.
   1. Для небольшого судна, создать высокую пластину для кольца штабелирования путем разрезания 2-дюймовый секции с верхней части 50 мл коническую пробирку из поликарбоната, а затем ПДМС приклеить обрезанный край на 35 мм планшете. Используйте коническую крышку в качестве закрывающей пластины.
   2. Для промежуточного и большого сосуда высотой кольца штабелирования пластин, вырезать 1,75 дюйма диаметром поликарбоната пробирку в 2,5 дюйма секций в продольном направлении, чтобы служить в качестве высоких стен плиты. Для получения высоких днищ плит, вырезать 0,125 дюйма поликарбоната толщиной листа в 2-дюймовый круг диаметром штук. Используя акриловый цемент растворителя, связать секцию поликарбоната трубы с круглым вырезом части. Используйте крышку с 60 мм чашек Петри в качестве крышки для высокой пластины.
   3. 3D-рРинт сообщений 5, 10 и 20 мм в диаметре и 50 мм в длину.
   4. Добавить 10 мл неотвержденного силикона для каждого контейнера. До полного отверждения PDMS, централизованно поместить каждую запись, созданную на шаге 4.1.3 в каждой малой, промежуточной и большой емкости.
   5. Разрешить вылечить на горячей пластине набора до 60 ° С в течение 2-3 часов.
   6. Стерилизация с раствором 70% -ного этанола с 30% дистиллированной воды в течение 30 минут.
   7. Тщательно аспирата этанола из каждого контейнера, а затем дайте высохнуть на воздухе в BSC. Затем расположить контейнеры в капот с каждой пластины, расположенной рядом с его крышкой, лицевой стороной вверх. Подвергать контейнеры воздействию УФ-светом под КБС в течение еще 30 минут для дальнейшей стерилизации. Использование стерильной техники с каждым шагом после воздействия УФ-излучения.
2. Использование очень тонких щипцов, тщательно удалить каждую плотно свернутый гладких мышц гидрогеля кольцо от своего поста и передать в соответствующий емкости большего объема с высокими посты.
   1. Используйте парупинцетом в каждой руке и поднимите одну сторону кольца с поста, а затем другой. Будьте осторожны, чтобы защитить и сохранить просвет сосуда.
   2. Выполните передачу с этим двуручным способом, скользя сначала в одну сторону, затем в другую сторону кольца на высокий пост. Используя нежные, плавные движения, и работа по окружности, медленно толкать кольцо вниз на высокий пост. Затем укладывают тканевые кольца до желаемой длины судна не было получено, с каждое кольцо добавлением примерно 1-2 мм длины к заполненному конструкции.
3. С помощью стека кольца, расположенного на высоких 3D напечатаны сообщения, поверните пластину так, чтобы пост параллельно с рабочей поверхностью.
   1. С помощью микропипетки, добавить 40, 80 и 160 мкл тромбина при концентрации 100 ед / мл осторожно к наружной поверхности каждого малого, среднего и большого сосуда, соответственно. При добавлении тромбин, медленно вращать пластину, чтобы обеспечить равномерное покрытие всех поверхностей конструкции.Это будет основой для клея фибрина, используемого для закрепления конструкции стека кольцо в первые дни после окончания строительства.
   2. Далее, добавьте 40, 80 и 160 мкл фибриногена при концентрации 20 мг / мл для каждого малого, среднего и большого конструкции, соответственно, с помощью микропипетки, вращая конструкцию быстро. Тромбин и фибриноген быстро установить в твердый гель после смешивания. Из-за короткого времени отверждения, применяют фибриногена, как быстро и равномерно, насколько это возможно.
4. Добавьте 20 мл дифференцировки для каждого контейнера, содержащего конструкцию. Место суда в C инкубатор 37 ° до тех пор, пока это необходимо. Изменение среды каждые 3-5 дней.

Результаты

Продемонстрированные здесь изготовление 3 -х различных размеров сконструированных сосудистых трансплантатов (рисунок 1), показывая , что кольцо Stacking метод (RSM) является масштабируемым. Чтобы доказать применимость, 3 различных размеров сосуда выбраны коррелир?...

Обсуждение

Кольцо Stacking Метод представляет несколько преимуществ по сравнению с текущими тканевых инженерии методов сосудистой конструкции. РСМ может быть адаптирована для создания человека суда любого размера, просто настраивая Столб и внешняя оболочка размеры. Наш метод позволяет для развити...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody