3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

요약

확장 가능한 설계 혈관 임상 적용 가능성을 향상시킬 것입니다. 쉽게 상당한 3D 인쇄 가이드 사용, 혈관 평활근의 고리가 생성되었고, 혈관 이식을 형성, 튜브형 형태로 쌓여있다. 이식 단순히 3D 인쇄 된 안내서의 크기를 변화시킴으로써 인간 동맥 치수의 범위를 만족하는 크기로 할 수있다.

초록

관상 동맥 질환은 수백만의 미국인에 영향을 미치는 주요 사망 원인이 남아있다. 가능한자가 혈관 이식의 부족으로 설계 이식 환자의 치료에 큰 잠재력을 제공합니다. 그러나, 설계 혈관 이식은 일반적으로 쉽게 확장되지 않은 시간과 비용이 많이 드는 연습을 구성, 서로 다른 크기를 사용자 정의하기 위해 사용자 정의 형 또는 폴리머 튜브의 제조를 요구. 인간의 동맥은 약 2.0-38 mm에서 약 0.5-2.5 mm의 벽 두께 내강 직경에 이르기까지 다양합니다. 우리는 방법을 만들었습니다, 원하는 세포 유형의 조직 가변 크기 반지, 혈관 평활근 세포 여기 입증하는 "반지 스태킹 방법"(SMCs을)라고, 내강 직경을 제어하는 ​​중앙 포스트의 가이드를 사용하여 만들 수 있습니다 및 외부 쉘은 혈관 벽 두께를 지시합니다. 이러한 티슈 링 후 혈관의 자연적인 형태를 모방하는 관형 구조물을 만드는 적층된다. 혈관 길이는 수 b즉 단순히 필요한 길이를 구성하는 데 필요한 벨 횟수 적층 원단. 우리의 기술로, 혈관 유사 관 형태의 조직 용이 병원 및 환자의 요구에 맞는 치수 및 다양한 길이로 제조 될 수있다.

서문

관상 동맥 질환 (CAD)의 치료에있어서, 환자 자신의 혈관 우회로 수술 이식 재료로서 수거된다. 그러나, 자주, 병 환자는 자신에 기부 가능한 용기를 가지고 있지 않으며, 그들이 할 경우, 기증자 사이트는 상당한 추가 피해를 발생 및 감염에 대한 심각한 위험이있다. ¹ 엔지니어링 혈관 이식이 필요를 채울 수있다. 확장 성 환자의 혈관 크기 요구의 넓은 범위를 충족하기 위해 설계 선박 가장 중요하다. 그러나, 엔지니어링 선박에 대한 본 발명의 방법은 쉽게 확장하지 않고, 일반적으로 복잡한 금형 또는 고분자 지지체의 재생산을 필요로한다. 대부분의 이식 혈관 섬유 아세포, 평활근, 또는 내피 세포 시딩 중합체 관형 지지체를 이용하거나 설계; 또는 맨드릴 주위에 세포 시트를 압연 조직 튜브를 만들 수 있습니다. 임상 시험에서 두 설계 혈관 이식은 decellularize을 기반으로D 폴리머 ECM 플랫폼입니다. 혈관 복구에 사용 가능한 ^{2, 3, 4} 중합체 이식 이미 지속적인 중합체 존재감 그래프트 장기간 용도에 중요한 문제로 발생할 수있는 문제 개통을 갖는 것으로 알려져있다. 관형 주형 절차는 다양한 크기의 혈관을 생성하기 위해 사용자 정의 금형 추가적인 설계 및 공구 제조를 필요 ¹³ 된 완전 세포 선박, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12를} 제조하는데 사용되어왔다 .

본원에 기재된 방법은 쉽게 확장 설계 혈관을 생성하기위한 신규 한 기술을 포함사용자 정의 3D 인쇄 인서트와 전통 문화 판을 사용하여 접목. 셀 ^(14)은 중앙 후와 외피의 인서트 플레이트에 시딩 하였다. 포스트 컨트롤은 직경 루멘과에 세포 단층 조직의 반지에 자기 조립 수 있습니다. 외측 링의 쉘 두께를 제어하고, 따라서 최종 용기의 벽 두께. 완성 된 티슈 링 후 관상 혈관 그래프트를 형성하기 위해 적층된다. 이 방법의 장점은 "링 스태킹 방법"를 지칭하는 부착 성 세포 유형 단순히 수정 가이드 삽입함으로써 생성 될 수있는 플레이트 셋업 및 조직 환 또는 원하는 응용에 필요한 크기의 튜브에 접종 될 수 있다는 것이다. 조직의 조직 공학 작성 반지의 비교 기술은 각각의 원하는 크기 금형의 재생산을 필요로하는 규모, ^{15, 16} 어려운 남아있다. 또한, 혈관 이식이 생성 될 수있다이 방법을 사용하여 만든2-3 주 내에 D는 몇 주 빨리 다른 설계 선박에 비해. ^{도 6은} 병원,이 시간 차이는 저하 환자의 치료에 유의 한 차이를 만들 수있다.

프로토콜

1. 세포 배양 준비

1. 시중에서 구입 한 인간의 대동맥 평활근 세포를 활용합니다.
2. 88.6 %로 이루어지는 평활근 세포 증식 배지에서 세포를 유지 231 미디어 0.1 % 재조합 인간 인슐린 (RH 인슐린), 재조합 인간 섬유 아세포 성장 인자 (RH-FGF), 재조합 인간 상피 성장 인자 (RH-FGF)의 각 아스코르브 산; 5 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 L- 글루타민 각각; 1 % 항생제 / 항진균제.
   참고 : 각 성장 인자, FBS와 L 글루타민은 혈관 미디어의 성장 키트로 구입하고 있습니다.
3. 변경 미디어가 셀 때까지 48 시간마다 약 90 %의 합류 및 조직 시딩에 대한 준비가되어 있습니다.
4. 확장을위한 미디어의 변화 사이에 인큐베이터에 보관 세포.

2. 3D 프린터로 삽입 및 사용자 정의 실리콘의 제조 성형 판

1. (예를 들어, 플리 미니) 3D에이 판 인서트를 인쇄 상업용 3D 프린터를 사용합니다.
   1. 연산을 사용하여소스 3D 설계 소프트웨어 욕실 등 블렌더로 인쇄 된 외부 쉘과 게시물의 3D 모델을 만들 수 있습니다.
   2. 3 차원 프린터의 소프트웨어의 이식성을 위해 허용하는 .STL 형식을 통해 모델의 드라이버 파일을 내 보냅니다.
   3. 3 차원 프린터에 넣은 폴리를 사용하여 인쇄 게시물과 외부 쉘 (젖산) 필라멘트 (PLA) 생성합니다.
   4. 인쇄 후, 30 분마다 삽입 살균하는 70 % -100 %의 에탄올 용액에 담근 수행한다.
2. 폴리 (디메틸 실록산) 중합체의 혼합물 (PDMS) 실리콘 중합체를 기반으로 10 분 동안 실온에서 탈기 혼합물 있도록 1:10 경화제를 준비한다.
   1. 페트리 접시 소형 (35mm)로 사용 크기 (60mm) 중간 및 대형 (100mm)를 정의합니다.
   2. 이 용액 4 mL를 각각 각 작은 중간 큰 접시에 경화 실리콘의 6 mL를 넣어 페트리 접시의 전체 바닥에서 얇은 층을 만들 수 있습니다.
   3. 에 PDMS를 부어 작은 판에 대한 게시물을 작성7mm의 높이 100mm 기판과는 2 ~ 3 시간 동안 60 ℃에서 핫 플레이트 경화 할 수있다. 그런 다음 원통형 게시물을 펀치하기 위해 5mm 생검 펀치를 사용합니다. 각 실린더 PDMS 각각 작은 접시의 중앙에 고정 경화 PDMS의 작은 금액을 사용합니다.
   4. 중간과 큰 판의 경우, 사전은 판의 하단에있는 PDMS의 경화를 완료 3D 인쇄 게시물을 각각 10mm와 중앙 각 중간과 큰 판에 직경 20mm를 배치합니다. 큰 판의 경우, 추가로 3D 인쇄 된 외부 쉘에게 포스트에서 직경 등거리 약 66.7 mm를 배치합니다.
      1. 각 접시 중합체의 탈 18 시간 허용, 2-3 시간 동안 60 ℃에서 핫 플레이트상에서 야외에서 경화 할 수있다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 적절한 영역과 방향으로 판에 인쇄 된 구성 요소를 수정합니다.
   5. 모든 PLA의 내부에 30 분 동안 30 % 증류수 70 % 에탄올의 용액을 추가다음 멸균 TES 및 각 판 커버.
   6. 조심스럽게 각 플레이트에서 에탄올을 기음과 공기 건조를 할 수 있습니다.
   7. 뚜껑, 페이스 업 옆에 생물 안전 캐비닛 (BSC)의 각 판을 정렬합니다. 멸균을 완료하기 위해 30 분 동안 BSC하에 UV 광에 접시 뚜껑을 노출. 무균 기법은 UV 노광 후의 모든 단계를 수행한다.

평활근 세포 및 플레이트의 유지 관리와 시드 섬유소 히드로 겔 3. 준비,

1. 각각 작은 중간 큰 접시 크기 0.5 ㎖, 1.1 mL의 1.81 (M1)의 양으로 성장 배지 + 0.01 %의 TGF-β1을 포함 피브린 겔 용액을 혼합한다.
   1. 각각, 각 작은 중간 큰 판의 미디어에 100 U / mL로의 재고에서, 40 μL, 88.4 μL 및 트롬빈의 145 μL를 추가합니다. 조심스럽게 그 트롬빈 균등 미디어 내에서 혼합 보장하기 위해 손으로 각각의 판을 소용돌이 친다.
   2. 다음에, (160)을 추가(1) 20 mg을 주식에서 L, 354 μL 580 μL 피브리노겐은 / mL의 드롭 현명한 원을 트롬빈 미디어 혼합물에 각각의 작은 중간 큰 판에 각각. 부드럽게 더 레이어로 혼합하여 하이드로 겔의 분포를 확인하기 위해 손으로 소용돌이 친다.
   3. 하이드로 겔은 실온에서 10~15분에 대한 치료 할 수 있습니다.
2. 를 Trypsinize 평활근 세포는 표준 프로토콜에 따른 150mm 세포 배양 접시와 원심 분리기에서 확장. 미디어 (231), 1 % FBS, 1 % 항생제 / 항진균제 - 생성 된 펠렛을 98 %로 구성된 분화 매체 3 ㎖에 재현 탁한다.
   1. 적극적으로 모든 세포 덩어리를 깨고 2 mL를 피펫와 적정에 의해 아래로 세포를 혼합한다. 혈구와 세포를 계산 및 / mL의 작은 중간 큰 판에 대한 각각 2 × 10 ⁶ 세포 / ㎖, 1.0 × 10 ⁷ 세포 / ㎖의 1.4 × 10 ⁷ 세포의 세포 현탁액을 만들 수 있습니다.
   2. 각각의 세포 현탁액의 INT의 1 ML을 추가합니다OA 50 ML 원뿔을 대응하는 작은 중간 및 대형 레이블. 원하는 각 추가 조직 링이 방식으로 추가로 50 ML 원뿔을 설정합니다.
   3. 각각, 각 작은 중간 및 대형 선박 2 mL를 4 mL의 5 ㎖의 최종 시드 볼륨을 얻기 위해 각 원추형으로 차별화 미디어를 추가합니다. 그런 다음, 조심스럽게 적가 각 해당 판에서 제조 된 하이드로 겔 위에 셀 솔루션을 피펫.
   4. 37 ° C에서 인큐베이터 5 % CO _2에 장소 플레이트.
3. 변경 차별화 미디어 각 판마다 48~72시간. 큰 플레이트의 경우에, 그 후, 처음 24 시간 후에 매체를 변경 대 세포 접종 밀도를 보상하도록마다 48-24시간 변경.
   1. 반지로 2-4일 완전히 포스트쪽으로의 계약을 체결 한 것입니다 후, 각각 각 작은 중간 및 대형 링에 10 μL, 20 μL 및 TGF-β1의 35 μL를 추가합니다. TGF-β에 노출 된 후1 최소 24 시간, 고리는 처리 할 준비가 된 것입니다.

혈관 구축 및 유지 보수 4. 조립

1. 최종 혈관 구조의 제조하기 전에, 전문 용기는 완성 된 선박을 보유 만들어집니다.
   1. 작은 용기를 들어, 50 mL의 폴리 카보네이트 원뿔 관의 맨 오프 2 인치 부분을 절단하여 링 스태킹 키가 큰 판을 만든 다음 PDMS 35 밀리 판으로 절단 가장자리를 붙입니다. 판 덮개로 원추형 뚜껑을 사용하십시오.
   2. 판을 적층 중간 및 대형 용기 키 링의 경우, 길이 키가 큰 판 벽 역할을하는 2.5 인치 섹션으로 1.75 인치 직경의 폴리 카보네이트 튜브를 잘라. 키가 큰 접시 바닥의 경우, 2 인치 직경의 원형 조각으로 0.125 인치 두께의 폴리 카보네이트 시트를 잘라. 아크릴계 시멘트 용매를 사용하여 원형 절단 부분에 폴리 카보네이트 튜브 섹션을 결합한다. 키가 큰 접시의 뚜껑으로 60mm 페트리 접시에서 뚜껑을 사용하십시오.
   3. 3D 피RINT 포스트 (5)의 직경 (10)과 20 mm, 길이 50 ​​mm이다.
   4. 각 컨테이너에 경화 실리콘의 10 ML을 추가합니다. 앞서 PDMS의 전체 경화, 중앙 각 작은 중간 및 대형 용기에 단계 4.1.3에서 만든 각 게시물을 배치합니다.
   5. 2-3시간 60 ° C에 핫 플레이트 세트에 치료 할 수 있습니다.
   6. 30 분 동안 30 %의 증류 물을 70 % 에탄올 용액으로 소독.
   7. 조심스럽게 각 컨테이너에서 에탄올을 대기음 후, BSC 공기 건조를 할 수 있습니다. 다음, 뚜껑, 페이스 업 옆에 배치 각 플레이트와 후드의 컨테이너를 정렬합니다. 상기 멸균 추가 30 분 동안 BSC하에 UV 광에 노출 용기. 자외선 노출 후 모든 단계 멸균 기술을 사용합니다.
2. 아주 좋은 집게를 사용하여 조심스럽게 게시물에서 각 단단히 압연 평활근 하이드로 겔 링을 제거하고 높은 게시물과 그에 대응하는 더 큰 용기에 전송할 수 있습니다.
   1. 한 쌍을 사용하여각 손에 집게와는 게시물에서 반지의 한쪽을 들어 올린 다음 다른. 보호하고 루멘 유지에주의해야합니다.
   2. 키가 큰 포스트에 첫 번째 측면, 반지의 다음 다른 쪽을 슬라이딩,이 두 손 방법으로 전송을 수행합니다. 부드러운, 점진적으로 운동을 사용하여 원주 작업, 천천히 키가 큰 포스트에 내려 반지를 밀어 넣습니다. 원하는 선박 길이가 각 원형은 완성 된 구조체에 길이 약 1-2mm를 추가로 획득 할 때까지 계속해서 조직 고리를 스택.
3. 포스트는 작업 표면과 평행이되도록 키가 큰 3D 인쇄 된 게시물에 위치 링 스택, 접시를 켭니다.
   1. 마이크로 피펫을 사용하여, 각각, 각 작은 중간 큰 용기의 외면에 부드럽게 100 U / ㎖의 농도로 트롬빈의 40, 80, 160 μL를 추가한다. 트롬빈을 추가하는 동안 천천히 구조의 모든 표면의 범위를도 보장하기 위해 판을 돌립니다.이 건설 후 초기 일 링 스택 구조를 확보하기 위해 사용되는 섬유소 접착제의 기본이 될 것입니다.
   2. 다음으로, 빨리 구조체를 회전시키면서 마이크로 피펫을 사용하여 각각, 각 작은, 중간, 큰 구성하는 20 ㎎ / ㎖ 농도의 피브리노겐 40, 80, 160 μL를 추가한다. 트롬빈 및 섬유소원 빠르게 한 번 혼합 회사 겔로 설정합니다. 때문에 짧은 경화 시간에 가능한 한 신속하고 균일하게 피브리노겐을 적용합니다.
4. 구조물을 들고 각 컨테이너에 분화 매체의 20 ML을 추가합니다. 37 ° C를 인큐베이터에 배치 용기가 필요할 때까지. 모든 3~5일 미디어를 변경합니다.

결과

여기에 입증 된 것은 반지 스태킹 방법 (RSM)는 확장 성이 있음을 보여주는 3 가지 설계 혈관 이식 크기 (그림 1)의 제조입니다. 적용 가능성을 증명하기 위해, 3 개의 다른 용기 크기는 동맥 좌전 하행에 대한 실제 인간의 혈관 크기에 상관 관계를 선택 (작은 직경 루멘 = 4mm) ¹⁷ (중간 직경 루멘 = 10mm) 대동맥 내림차순과 상행 대동맥 (대형; 내강 ?...

토론

반지 스태킹 방법은 현재의 혈관 조직 설계 구조 기술을 통해 여러 이점을 제공합니다. RSM은 단순히 포스트 및 외부 쉘 크기를 사용자 정의하여 모든 규모의 인간의 혈관을 생성하도록 할 수 있습니다. 우리의 방법은 인간 세포만을 급속 신체의 자연적인 상처 치유 과정에서 발견 된 지지체 물질을 분해 이루어지는 중합체 프리 설계된 선박 개발을 허용한다. 폴리머 이식은 병원에서 재 협착을 일...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody