JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.

Abstract

SPHIX (SPARX למיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה) הוא קוד פתוח חדש, חבילת תוכנה ידידותית למשתמש לעיבוד אוטומטי למחצה של חלקיקים בודדים של קריאת מיקרוסקופ אלקטרונים (cryo-EM). הפרוטוקול המוצג כאן מתאר בפירוט כיצד להשיג מבנה אטומי ברזולוציה כמעט החל cryo-EM סרטים micrograph ידי הדרכת משתמשים בכל השלבים של צינור יחיד קביעת מבנה החלקיקים. צעדים אלה נשלטים מממשק המשתמש הגרפי החדש של SPHIRE ודורשים התערבות משתמש מינימלית. באמצעות פרוטוקול זה, מבנה 3.5 Å של TcdA1, מורכב רעלן Tc מ luminescens Photorhabdus , נגזר רק 9500 חלקיקים בודדים. גישה זו יעילה יעזור למשתמשים טירון ללא ניסיון עיבוד נרחב מידע מבניים מראש , כדי להשיג מודלים ללא אטום ללא רעש וללא משוא פנים של קומפלקסים macromolecular מטוהרים שלהם במדינה יליד.

Introduction

לאחר הפיתוח של טכנולוגיית גלאי האלקטרונים הישירה, ההתקדמות המדהימה של חלקיק יחיד cryo-EM כרגע עיצוב מחדש ביולוגיה מבנית 1 . לעומת קריסטלוגרפיה רנטגן, טכניקה זו דורשת רק כמות קטנה של חומר חלבון ללא צורך התגבשות, בעת ובעונה אחת מציב פחות מגבלות לגבי טוהר המדגם ועדיין המאפשר קביעת מבנים ברזולוציה אטומית כמעט. חשוב לציין, קומפוזיציות או מדינות שונות יכולות כעת להיות מופרדות באופן חישובי וקביעת המבנה של הקונפורמיות השונות יכולה להתבצע ברמה חסרת תקדים של פירוט. לאחרונה, מפות צפיפות של מולקולות מאתגרות יכול להיות מיוצר על החלטות המאפשר בניית מודל novo ובכך הבנה עמוקה של מצב הפעולה שלהם 2 , 3 , 4 , 5.

מגוון רחב של עיבוד תמונה חבילות תוכנה זמינים 3DEM (3D אלקטרונים מיקרוסקופיה) הקהילה (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ורובם נמצאים תחת פיתוח מתמשך. רזולוציה כמעט אטומית הושגה עבור חלבונים המציגים משקולות מולקולריות שונות וסימטריות עם מספר חבילות תוכנה שונות, כולל EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 ו- SPARX 11 . כל חבילה דורשת רמה אחרת של מומחיות המשתמש ומספקת רמה אחרת של הדרכה למשתמש, אוטומציה והרחבה. יתר על כן, בעוד כמה תוכניות לספק סביבות מלאות כדי להקל על כל השלבים של ניתוח התמונה, אחרים נועדו לייעל משימות ספציפיות, כגון חידוד של פרמטרים יישור החל מ r ידועמבנה האספקה. לאחרונה, פותחו מספר פלטפורמות, כולל APPION 12 ו- SCIPION 13 , המספקות צינור עיבוד יחיד המשלב גישות ופרוטוקולים מחבילות התוכנה השונות המפורטות לעיל.

כדי לתרום לפיתוח הנוכחי של cryo-EM, SPARX פותחה מחדש לתוך פלטפורמת עצמאית חדשה מלאה עבור ניתוח חלקיקים בודדים, הנקראת SPHIRE (SPARX למיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה). על מנת להגביר את הנגישות של הטכניקה לחוקרים חדשים בתחום ולהתמודד עם כמות גדולה של נתונים המיוצרים על ידי מיקרוסקופים אלקטרונים מודרניים לחלוטין אוטומטיים מתקדמים, צינור העיבוד עוצב מחדש ופשוט על ידי הצגת קל לשימוש ממשק משתמש גרפי (GUI) ואוטומציה של השלבים העיקריים של זרימת העבודה. יתר על כן, אלגוריתמים חדשים נוספו כדי לאפשר מהיר, לשחזור אוטומטי קביעת מבנה מ crYo-EM תמונות. יתר על כן, אימות על ידי reproducibility הוכנס על מנת למנוע artifacts משותף המיוצר במהלך חידוד וניתוח הטרוגניות.

למרות שהתוכנית השתנתה במידה ניכרת, תכונות הליבה המוערכות שלה נשמרו: קוד פתוח של קוד פתוח, עיצוב מודרני מונחה עצמים וממשקי Python עבור כל הפונקציות הבסיסיות. לכן, זה לא השתנה לתוך תוכנית קופסה שחורה, המאפשר למשתמשים ללמוד בקלות לשנות את קוד Python, כדי ליצור יישומים נוספים או לשנות את זרימת העבודה הכוללת. זה שימושי במיוחד עבור פרויקטים שאינם סטנדרטיים cryo-EM.

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגת מפת אטומי ברזולוציה אטומית כמעט מ cryo-EM תמונות באמצעות GUI של SPHIRE. הוא מתאר בפירוט את כל השלבים הנדרשים כדי ליצור מפה צפיפות מ cryo-EM ישיר גלאי סרטים אינו מוגבל לכל סוג מקרומולקולה מסוים. פרוטוקול זה בעיקר מתכוונת להדריך newcOmers בתחום באמצעות זרימת עבודה ולספק מידע חשוב על צעדים מכריעים של העיבוד, כמו גם כמה מכשולים אפשריים ומכשולים. תכונות מתקדמות יותר ואת הרקע התיאורטי מאחורי SPHIRE יתוארו במקומות אחרים.

Protocol

הערה: כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, יש צורך להתקין כראוי SPHIRE על מערכת עם התקנה MPI (כרגע, אשכול לינוקס). הורד את SPHIRE ואת מערך הנתונים TcdA1 מ http://www.sphire.mpg.de ופעל לפי הוראות ההתקנה: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. הליך זה גם מתקין את EMAN2. SPHIRE משתמש כרגע e2boxer של EMAN2 עבור בחירת החלקיקים e2display להצגת קבצי תמונה. עבור תיקון תנועה משוקלל במינון של סרטים micrograph גלם, SPHIRE משתמש unblur 14 . הורד את התוכנית ובצע את הוראות ההתקנה (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, מעבדת Grigorieff). עבור הדמיה אינטראקטיבית של מבנים וכתוצאה מכך, פרוטוקול ישתמש בתוכנה גרפיקה מולקולרית כימרה 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). הדרכה יפה להכיר את התכונות בשימוש בכל פרוטוקול זה יכול להיות fouNd here: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. הוראות כיצד להגיש עבודה מקבילה לאשכול מה- GUI SPHIRE ניתן למצוא כאן: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. הארגון הכולל של GUI SPHIRE ואת הצעדים העיקריים של זרימת העבודה שבוצעה לאורך פרוטוקול זה מתוארים באיור 1 .

1. פרויקט: קבע ערכי פרמטרים קבועים עבור פרויקט זה

  1. הפעל את יישום GUI SPHIRE על ידי הקלדת " sphire &" ומקש ENTER בחלון מסוף.
  2. התאם את הפרמטרים של הפרוייקט כולו ( לדוגמה, גודל הפיקסלים, רדיוס החלקיקים והסימטריה) בשדות הקלט המתאימים בדף הגדרות הפרוייקט ולאחר מכן רשום ערכים אלה עבור כל השלבים הבאים של זרימת העבודה.
    1. לחץ על הסמל "פרוייקט" בפינה השמאלית התחתונה של החלונית השמאלית כדי לפתוח את דף הגדרות הפרויקט.
      2. למשל, אם חלקיק הוא 200 ארוך וגודל פיקסל הוא 1.2 Å / פיקסל, אז הציר הארוך ביותר של החלקיק הוא 200 / 1.2 = ~ 166 פיקסלים והרדיוס 166/2 = 83 פיקסלים).
    2. הגדר "גודל תיבת החלקיקים" לפחות 1.5 פעמים של גודל החלקיקים. הימנע מחלונות הגדלים המכילים מספר ראשוני גדול. כמו כן, זכור כי אלגוריתם חידוד 3D כרגע דורש גודל תיבת ממוספר אפילו.
      הערה: על החלון לכלול שוליים כדי להסביר שגיאות מרכזיות ראשוניות הנובעות מבחירה (הצורך להזיז חלקיקים בתוך החלון) ולאיזור רקע מספיק מחוץ לגבולות החלקיקים עבור תיקון CTF תקין (חשוב במיוחד עבור ערכי defocus גדולים 16).
    3. הגדר "גודל חלון CTF" לזה של "גודל תיבת החלקיקים". עבור פרויקטים עם נתוני ניגודיות נמוכה, השתמש בחלון גדול יותר כדי לקבל הערכות חלקות של ספקטרום הספק.
    4. הגדר "סימטריה קבוצת נקודות" של המתחם ( למשל, "C5"). אם הסימטריה של מבנה המטרה אינה ידועה, השאר אותה ב "C1" (אסימטרי). עם זאת, אם סימטריה ספציפית בהזמנה גבוהה מזוהה בשלב מאוחר יותר במהלך העיבוד, שנה את הגדרת הסימטריה בהתאם וחזור על השלבים לאחר יישור דו-ממדי עם ISAC.
    5. הגדר "פרוטאין המסה המולקולרית" ב kDa (ערך משוער יספיק). לחץ על "הרשמה הגדרות" כפתור.

2. סרט: ליישר את המסגרות של כל Micrograph הסרט כדי לתקן את התנועה הכוללת של המדגם

  1. עבור כל micrographs הסרט, לחשב את x / y- משמרות עבור כל המסגרות ולאחר מכן ליצור מינון שלהם משוקלל ו- D משוקללממוצע תיקון (ראה דיון). שים לב כי הראשונה נחוצה רק להערכת ה- CTF משום שהאומדן אינו פועל היטב עם הממוצעים המשוקללים של המינון, בעוד שהאחרון משמש לכל השלבים האחרים של קביעת המבנה.
    1. לחץ על הסמל "MOVIE" ולאחר מכן על הלחצן "Micrograph Movie Alignment". הגדר "נתיב הפעלה Unblur" על ידי בחירת קובץ ההפעלה. הגדר "קלט תבנית micrograph נתיב" על ידי בחירת מיקרוסקופ הסרט גלם לא מסודרים ולהחליף את החלק המשתנה של שמות הקבצים עם התו הכללי "*" ( למשל, TcdA1 _ *. Mrc). ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. הגדר "Summovie הפעלה נתיב" על ידי בחירת קובץ ההפעלה.
    3. הגדר "מספר מסגרות הסרט" למספר מסגרות בכל מיקרוסקופ הסרט. הגדר את "מיקרוסקופ מתח" ו "חשיפה לכל מסגרת" לערכים המשמשים במהלך איסוף הנתונים. (עבור exampLe, אם המינון הכולל הוא 60 e / / Å 2 עם 20 מסגרות נרשם ללא חשיפה מראש, החשיפה לכל מסגרת היא 60/20 = 3 e - / A 2. ) לחץ על כפתור "הפעלה" כדי ליישר את מסגרות של כל מיקרוסקופ הסרט.
      הערה: פעולה זו תיצור באופן אוטומטי שתי ספריות פלט המכילות מיקרוגרפים ממוצעים מתוקנים במינון ממוצע ולא מתוקן.

3. CTER: להעריך את Defocus ופרמטרים אסטיגמציה של CTF

  1. להעריך את הפרמטרים CTF (defocus ו אסטיגמציה, אחרים נקבעים על ידי המשתמש) עבור כל מיקרוסקופ מינון ממוצע משוקלל.
    1. לחץ על "Ctr" סמל ולאחר מכן את "CTF אמידה" כפתור. כדי להגדיר "קלט תבנית נתיב micrograph", בחר במיקרוגרף ללא שינוי בתנועה מתוקנת, ולאחר מכן להחליף את החלק המשתנה של שמות הקבצים עם התו הכללי"*". כמו כן, ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. הגדר "ניגודיות משרעת" לערך המשמש באופן שגרתי עבור סוג של נתונים (עובי הקרח הוא גורם מרכזי) ומיקרוסקופ מתח במעבדה ( למשל, 10%). ערכים טיפוסיים הם בטווח 7 - 14% 17 .
    3. הגדר "מיקרוסקופ כדוריות aberration (Cs)" ו "מיקרוסקופ מתח" בשימוש במהלך איסוף הנתונים.
    4. הגדר "תדר הנמוך ביותר" ו "תדירות הגבוהה ביותר" של טווח החיפוש עבור מודל CTF מתאים ל 0.0285 ו - 0.285 Å -1 (40 - 4 Å), בהתאמה. לחץ על "הפעלה הפקודה" כפתור כדי להעריך את הפרמטרים CTF.
      הערה: הפרמטרים של CTF יישמרו באופן אוטומטי בקובץ partres.txt בספריית הפלט שצוינה. הערכת CTF של 112 מיקרוגרף חושבה על 96 ליבות וסיים לאחר ~ 3 דקות על אשכול לינוקס השתמשו כדי להשיג את התוצאות נציג.

4. WINDOW: חלץ חלקיקים מהמיקרוגרפים הממוצעים המשוקללים

  1. פיק חלקיקים באופן ידני או אוטומטי מ micrographs עם e2boxer 6 וליצור קבצים לתאם, כל המכיל רשימה של xy קואורדינטות החלקיקים בתוך המיקרוגרפיה הקשורים.
    1. לחץ על סמל "WINDOW" ולאחר מכן על "בחירת החלקיקים" כפתור. לחץ על "הפעלה הפקודה" כפתור להתחיל e2boxer 6 ולבחור את החלקיקים של כל micrograph ידנית או אוטומטית 18 (ראה דיון ). אחסן את קואורדינטות החלקיקים הסופיים עבור כל מיקרוסקופ בתבנית הקובץ EMAN1 (.box). לחלופין, ייבא את קבצי הקואורדינטות מתוכניות אחרות לאחר המרתן לפורמט EMAN1.
  2. יצירת ערימות החלקיקים על ידי חילוץ תמונות החלקיקים מן המיקרוגרפים משוקלל במינון (ב SPHIRE, מחסנית החלקיקים הוא oftנקרא פשוט "מחסנית").
    1. לחץ על "החלקיקים החילוץ" כפתור. ציין "קלט תבנית micrograph נתיב" על ידי בחירת מיקרוסקופ משוקלל בתנועה בתנועה ולאחר מכן להחליף את החלק המשתנה של שמות הקבצים עם התו הכללי "*" ( למשל, TcdA1 _ *. Mrc). כמו כן, בחר "תבנית הקואורדינטות קלט קלט" על ידי בחירת קובץ קואורדינטות ( למשל, TCDA1 _ *. ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. הגדרת "מקור פרמטרים CTF" על ידי בחירת קובץ פרמטר CTF (partres.txt המיוצר בשלב 3.1). לחץ על הלחצן "הפעל פקודה".
  3. שלב את החלקיקים שחולצו תמונה ערימות לתוך אחד.
    1. לחץ על "החלקיקים מחסנית" כפתור. ציין את הנתיב "פלט מחסנית תמונה וירטואלית" באמצעות תבנית קובץ BDB נתיב ( למשל, "bdb: חלקיקים / מחסנית", שבו "חלקיקים" נקודותE בספרייה המכילה ספריית מסד נתונים BDB ששמה תמיד EMAN2DB ו "מחסנית" מתייחס ערימת תמונה מסוימת בתוך מסד נתונים זה). ציין "קלט BDB תמונה מחסנית דפוס" על ידי בחירת ספרייה מתחיל עם "mpi_proc" ולאחר מכן להחליף את החלק המשתנה של שמות הספרייה עם התו הכללי "*" ( למשל, חלקיקים / mpi_proc_000 לחלקיקים / mpi_proc_ *). לחץ על הלחצן "הפעל פקודה".

5. ISAC: סיווג של תמונות החלקיקים ב 2D

  1. חישוב ממוצעים בכיתה 2 ד על ידי יישור חלקיקים אשכולות אותם על פי המראה שלהם 2D.
    הערה: למוצגים הדו-ממדיים המתקבלים יש יחס משופר של אות לרעש (SNR) בהשוואה לתמונות החלקיקים האינדיבידואליות, ולכן הם משמשים להערכה ויזואלית של האיכות וההטרוגניות של מערך הנתונים, וכן למיין תמונות לא רצויות מהמחסנית ( למשל גבישי קרח, קצוות פחמן,אגרגטים, שברים וכו ' ). יתר על כן, הם ישמשו לאחר מכן כדי לקבוע מודל 3D הראשונית.
    1. לחץ על סמל "ISAC" ולאחר מכן את "ISAC - 2D Clustering" button.Set "קלט מחסנית תמונה" על ידי בחירת קובץ מחסנית המכילה את החלקיקים שחולצו. ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. השתמש 200 - 1000 עבור "תמונות בכיתה". בחר את המספר המתאים בהתחשב במספר הצפוי של כיתות 2D (המספר הכולל של חלקיקים מחולק במספר התמונות בכיתה). התאם פרמטר זה בהתאם ל- SNR ולגודל מערך הנתונים. הגדל את מספר החברים לכיתה למקרה שמערכת הנתונים רועשת יתר על המידה. להקטין את מספר כאשר מספר נמוך של חלקיקים זמין.
      הערה: בשל מגבלות הזיכרון, עבור מערכי נתונים גדולים למדי (> 100,000 חלקיקים), לפצל את מערך הנתונים המלא לתוך תת, לבצע ISAC עבור כל תת משנה באופן עצמאי, ולשלבאת התוצאות בסוף. הוראות מפורטות לתרחיש עיבוד זה ניתנות ב- http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php.
    3. סמן את תיבת הסימון "שלב להעיף". שמור את ערכי ברירת המחדל עבור "היעד חלקיק רדיוס" ו "היעד חלקיק גודל התמונה" כדי להאיץ את התהליך על ידי אוטומטית מכווץ את כל התמונות החלקיקים עם הגדרות אלה. לחץ על "הפעלה הפקודה" כפתור לחשב את ממוצעים בכיתה 2 ד.
      הערה: שלב זה הוא תובעני חישוב הזמן פועל מגדיל באופן משמעותי עם מספר החלקיקים והשיעורים, כמו גם את רדיוס היעד ואת גודל התמונה. על אשכול עם 96 תהליכים, הסיווג 2D של ~ 10,000 חלקיקים סיים לאחר כ 90 דקות.
  2. הצג ובדוק באופן חזותי את ממוצבי ISAC הדו-ממדיים כדי לוודא שהאיכות שלהם משביעת רצון (ראה דיון).
    1. לחץ על הלחצן "הצג נתונים" תחת "UTILITIES". הגדר ", קלט קבצים "על ידי בחירת הקובץ המכיל ממוצעים ISAC 2D (class_averages.hdf המיוצר בשלב 5.1). לחץ על" הפעלה הפקודה "כפתור כדי להציג את הסופי הסופי לשחזור ממוצעים בכיתה נמסר על ידי ISAC.
  3. יצירת מחסנית חדשה, כולל רק את החלקיקים של ממוצעים בכיתה מאומתים.
    1. לחץ על הלחצן "צור ערימת משנה". הגדר "קלט תמונה מחסנית" על ידי בחירת אותו קובץ מחסנית כמו בשלב 5.1.1. הגדר "ממוצעים ISAC" על ידי בחירת ממוצעים ISAC 2D (class_averages.hdf המיוצר בשלב 5.1). ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט". לחץ על הלחצן "הפעל פקודה".

6. VIPER: חישוב מודל תלת-ממדי ראשוני

  1. בחר קבוצה קטנה של ממוצעים בכיתה (≥100 תמונות) על ידי מחיקת כל ממוצעים מחלקה רע תצוגות זהות של החלקיקים (ראה דיון) ולהשתמש בהם כדי לחשב נציגמודל ראשוני roducible באמצעות. זכור כי הבחירה צריכה להכיל לפחות 60-80 ממוצעים באיכות גבוהה עם ~ 200-500 חברים כל אחד.
    1. לחץ על הסמל "VIPER" ולאחר מכן על הלחצן "הצג נתונים". הגדר "קלט קבצים" על ידי בחירת ממוצעים ISAC 2D (class_averages.hdf המיוצר בשלב 5.1). לחץ על הלחצן "הפעל פקודה".
    2. לחץ על הלחצן האמצעי של העכבר במקום כלשהו על חלון הגרפיקה של e2display, והפעל את הלחצן "DEL" בחלון המוקפץ. מחק את כל ממוצעי מחלקה רעים ותצוגות זהות של החלקיק (ראה דיון ). לחץ על הלחצן "שמור" כדי לאחסן את ממוצעי הכיתה הנותרים לקובץ חדש.
  2. מתוך ממוצעי ה- ISAC שנבחרו, צור הפניה ראשונית לעידון התלת-ממד הבא.
    1. לחץ על "ראשוני 3D דגם - RVIPER" כפתור. הגדר "קלט תמונות מחסנית" על ידי בחירת הכיתה מוקרןממוצעים (המיוצרים בשלב 6.1). ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. הקפד להשתמש באותו ערך עבור "היעד רדיוס החלקיקים" כמו שלב 5.1.3 ISAC. לחץ על "הפעלה הפקודה" כפתור כדי ליצור לשכפל ab initio 3D המודל.
      הערה: שלב זה דורש תובלה חישובית וזמן הריצה עולה באופן משמעותי עם מספר הממוצעים והגודל של החלקיקים. על אשכול עם 96 תהליכים, עבודה זו (~ 100 ממוצעים בכיתה) סיים לאחר ~ 15 דקות.
  3. בדוק אם מודל 3D המתקבל הוא סביר על ידי לקיחת בחשבון את ממוצעים בכיתה, בנוסף לשלמות המבנית שלה ( כלומר אין חלקים מנותקים ו / או חפצי כיווניים). כדי להציג את המפה, השתמש בתוכנית כימרה 15 . בשלב זה, לבצע השוואה ראשונה עם המבנה הגבישי של חלבון הומולוגי או תחום של חלבון של עניין אם הוא קיים (דוגמה מוצג בסעיף Represeתוצאות ntative).
  4. עבור חידוד 3D הבאים, ליצור התייחסות תלת-ממדית ראשונית ומסכת תלת-ממד ממודל תלת-ממד תלת-ממדי על-ידי הסרת הרעש שמסביב ושינוי גודל הפיקסלים בהתאם לגודל הפיקסל המקורי.
    1. לחץ על "צור 3D הפניה" כפתור. הגדר "נפח קלט" על ידי בחירת מודל 3D init init (ממוצע_volume.hdf המיוצר בשלב 6.2). ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. הגדר "מקור יחס הדגימה" על ידי בחירת קובץ יחס הפסיכולוג של ISAC (README_shrink_ratio.txt המיוצר בשלב 5.1). לחץ על הלחצן "הפעל פקודה".

7. MERIDIEN: לחדד את נפח 3D הראשונית

  1. צמצם את עוצמת הקול בתלת-ממד החל מהמודל התלת-ממדי הראשוני.
    1. לחץ על האייקון "MERIDIEN" ולאחר מכן על הלחצן "3D 3D". הגדר "קלט תמונה מחסנית" ו "הפניה 3D הראשונית" על ידי seleCting מחסנית החלקיקים ואת מודל 3D init ab (מיוצר בשלב 5.3 & 6.4, בהתאמה). ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. הגדר "3D מסכה" על ידי בחירת קובץ מסכה 3D (המיוצר בשלב 6.4). השתמש תמיד במסכה תלת-מימדית, אך במיוחד בשלב מוקדם של ניתוח, השתמש במסכה כדורית או במסכה בעלת קצוות רכים המותאמות לרווחה אל ההתייחסות למניעת הטיה של מיסוך שגוי.
    3. סמן את תיבת הסימון "החל מסכה דו-ממדית קשה". הגדר "החל רזולוציה" לערך תדר הפסקת בין 20 - 25 Å. יש לזכור כי מסנן נמוך לעבור עם תדר זה לחתוך יחולו על המבנה הראשוני 3D כדי להפחית את ההטיה מודל ראשוני.
    4. בדוק את המפרט של אשכול המשמש תהליך זה ולאחר מכן להגדיר "זיכרון לכל צומת" לזיכרון זמין בג 'יגה בייט. לחץ על "הפעלה הפקודה" כפתור כדי לחדד את נפח 3D החל ממודל 3D הראשונית באופן אוטומטי לחלוטין.
      הערה: הליך זה יחלק את מערך הנתונים לשני חצאים, ידקלם את שני הדגמים באופן עצמאי ויפיק שני כרכים גולמיים, כל אחד מחצי החלקיקים בלבד. זה תובעני חישובית זמן הריצה יגדל משמעותית עם מספר החלקיקים. על אשכול זה, עידון מרידיאן סיים לאחר ~ 2.5 שעות רץ על 192 תהליכים (~ 8000 חלקיקים, 352 תיבה בגודל).
  2. צור מסכת תלת-ממד רכה מהכרך המעודן עבור שלב השחזה הבא.
    1. לחץ על "מסתגלת 3D מסכה" כפתור. הגדר "קלט נפח" על ידי בחירת אחד מחצני חצי מסוננים (המיוצר בשלב 7.1). ציין את הנתיב עבור "מסכת פלט".
    2. הגדר ערך של "סף בינאריזציה". השתמש כימרה כדי לוודא כי, בסף מסוים זה, הרעש הוא בבירור מחוץ נפח עניין באזור ממס של חצי מפות מסוננת וכל צפיפויות של החלבון עדיין cמחוברים זה לזה. לחץ על הלחצן "הפעל פקודה" כדי ליצור את מסיכת 3D רכה.
      הערה: הגוף העיקרי של המסכה שהתקבלה (המורכבת מ voxels אשר ערכים הם> 0.5) צריך להתאים היטב את מבנה החלקיקים אבל עדיין לצרף את כל צפיפות של עניין. את קצה רך- off צריך להיות לפחות 8-10 פיקסל רחב.
  3. מזג את שני הכרכים הלא מסוננים למחצה שהושגו על ידי חידוד 3D. לאחר מכן, לחדד את נפח ממוזג על ידי התאמת ספקטרום כוח מבוסס על פונקציית העברת אפנון (MTF) של הגלאי, אומדן B- גורם, ואת FSC (פורייה פגז קורלציה) הערכה של ההחלטה.
    1. בחר בלחצן "חידוד". הגדר "נפח חצי מסונכרן הראשון" ו "השני נפח מסונן השני" על ידי בחירת הקבצים המתאימים (vol_0_unfil.hdf ו vol_1_unfil.hdf המיוצר בשלב 7.1). תמיד להשתמש "שיפור גורם B". בדרך כלל, שמור את ערך ברירת המחדל כדי eלהקטין את הערך B- גורם ממערך קלט באמצעות טווח בין תדר ברזולוציה הסופי 10 Å. לחלופין, ציין ערך אד-הוק ( לדוגמה, -100).
    2. שמור את ערך ברירת המחדל עבור "תדר מסנן נמוך" כדי להחיל מסנן מבוסס FSC.
    3. הגדר "מסופק על-ידי המשתמש" על-ידי בחירת המסכה התלת-ממדית (המיוצרת בשלב 7.2). זכור כי הפתרון המדווח ייקבע באמצעות FSC עם מסכה זו. לחץ על הלחצן "הפעל פקודה" כדי לחדד את אמצעי האחסון התלת-ממדי.
  4. ליצור את המפה הפצה זוויתי 3D מ היטל השלכות של כל החלקיקים מוערך על ידי צעד חידוד 3D לעיל.
    1. לחץ על כפתור "זווית הפצה". הגדר "קובץ פרמטר יישור" על ידי בחירת הקובץ (final_params.txt המיוצר בשלב 7.1), ולחץ על כפתור "הפעלה הפקודה".
  5. בחן את מודל תלת-ממד משוחזר באמצעות צ'ימרה. ודא כי המבנה נראה סביר בהתחשב ברזולוציה שהושגה (ראה דיון ).
  6. בחן את הפצה הזוויתית באמצעות כימרה. ודא שההפצה מכסה בערך שווה את כל שטח הזווית התלת-ממדי. יש לזכור כי עבור מבנים סימטריים, ההפצה מוגבלת בתוך המשולש האסימטרי הייחודי.

8. SORT3D: מיון הטרוגניות 3D על ידי התמקדות באזורים משתנה מאוד

  1. חישוב המפה 3D השתנות מן מחסנית החלקיקים בשימוש חידוד 3D.
    1. לחץ על הסמל "SORT3D" ולאחר מכן על "3D Variability Estimation" כפתור. הגדר "קלט תמונה מחסנית" על ידי בחירה באותו מחסנית החלקיקים מוקרן נתון שלב 3D חידוד 7.1.1. ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. שמור את ערך ברירת המחדל עבור "מספר התחזיות".
      הערה: התמונות מן השכן הזוויתימכסה המנוע ישמש לאמוד את השונות הדו-ממדית בכל זווית השלכה תלת-ממדית. ככל שהמספר גדול יותר, כך הרעש פחות אומדן, אבל הרזולוציה התחתונה והיצירות הסיבוביות בולטות יותר.
    3. סמן את תיבת הסימון "השתמש ב- CTF". לחץ על הלחצן "הפעל פקודה".
  2. השתמש במפת השוני של 3D כדי ליצור מסיכת פוקוס עבור שלב האשכולות בתלת-ממד שמתחת.
    1. בחר את הלחצן "3D מסכה בינארי". הגדר "קלט נפח" על ידי בחירת המפה 3D השתנות (המיוצר בשלב 8.1). ציין את נתיב הקובץ עבור "מסכת פלט".
    2. הגדר "סף בינאריזציה" באמצעות הפלט של השדה "רמה" ב "Volume Viewer" של כימרה. לחץ על הלחצן "הפעל פקודה".
  3. מיין תמונות חלקיקים לקבוצות מבניות הומוגניות על ידי התמקדות באזורים שונים מבחינה מבנית.
    1. לחץ על "3D Clustering - RSORT3D" כפתור.הגדר "קלט הספרייה 3D חידוד" על ידי בחירת ספריית הפלט של חידוד 3D (המיוצר בשלב 7.1). ציין את הנתיב עבור "ספריית פלט".
    2. הגדר "3D מסכה" על ידי בחירת מסכה 3D קצוות רך (המיוצר בשלב 7.2). הגדר "פוקוס 3D מסכה" על ידי בחירת המפה binaryized 3D משתנות (המיוצר בשלב 8.2).
    3. עבור מערכי נתונים גדולים, השתמש לפחות ב -10,000-10,000 עבור "תמונות לקבוצה". זכור שהתוכנה תמיד שומרת את מספר התמונות לקבוצה מתחת להגדרה זו. התאם את הערך על ידי בהתחשב במספר הצפוי של קבוצות תלת-ממדיות (המספר הכולל של חלקיקים חלקי הערך "תמונות לקבוצה"), מערך הנתונים, ה- SNR ומידת ההטרוגניות. התחל עם ~ 5-10 קבוצות 3D הראשונית, אם מספר מספיק של חלקיקים זמין, אלא אם כן מספר גבוה יותר של מצבים מבניים שונים במערך צפוי.
    4. השתמש לפחות 5,000-5,000 חלקיקים עבור "גודל הקבוצה הקטן ביותר".שים לב שהתוכנה תתעלם מקבוצות שמספקות מספר נמוך יותר של תמונות מאשר ההגדרה של "גודל הקבוצה הקטן ביותר". לחץ על "הפעלה הפקודה" כפתור לבצע את אשכולות 3D.
      הערה: RSORT3D מחולק לשני שלבים. הראשון "sort3d" צעד למיין את ההטרוגניות 3D. לאחר מכן, הוא משחזר את הכרכים של כל קבוצה מבנית הומוגנית באמצעות פרמטרים יישור 3D שנקבע על ידי שלב 3D עידון לעיל. השני "rsort3d" צעד מוצאת חברי לשחזור של כל קבוצה על ידי ביצוע השוואה דו כיוונית של שני ריצות מיון עצמאית. לאחר מכן, הוא משחזר מבנים הומוגניים באמצעות רק את החלקיקים שהוקצו reproducibly. על אשכול עם 96 ליבות, עבודה זו (~ 8000 חלקיקים, 352 גודל התיבה) סיים לאחר כ 3 שעות.
  4. לאחר התוכנית סיימה, להשתמש כימרה לבחור קבוצה 3D הומוגנית. בחר את המבנה של רזולוציה נראית לעין הגבוהה ביותר, בדרך כלל משויך ביותר poקבוצת צפצופים. ודא כי המבנה הנבחר הוא סביר מבחינה ויזואלית על ידי לקיחה בחשבון ממוצעים בכיתה 2 ו היבטים ביולוגיים של חלבון של עניין (ראה דיון ). אם יש כרכים אחרים שיש להם מבנה כמעט זהה ברזולוציה דומה, לשקול אותם כמו לצאת מתוך קבוצה אחת הומוגנית 3D.
  5. בצע עידון מקומי נגד חברי החלקיקים של קבוצת הומוגנית 3D ביותר (עם הרזולוציה הגבוהה ביותר).
    1. לחץ על הלחצן 'משנה משנה מקומית' '. הגדר "Subset text file path" על ידי בחירת קובץ טקסט המכיל את מזהי החלקיקים של הקבוצה שנבחרה ( לדוגמה, Cluster0.txt המיוצר בשלב 8.3). בחר "ספריית חידוד 3D" על ידי בחירת ספריית הפלט של חידוד 3D הקודם (המיוצר בשלב 7.1).
    2. הגדר "הפעלה מחדש איטרציה" לזה שבו הרזולוציה הגבוהה ביותר מושגת חידוד 3D הקודם. לחץ על"הפעלה הפקודה" כפתור לבצע חידוד מקומי של האוכלוסייה שנבחרה של חלקיקים.
  6. בדומה לשלב 7.2, ליצור מסכה רכה 3D מסוף מחצית נפח הסופי מסוננים משוחזר על ידי עידון המשנה המקומי.
  7. בדומה לשלב 7.3, למזג שני מחצנים הסופי הסופי מסוננת נגזר על ידי משנה משנה המקומית לחדד את נפח ממוזג. עם זאת, אל תסנן את עוצמת הקול המחודשת הפעם.
    הערה: אם ניתוח ההטרוגניות בשלב 8.4 מצביע על מספר מדינות ברורות ברזולוציה דומה, ניתן לרסן את כל המדינות השונות באופן עצמאי.

.9 LOCALRES: הערכת הרזולוציה המקומית של אמצעי האחסון התלת - ממדי הסופי

  1. להעריך את הרזולוציה המקומית של נפח 3D המתקבל קבוצה הומוגנית של חלקיקים.
    1. לחץ על הסמל "LOCALRES" ולאחר מכן על כפתור "רזולוציה מקומית". הגדר "מחצית ראשונה נפח" ו "במחצית השנייה-Volume "על-ידי בחירת מסה תלת-ממדית סופית של העידון משנה המשנה המקומי (המיוצר בשלב 8.5) הגדרת" מסכת תלת-ממד "על-ידי בחירה במסכה תלת-מימדית רכה המיוצרת בשלב 8.6. ציין את נתיב הקובץ עבור" עוצמת פלט " .
    2. שמור את ערך ברירת המחדל של 7 פיקסלים עבור "גודל חלון FSC". זכור שההגדרה הזו מגדירה את גודל החלון שבו מחושב המיתאם המקומי - רווחי; גדלי חלונות גדולים יותר מייצרים מפות ברזולוציה חלקה יותר על חשבון יכולת ההחלטות המקומית.
    3. שמור את ערך ברירת המחדל 0.5 של "רזולוציית רזולוציה" עבור קריטריון רזולוציה.
      הערה: עבור כל Voxel, התוכנית תדווח על ההחלטה המקומית כתדירות שבה טיפות FSC המקומיות מתחת לסף הרזולוציה שנבחר. סף הנמוך מ -0.5 אינו מומלץ, שכן ערכי המתאם הנמוכים הם בעלי אי-ודאות סטטיסטית גבוהה. לכן, ההחלטה המקביל המקביל ישתנה מאוד בין voxels.
    4. עבור "אוברהLl רזולוציה ", קבע את הרזולוציה המוחלטת שנאמדה בחידוש לאחר חידוד המשנה המקומי (שלב 8.7) לחץ על הלחצן" הפעל פקודה "כדי לחשב את הרזולוציה המקומית של אמצעי האחסון.
  2. החל את המסנן המקומי התלת-ממדי על עוצמת הקול שחודדה לאחר חידוד המשנה המקומי באמצעות מפת הרזולוציה המקומית התלת-ממדית.
    1. לחץ על "3D מסנן מקומי" כפתור. הגדר את "עוצמת הקול" על-ידי בחירה בנפח התלת-ממד המשוחזר אך ללא סינון (המופק בשלב 8.7). באופן דומה, בחר "קובץ רזולוציה מקומי" ו "3D מסכה" (המיוצר בשלב 9.1 ו 8.6, בהתאמה). זכור כי המסכה 3D מגדיר את האזור שבו הסינון המקומי יחולו. ציין את נתיב הקובץ עבור "עוצמת פלט". לחץ על "הפעלה הפקודה" כפתור כדי להחיל את המסנן המקומי 3D.
  3. השתמש כימרה חזותית לבדוק את מודל 3D הסופי ואת המפה ברזולוציה המקומית 3D (המיוצר בשלב 9.2 ו 9.1, מנוחהEctively). בחר באפשרות "צבע צבע" כדי לצבוע את עוצמת הקול התלת-ממדי בהתאם לרזולוציה המקומית. יש לזכור כי ההפצה של ההחלטה המקומית צריכה להיות חלקה (ראה דיון ).

תוצאות

הפרוטוקול המתואר לעיל בוצע החל 112 סרטים גלאי ישיר של רכיב A של Photorhabdus luminescens Tc מורכבות (TcdA1) 20 , 21 , 22 . מערך נתונים זה הוקלט על מיקרוסקופ קרינה אלקטרונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים בעל שדה בהירות גבוהה (XFEG), הפועל במתח תאוצה של 300 קילו וולט. התמונות נרכשו באופן אוטומטי עם מינון כולל של 60 e - / Å -2 בגודל פיקסל של 1.14 Å על סולם הדגימה. לאחר היישור של מסגרות הסרט ( שלב 2 פרוטוקול ), המתקבל תיקון ממוצעים שהתקבלו היו טבעות איסוטרופי Thon מרחיב ברזולוציה גבוהה ( איור 2 א ). חלקיקים בודדים היו גלויים בקלות מופרדים היטב ( איור 2 ב ). חלקיקים נבחרו מכן באמצעות כלי נחיל של e2boxerLass = "xref"> 18 ( פרוטוקול שלב 4.1 ). במקרה זה, סף מתאים נקבע באמצעות אפשרות סלקטיבית יותר ( איור 2 ג ). 112 המיקרוגרפים הדיגיטליים הניבו 9,652 חלקיקים. רוב התמונות שחולצו ( פרוטוקול שלב 4.2 ) הכיל חלקיקים מוגדרים היטב גודל התיבה שלהם היה פי 1.5 יותר מאשר גודל החלקיקים, כפי שהומלץ ( איור 2 ד ). לאחר מכן, באמצעות ISAC, בוצע ניתוח הטרוגניות דו-צדדית ( פרוטוקול שלב 5 ). זה הניב 98 ממוצעים בכיתה ( איור 3 א ). באמצעות ממוצעים אלה ברמה 2 ד, מודל AB initio חושבה באמצעות ויפר ( פרוטוקול שלב 6 ) ברזולוציה ביניים ( איור 3 ב ). מודל זה מראה הסכם מצוין עם המבנה הגבישי של TcdA1 בעבר נפתרה ב 3.9 Å ברזולוציה 22 ( איור 3 ג ). מודל זה שימש לראשונה כטבלה ראשונית צלחת עבור חידוד 3D (MERIDIEN), מניב 3.5 Å (0.143 קריטריון) שחזור ( פרוטוקול שלב 7 ) מ ~ רק 40,000 יחידות אסימטריות ( איור 4 ). זה כמעט אטומי מפת הפתרון התקבלה בתוך 24 שעות, באמצעות עד 96 CPUs עבור השלבים של זרימת עבודה כי נהנים ליבות מרובות.

עבור ניתוח השתנות 3D (שלב 8 פרוטוקול), רק 2,000 תמונות חלקיקים לכל קבוצה שימשו בשלב 8.3.3 ( כלומר התהליך מתחיל עם 5 קבוצות 3D הראשונית) ו 200 תמונות עבור גודל הקבוצה הקטן ביותר בשלב 8.3.4 עקב את מספר קטן של חלקיקים (~ 10,000). הניתוח חשף גמישות מקומית בעיקר באזור N- מסוף של המתחם המכיל את התג שלו המשמש לטיהור ( איור 5 א ). ואכן, שנים עשר N- מסוף שאריות ואת התג שלו לא נפתרו במבנה גביש שפורסם בעבר של TcdA1"22> ו אזור זה כנראה לא היה פתור עדיין לא פתור את הצפיפות הנוכחית cryo-EM, ככל הנראה בשל הגמישות שלה.שונות נוספת זוהה על תחומים קולטן מחייב את תחום BC- מחייב ( איור 5 א ). פתרון הולם של המבנה וגודל קטן למדי של מערך הנתונים, הוחלט על הטרוגניות זו להיות נסבלת ולפיכך לא בוצע סיווג תלת-ממדי ממוקד 23. לבסוף, החישוב המקומי של מפת הצפיפות הסופית חושב ( פרוטוקול שלב 9.1, איור 5b ) ואת מפת 3D חידד היה מסונן באופן מקומי ( שלב שלב 9.2) . נפח של איכות זו ניתן להשתמש לבניית מודל novo באמצעות Coot 24 או כל כלי חידוד אחרים ( איור 6 ).

figure-results-3306
איור 1: עיבוד תמונה באמצעות SPHIRE. ( א ) GUI של חבילת התוכנה SPHIRE. שלב ספציפי של זרימת העבודה יכול להיות מופעל על ידי בחירת pictogram בהתאמה בצד שמאל של GUI ("שלב זרימת העבודה"). הפקודות והשירותים הקשורים לשלב זה של זרימת העבודה יופיעו באזור המרכזי של הממשק הגרפי. לאחר בחירת אחת הפקודות, הפרמטרים המתאימים מוצגים באזור הימני של הממשק הגרפי. פרמטרים מתקדמים בדרך כלל אינם דורשים שינוי של ערכי ברירת המחדל שהוגדרו מראש. ( ב ) שלבי זרימת עבודה של עיבוד תמונה אחת החלקיקים באמצעות GUI SPHIRE. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4161
איור 2: Motion תיקון וחלקLe חילוץ. ( A , ב ) אופייני באיכות גבוהה, נמוך במינון, להיסחף תיקון מיקרוסקופ דיגיטלי מוקלט ב defocus של 1.7 מיקרומטר. הערה הטבעות איזוטרופי Thon הארכת ברזולוציה של 2.7 Å בספקטרום כוח (א) ואת חלקיקי להבחין היטב בתמונה 2D ( ב ). ( ג ) בחירת החלקיקים באמצעות e2boxer. עיגולים ירוקים מצביעים על חלקיקים נבחרים. ( ד ) חלקיקים גולמיים אופייניים המופקים מן המיקרוגרף המשוקלל במינון. סולם ברים = 20 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5007
איור 3: אשכולות דו-ממדיים ודגמים ראשוניים. ( א ) גלריה של ממוצעים מעמדיים דו-מימדיים, כאשר הרוב מייצג צדדים צדדיים F החלקיק. סולם בר = 20 ננומטר. ( ב ) AB תחילת 3D המפה של TcdA1 שהושג באמצעות RVIPER ממוצעים בכיתה ללא התייחסות. ( ג ) התאמת גוף קשיח של מבנה גבישי TCDA1 (סרטים) (pdb-id 1VW1) לצפיפות הקריאו-EM הראשונית (אפור שקוף). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5739
איור 4: Cryo-EM 3D מבנה TcdA1. ( א , ב ) סופי 3.5 Å צפיפות המפה של TcdA1 מחושב באמצעות ~ 9,500 תמונות החלקיקים: ( א ) צד ו ( ב ) תצוגה העליון. ( ג ) אזורים מייצגים של צפיפות cryo-EM עבור סליל α ו- β גיליון.Arge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-6296
איור 5: ניתוח משתנות ורזולוציה מקומית. ( א ) פני השטח של מפת ה- cryo-EM המחודדת של TcdA1 (אפור) ומפת השתנות (ירוק). לקבלת הבהירות טוב יותר, את המפה השתנות היה נמוך לעבור מסונן עד 30 Å. ( ב ) טיוח פני השטח של TCPA1 חידד cryo-EM מפת צבעוני על פי ההחלטה המקומית (Å). שים לב להסכם הטופולוגי בין אזורים בעלי שונות גבוהה ורזולוציה מקומית נמוכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7005
איור 6: מודול תלת ממדיאל TCDA1 באמצעות Cot. אזורים נציג של cryo-EM צפיפות המודל האטומי מוצגים עבור סליל α. המודל האטומי נבנה בנובו באמצעות Cot. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

חלקיק יחיד cryo-EM הראו התפתחות מהירה בשנים האחרונות ומסירת מבנים ברזולוציה אטומית רבים של קומפלקסים macromolecular של משמעות ביולוגית גדולה 25 . כדי לתמוך במספר גדול של משתמשים מתחילים, כי כרגע הם נכנסים לשדה, פיתחנו את החלקיקים תמונה אחת ניתוח פלטפורמת SPHIRE ולהציג כאן פרוטוקול דרך לאורך כל העבודה כולל יישור הסרט, בחירת החלקיקים, הערכה CTF, המודל הראשוני חישוב, 2D ו 3D ניתוח הטרוגניות, ברזולוציה גבוהה 3D חידוד ואומדן ברזולוציה המקומית וסינון.

הפרוטוקול המתואר כאן נועד כמדריך קצר לקביעת מבנה 3D באמצעות microoraphs cryo-EM של החלבון של עניין ועם עזרה של כלי חישוב הניתנים על ידי GUI עצמאית של SPHIRE.

התכונה העיקרית של זרימת העבודה היא כי ביותרשל נהלים צריך להיות מופעל רק פעם אחת, שכן הם מסתמכים על הרעיון של אימות על ידי reproducibility 19 ו אינם דורשים פרמטר tweaking. מנגנון אימות אוטומטי זה הוא היתרון העיקרי של SPHIRE על גבי חבילות תוכנה אחרות מאז התוצאות נוטות להיות אובייקטיביות כמו גם לשחזור, והכי חשוב, להשגה במחיר חישוב מקובל. צינור מספק בנוסף שפע של מידע אבחון עבור משתמשים מנוסים לבצע אימות עצמאית נוספת עם שיטות משלו. עם זאת, משתמש טירון שיש לו לפחות רקע תיאורטי בסיסי ביולוגיה מבנית ומיקרוסקופ אלקטרונים אמור להיות מסוגל לקבל מבנים ברזולוציה אטומית כמעט באמצעות נתונים משלו ואת הליכי אימות אוטומטיים.

עם זאת, קבלת מבנה ברזולוציה אטומית כמעט לא תמיד פשוטה והתוצאה תהיה תלויה מאוד באיכות המדגם ואת קלט datא. עבור הנהלים המוצגים כאן, ההנחה היא כי כמות מספקת של סרטים באיכות גבוהה גלם לא משויך EM זמינים, עם ממוצעים שלהם מראה בבירור חלקיקים הומוגניים יחיד מכוונת אקראית. באופן כללי, אין מגבלות לגבי הסימטריה, הגודל או הצורה הכוללת של המולקולה, אך משקל מולקולרי נמוך יכול להיות גורם מגביל, במיוחד כאשר לחלבון יש צורה גלובלית חסרת תכונות. בדרך כלל, ניתוח של חלקיקים גדולים, מסודרים היטב עם סימטריה קבוצתית גבוהה הוא פחות תובעני. לכן, זה מאוד ממליץ למשתמשים מתחילים להפעיל את הפרוטוקול הנוכחי הראשון עם מאופיין היטב cryo-EM dataset. או את הנתונים SPHIRE הדרכה (http: /sphire.mpg.de) או אחד הנתונים EMPIAR שהוגשו (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) עם סרטים גולמיים הם נקודת התחלה טובה .

כאשר עיבוד הנתונים עצמו, סביר מאוד כי כמה מערכי נתונים או חלק מהתמונות לא יספק quali מסוימיםקריטריונים. בהקשר זה, בנוסף בדיקות אוטומטיות יציבות לשחזור, המבוצעת על ידי התוכנית בשלבים העיקריים של זרימת העבודה, הוא עדיין ממליץ למשתמשים לבחון ויזואלית את התוצאות "מחסומים" מסוימים של הפרוטוקול, במיוחד אם השחזור הסופי אינו מספק.

הבדיקה החזותית הראשונה יכולה להתבצע ברמת המיקרוגרף לאחר יישור הסרט ( שלב 2 בפרוטוקול) והערכת ה- CTF ( שלב 3 של הפרוטוקול). ממוצעים המתקבלים בתנועה, צריכים להראות בבירור חלקיקים בודדים המופרדים היטב, וספקטרום הכוח שלהם צריך להראות בבירור את הטבעות האיזוטרופיות. התדר המרחבי אליו הם נראים מגדיר, ברוב המקרים, את הרזולוציה הגבוהה ביותר שעליה ניתן לקבוע את המבנה באופן עקרוני בסופו של דבר. דוגמאות לממוצע מתוקן בתנועה של איכות מספקת וספקטרום הכוח שלה מוצגים בסעיף & #34. תוצאות נציג ".תמונות חריגות יותר אשר עשויה להיות השפעה שלילית על התוצאה הסופית ניתן להסיר בעזרת ספייר של להיסחף ו- CTF הערכה GUI כלים (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).

לגבי ההקרנה החלקיקים, השלב המכריע בצינור SPHIRE הוא סיווג 2D באמצעות ISAC ( שלב 5.2 פרוטוקול) . כאן, המשתמש צריך לשלוט כי ממוצעים בכיתה 2 לשחזור מזוהות באופן אוטומטי על ידי התוכנית לאמץ מגוון של אוריינטציות מספיק כדי באופן שווה באופן שווה לכסות את המרחב הזוויתי. אם איכות ממוצעי הכיתה אינה משביעת רצון (תמונות רועשות ו / או מטושטשות) ו / או מספר ממוצעים בכיתה לשחזור הוא נמוך מאוד, שקול לשפר את איכות לקטוף אוטומטי, אופטימיזציה הדמיה dataset או הכנת המדגם. ברוב המקרים, לא ניתן לחשב שחזור אמין ממערכת נתונים שאינה מניבה ממוצעים מעמדיים דו-ממדיים טובים. דוגמאות של איכות גבוהה בכיתה 2 aveזעזועים מוצגים בסעיף "תוצאות נציג".

לפחות 100 ממוצעים מחלקה נדרשים כדי לקבל מודל תלת-ממד אמין ראשוני באמצעות RVIPER באופן אוטומטי ( שלב שלב 6.1 ). בשלב זה, המשתמש צריך לבחור את הממוצעים עם האיכות הגבוהה ביותר וכוללים כמו אוריינטציות שונות של החלקיקים ככל האפשר. איכות המודל הראשוני הוא קריטי להצלחתו של חידוד 3D ברזולוציה גבוהה.

בחבילות תוכנה אחרות, סיווג 3D מבוצע לעתים כדי להסיר "רע" חלקיקים 8 , 9 . עם זאת, ב SPHIRE רוב החלקיקים האלה בוטלו באופן אוטומטי כבר במהלך סיווג 2D באמצעות ISAC. לכן, מומלץ לבצע את שלב אינטנסיבית חישובית של מיון 3D רק אם השחזור ואת ניתוח השתנות 3D מצביעים על הטרוגניות של הנתונים.

והכי חשוב, המשתמש צריך תמיד לבדוק בקפידה את הכרכים 3D שהתקבלו בזהירות ( שלב שלב 9.3 ), ולאשר כי התכונות של צפיפות בהתאמה מסכימים היטב עם ההחלטה הנומינלית. ברזולוציה של <9 Å, צפיפות דמוית מוט המקביל ל α-סלסלות להיות גלוי. ברזולוציה <4.5 Å, צפיפות המקביל לגדילים ב β- גיליונות מופרדים בדרך כלל היטב חומצות אמינו מגושם להיות גלוי. מפה ברזולוציה גבוהה (<3 Å) צריכה להראות שרשראות צד ברורות, ובכך לאפשר בניית מודל אטומי מדויק.

תוצאות שהתקבלו עד כה להוכיח כי, בעזרת מבחני שחזור אוטומטי של SPHIRE בדיקות ויזואליות מינימלי, הפרוטוקול הנוכחי הוא ישים בדרך כלל לכל סוג של פרוייקט יחיד cryo-EM חלקיק. תוצאות נציג של כל שלב עיבוד מוצגים עבור שחזור של רעלן TCDA1 שלPhotorhabdus luminescens 21 , אשר נפתרה ברזולוציה אטומית כמעט. מפות צפיפות של איכות דומה ניתן להשתמש כדי לבנות מודלים אטומיים אמין על ידי השד נובו דה novo כמו גם עידון הדדי או שטח אמיתי, ובכך לספק מסגרת מבנית מוצק להבנת מנגנונים מולקולריים מורכבים.

קודי גישה:

הקואורדינטות עבור המבנה EM ואת הסרטים unprocessed הופקדו אלקטרונים מיקרוסקופית נתונים הבנק ואת מיקרוסקופית אלקטרונים פיילוט תמונה ארכיון תחת מספרי ההצטרפות EMD-3645 ו EMPIAR-10089, בהתאמה.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים ד רודרר על מתן לנו microdraphs TcdA1. אנו מודים לסטיב לודקה על תמיכתו המתמשכת בתשתית EMAN2. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות של החברה מקס פלנק (ל SR) לבין המועצה האירופית במסגרת תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7 / 2007-2013) (מענק מס '615984) (ל SR) ומענק של המכונים הלאומיים של בריאות R01 GM60635 ל PAP).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SPHIREMax Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund  and Houston Medical School, Houston, Texas http://sphire.mpg.de
UCSF ChimeraUniversity of California, San Franciscohttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
UnblurJanelia Farm Research Campus, Ashburnhttp://grigoriefflab.janelia.org/unblur
CootMRC Laboratory of Molecular Biology,  Cambridgehttp://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2Baylor College of Medicine, Houstonhttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Computing Cluster with 1824 coresMax Planck Institute of Molecular PhysiologyLinux Cluster with 76  nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM
TITAN KRIOS electron microscope FEI300 kV, Cs correction, XFEG
Falcon II direct electron detectorFEI
EPU (automated data acquisition software)FEIhttps://www.fei.com/software/epu/

References

  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -. C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. . Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123cryo EMTEMTc

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved