רב שכבתיים Ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

Summary

כאן, אנו מציגים הליך לביצוע בקנה מידה גדול Ca ^{2 +} הדמיה עם רזולוציה הסלולר על פני שכבות קליפת המוח מרובים בעכברים נעים באופן חופשי. מאות תאים פעילים ניתן לצפות בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי, ראש רכוב יחד עם בדיקה מנסר פריזמה.

Abstract

במעגל vivo ו הדמיה תפקודית ברמה התאית הוא כלי קריטי להבנת המוח בפעולה. הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים קליפת המוח העכבר עם מיקרוסקופ שני פוטון סיפקה תובנות ייחודיות לתוך מבנה קליפת המוח, פונקציונליות. עם זאת, מחקרים אלה מוגבלים לבעלי חיים קבועים ראש, לצמצם במידה ניכרת את המורכבות ההתנהגותית הזמינה למחקר. במאמר זה, אנו מתארים הליך לביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי כרונית עם רזולוציה הסלולר על פני שכבות קליפת המוח מרובים בעכברים מתנהג בחופשיות. השתמשנו מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי משולב יחד עם בדיקה מנסר המושרשת בו זמנית לדמיין ולהקליט את הדינמיקה סידן של מאות נוירונים על פני שכבות מרובות של קליפת המוח סומאטוסנסורי כמו העכבר עוסקת במשימה חיפוש חדש אובייקט, על פני כמה ימים. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לאזורים אחרים במוח במינים שונים של בעלי חיים אחרים p התנהגותיארדיגמות.

Introduction

הקורטקס הוא שחקן חיוני בתפקודים נפשיים והתנהגותיים מורכבים רבים, מתוך תשומת לב, תפיסה חושית ושליטה קוגניטיבית מלמעלה למטה ^{1 , 2 , 3} למסלולי מוטיבציה, גמול והתמכרות ^{4 , 5} . הבנת התהליכים החישוביים המונחים ביסוד תפקידה היא מטרה חשובה להניע הבנה קלינית טובה יותר של הפרעות נפשיות והתנהגותיות רבות.

תיאוריות עכשוויות רבות של מרכז המחלות הפסיכיאטריות סביב הרעיון כי תפקוד לקוי של מעגלים עצביים בקליפת המוח או דיסקואורדינציה עשוי להתבסס על הפרעות קוגניטיביות והתנהגותיות שהן סימני ההיכר של התנאים כגון סכיזופרניה ⁶ , אוטיזם ⁷ או הפרעה אובססיבית-קומפולסיבית ⁸ . לפיכך, קבלת האוכלוסייה ברמת האוכלוסייה נתונים עצביים ממעגלים אנכיים בהקשר הנכון של מידע התנהגותי סימולטני הוא בעל חשיבות רבה, אידיאלי יכול להיות ממוקד סוגי תאים ספציפיים עבור דיסקציה מעגל עדין יותר.

מיקרוסקופים מיניאטוריים בשילוב עם מיקרוסקופים מבודדים של שיפוע הדרגתי (GRIN) מאפשרים גישה אופטית להרכבים עצביים בתנאי תנועה חופשית ממגוון אזורי מוח אפשריים ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} , כולל הקליפה ^{14 , 15 , 16} . באמצעות מערכת מיקרוסקופית נייד יחד עם מחוונים סידן מקודד גנטית מאפשר הדמיה עקבית של האוכלוסייה הסלולרית זהה המקיף מאות נוירונים על ימים עד שבועות באזורי מוח רבים ⁹ , והוא יכול להיותממוקד גנטית סוגי תאים ספציפיים באמצעות וקטור ויראלי או טכניקות מהונדס.

כמו קליפת ידוע לתמוך פונקציות שונות להתחבר אזורים שונים במוח בהתאם למיקום של התאים בתוך lamina ^{17 , 18 , 19} , אנו מעוניינים לקבל פעילות רב עצבית רב שכבתיים בעת ובעונה אחת נושאים מתנהג ער. כאן אנו מדגימים כיצד לדמות מאות נוירונים שכותרתו fluorescently בעכברים מתנהג בחופשיות על פני ימים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי ²⁰ בשילוב עם בדיקה מנסר המנסר, אשר מציעה תצוגה רב שכבתיים של קליפת המוח ( איור 1 ).

הבדיקה פריזמה משמש כאן מורכב משני עדשות GRIN נפרד: פריזמה עדשת גליל ממסר ( איור 1 ). האור מהמיקרוסקופ מעורר את התווית הנקראת פלואורסצנטליתתאים הממוקמים לאורך הפנים הדמיה של בדיקה פריזמה, לאחר משתקף מחוץ hypotenuse של החלק פריזמה של בדיקה. האור הנפלט מן התאים משקף גם את hypotenuse של הפריזמה, נאסף באמצעות המטרה של המיקרוסקופ ומגיע חיישן במיקרוסקופ. בדיקת פריזמה בשימוש בהליך זה מותאם לשימוש קל עם ציוד stereotaxic סטנדרטי.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי ²⁰ מזהה פעולה הפוטנציאל עורר Ca ^{2 +} חולפים באוכלוסיות עצביים עם רזולוציה תא יחיד, לאחר תאים אלה כבר שכותרתו במיוחד עם Ca ^{2 +} רגיש מחוונים ניאון מקודד גנטית. בפרוטוקול זה, אנו מזריקים Ca ^{2 +} אינדיקטור מקודדים בקטור ויראלי (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), להשתיל בדיקה פריזמה, להתקין את המיקרוסקופ, ולאחר מכן להשיג מספר ימים של נתונים סומטוסנסוריים (S1 אחוריים אחוריים) נתונים עצביים מתוך חשיפה חיהד למשטחים אובייקט הרומן במהלך חקירה חופשית ( איור 2 ).

Protocol

נהלים הקשורים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) ב LifeSource שירותים ביו, מרכז מחקר איימס נאס"א, קליפורניה.

1. הכנה לפני הניתוח

1. לעקר את הכלים כדי לשמש בהליכים כירורגית מעקר חרוז חם ולנגב את אזור הניתוח עם אתנול 70%. הפעל את כרית חימום הניח מעל הבמה stereotaxic ולשמור אותו על 37 מעלות צלזיוס.
2. להרדים את החיה באמצעות isoflurane (5% עבור אינדוקציה, ו 1-2% עבור תחזוקה, 0.6-0.8 L / min O ₂ ). בדוק את היעדר רפלקס הבוהן קמצוץ כדי להעריך את עומק ההרדמה.
3. הר החיה במסגרת stereotaxic מצויד באוזניים ובברים השיניים.
4. החלת משחה עיניים על העיניים של החיה לכסות אותם עם פיסת נייר כהה כדי להגן עליהם מפני ייבוש אורות כירורגי אינטנסיבי.
5. תת עורית להזריק את החיה עם ketoprofen (2.5מ"ג / ק"ג) או carprofen (2.5 מ"ג / ק"ג)

2. וירוס הזרקת ניתוח

1. לקצץ לגלח את הקרקפת בין העיניים והאוזניים לחטא את העור עם 3 חלבונים חלופיים של אתנול 70% ו betadine.
2. לחשוף את הגולגולת על ידי ביצוע חתך בקרקפת, החל בין העיניים והארכת rostrocaudal 1.5 ס"מ עם להב כירורגי סטרילי. פתח את העור כדי לחשוף את הגולגולת, ולהסיר את periosteum סביב האתר הזרקת הרצוי באמצעות צמר גפן ואת מזמל. שוטפים את הגולגולת עם סטרילי PBS. לנקות וללטש את הגולגולת עם צמר גפן.
3. רמה את הגולגולת, עם סמן, לסמן את הקואורדינטות stereotaxic להזרקת הנגיף. באמצעות בר 0.5 מ"מ על מהירות גבוהה microdrill (מוגדר בסביבות 7,000-10,000 סל"ד), ליצור חור קטן בגולגולת. החלת לחץ קל בזמן הקידוח ולסירוגין לנקות את האבק העצם להרטיב את האזור עם PBS סטרילית כדי למנוע רקמת המוח מפני התחממות יתר, עד משטח המוח מחדשכאב. שמור את המוח לח במקום שבו הוא קדח חור.
4. השתמש 26 מחט G להרים וירוס ( למשל AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) ב microsyringe, ולאחר מכן להחליף אותו עם מחט 35 G עבור הזרקת. צרף את microsyringe טעון עם וירוס לזרוע מניפולטור של המנגנון stereotaxic.
5. תביא את המזרק קרוב חור ההזרקה באתר ולהתאים את הזווית של המחט כך שזה נכנס בזווית של 90 ° על פני המוח. להנמיך את המחט עד שהוא נוגע pia mater ו חודרים מבעד לדורה. להתחיל להנמיך את המחט במרווחים של 10 מיקרומטר / s עד שהוא מגיע לעומק הרצוי (z). תקן את מיקום המחט שם באמצעות הזרוע stereotaxic.
6. הגדר את המשאבה microsyringe להזריק 250 nL של וירוס ב 25 nL / min.
   1. שלב קריטי: מאז נפח הנגיף להיות מוזרק תלוי titer ו דילול, להפעיל ניסויים דילול מראש, כדי לקבוע נפח אופטימלי וריכוז הקריטריונים של תאים הדמיהבניסוי.
7. אם וירוס כלשהו נראה exuding מחוץ לאתר ההזרקה, להשהות את ההזרקה ולחכות עד רקמת המוח סופג את הירידה וירוס. המתן 5-7 דקות לאחר הנפח הכולל הוזרק לפני retracting את המחט. צבעים כמו ירוק מהיר יכול גם להוסיף את הפתרון הנגיף כדי לסייע בשליטה על קצב הזריקה במקרה הנגיף נראה exuding מתוך פני המוח.
8. לתיוג שכבות מרובות בקליפת המוח, השתמש בהזרקות מרובות במידת הצורך. התחל באתר הגחון הראשון ביותר, מחכה 5-7 דקות לאחר ההזרקה, ומושך את המחט לנקודה הבאה הגב ביותר להזרקת ( למשל להזריק ב -1.0 מ"מ AP, 1.5 מ"מ ± ML ו 400 ו 600 מיקרומטר DV). המתן 10 דקות לאחר הזריקה הסופית לפני משיכת המחט והסרתו מן setup stereotaxic.
9. מערבבים כמות קטנה של ויוו biocompatable שקוף דבק אלסטומר מזרק קפל כפול (למשל קוויק-סיל) ומכסים את החור בגולגולת. החל דבק cyanoacrylate על גבי שכבת דבק אלסטומר ולתת לו לרפא.
10. תפר את הקרקפת ולאפשר החיה להתאושש מהרדמה בכלוב התאוששות חם עד שהוא אמבולטורי. ניהול ketoprofen (2.5 מ"ג / ק"ג) או carprofen (2.5 מ"ג / ק"ג) תת עורית לפני החזרת החיה לכלוב הבית שלה. בית בודד שלאחר ניתוח נושאים כדי להגן על אתר הניתוח לחזור על המינון 24 שעות מאוחר יותר.
11. לאחר הסרת microsyringe, לשטוף את שניהם 26 G ו 35 G מחטים 7-10 פעמים עם מים מזוקקים לנקות לפני האחסון.

3. פריזמה בדיקה שתל ניתוח

1. 1-2 שבועות לאחר הזרקת וירוסים, להתכונן ניתוח פריזמה ניתוח השתל. לחטא את פריזמה בדיקה באתנול 70% ולנקות אותו עם נייר העדשה. הכנס את מנסרה פריזמה בכלי מחזיק העדשה ואת הידוק בורג hex עם מברג. מושב את המיקרוסקופ בבסיס הבסיס (מגנטים יחזיקו אותו במקום).
2. הכינו את החיה כפי שתוארו תחת הכנה לפני הניתוח בסעיף.
3. חתוך לגלח את הראש של החיה בין העיניים והאוזניים לחטא את העור עם חלופות חלופיות של אתנול 70% ו betadine.
4. לחשוף את הגולגולת על ידי החתך את העור עם זוג מספריים סטריליים להסיר את דש העור ואת periosteum הבסיסית. יבש וליטש את הגולגולת עם צמר גפן. ודא הסרת נאותה של רקמת שריר שמסביב כדי ליצור בסיס נקי, יבש, רחב העצם לקראת השלבים הבאים.
5. השתלת ברגים הגולגולת בחצי הכדור הנגדי כדי להפוך את השתל יציב ומאובטח. אלה עשויים להיות גם שימושי אם בוחרים להשתיל את הראש עבור ער לתקן ראש כדי להכין את החיה עבור הפעלות הדמיה ניסיוני בסעיף 5.
6. רמה את הגולגולת עם סמן סמן AP ו- ML קואורדינטות עבור הכניסה העדשה. באמצעות בר 0.5 מ"מ על microdrill לפתוח craniotomy עגול, הבטחת thE craniotomy קוטר הוא רק גדול יותר מאשר קוטר פריזמה כלומר 1.0 מ"מ במקרה זה. מקדחה בעדינות תוך כדי הפסקה לסירוגין כדי לשטוף את הגולגולת עם סטרילי PBS ו suction אותו עם צמר גפן. הסר את אבק העצם שנוצר.
   1. שלב קריטי: מניחים את craniotomy כך שכאשר המנסרה מוכנס בקליפת המוח, הקצה השטוח שלו (משטח הדמיה) פונה לאתר הזרקת הווירוס והוא נמצא ברדיוס של 150-200 מיקרומטר.
7. עצור קידוח ממש לפני הגולגולת הוא דליל לחלוטין. כלי הדם צריכים להיות גלויים דרך העצם הדלילה. הסר את תקע העצם בעדינות עם מלקחיים בסדר 45 מעלות.
8. הסר את הדורה עם # 5 מלקחיים.
   1. שלב קריטי: לאחר רקמת המוח חשוף, תמיד לשמור על רקמות לחות. מניחים צמר גפן טבול מלוחים סטרילית על craniotomy. זה יהיה גם לשמור על הלחץ על הרקמה.
9. כדי להקל על הלחץ של רקמות המוחטבעת הכניסה של בדיקה פריזמה, ליצור דרכי הכניסה מראש. צרף סכין לנתיחה ישר קצוות הזרוע מחזיק אלקטרודה של המנגנון stereotaxic ולהעלות אותו על המנגנון stereotaxic בזווית כך להב סכין הוא מאונך העקמומיות של הגולגולת (10 ° זווית במקרה זה) וב מטוס במקביל לזרקת הזרקת הווירוס.
10. בזהירות מיקום הסכין מעל craniotomy לאורך הקצה המדיאלי הקדמי שלה במקרה זה ~ 200 מיקרומטר לרוחב לאתר הזרקת הנגיף עם חוד החנית מול אחורי ( איור 1 ). אפס את ציר ה- Z כאשר קצה סכין נוגע פיא ולהוריד אותו בהדרגה (ב 10 מיקרומטר / s במרווחים) לעומק שבו בדיקה פריזמה יוכנס. ואז להזיז את הסכין 1 מ"מ האחורי כדי ליצור נתיב עבור הקצה המוביל של הפריזמה. השהה ולשלוט על כל דימום שעלול לקרות בעת ביצוע החתך עם מלוח טרום סטרילית ספוג חתיכת gelfoam.
11. ברגע הסכין נמצא במצב זה, לשטוף את האתר עם מלח סטרילית לחכות עד דימום שוכך. ואז לאט לשלוף את הסכין באמצעות micromanipulator הזרוע stereotaxic ב 10 מיקרומטר / s במרווחים, ומניחים חתיכת ספוג gelfoam ספוג מלוחים סטרילית על החתך.
12. צרף את מחזיק העדשה (עם בדיקה פריזמה מיקרוסקופ) הזרוע מניפולטור stereotaxic באותה זווית כמו הסכין בשלב הקודם. יישר את הפריזמה כך הצד השטוח של פריזמה הוא מעל החתך במקביל טור הזרקת הנגיף. צעד זה עשוי לדרוש קצת תיקון בסדר של עמדת הזרוע stereotaxic. התאם את היישור על ידי להישאר קרוב לגולגולת לקבלת תוצאות מהירות יותר.
13. לאחר הפריזמה היא בזווית הנכונה, בהדרגה להוריד אותו במוח ב 10 מיקרומטר במרווחים ל z סופי של 1.1 מ"מ עבור בדיקה זו, החל משטח המוח. רקמת המוח תתרחב סביב הפריזמה וכל הלחץ שנוצר הוא מאחורי visualizatiעל המטוס ולא ישפיע על שדה הראייה. חבר את המיקרוסקופ למחשב עם תוכנת הרכישה מותקן באמצעות יציאת USB3 ו לדמיין שדה הקרינה על ידי הפעלת LED.
14. כיסוי כל רקמה חשוף סביב הפריזמה ב craniotomy בשכבת מגן דקה מאוד של דבק אלסטומר באמצעות מחט 25G.
15. לאחר הדבק אלסטומר הוא נרפא (בדרך כלל ב 3-5 דקות ~) להשתמש במחט 25G כדי להחיל דבק cyanoacrylate כדי לצרף את הזכוכית של העדשה פריזמה אל הגולגולת הסמוכה על שכבת דבק אלסטומר, כדי למנוע את העדשה מבפנים את craniotomy. כלול את הקצוות של השרוול בדיקה פריזמה להדבקה טובה יותר. אין לקבל כל דבק על הפנים העליון של המנסרה פריזמה מושתל. לאחר דבק cyanoacrylate הוא נרפא לפרק את מחזיק העדשה להסיר בזהירות את המיקרוסקופ. ואז לאט לאט לחזור על הזרוע מניפולטור stereotaxic לעזוב את פריזמה בדיקה מושתל היטב.
16. החל שכבה של אקריליק שיניים אודבק cyanoacrylate סביב השתל כדי לכסות את כל פני השטח גולגולת חשוף, עד אך לא נוגעים הרקמה שריר retracted סביב. כיסוי שטח גדול של גולגולת עם מכסה גולגולתי זה יהיה מאוחר יותר לסייע מצורף baseplate. העור סביב האתר השתל צריך לרפא לבד סביב מכסה הגולגולת.
    1. שלב קריטי: אל תתנו מגע דבק כל העור או רקמת השריר שמסביב, ולא לעטוף כל עור בכובע גולגולתי. פעולה זו תגרום לגירוי של העור, ועלול לגרום לגרד יתר ולנזק אפשרי לשתל.
17. אופציונלי: אם ברצונכם להשתמש בהתקנת ער ראש קבועה כדי לצרף ולנתק את המיקרוסקופ לבסיס הבסיס של בעל חיים בהדמיית הדמיה ניסיונית, במקום להרדים או לקצר את החיה, השתילו את ראש הכובע הגולגולת התואם את הראש, התקנה קבועה של בחירה (לא הוכח בפרוטוקול זה).
18. מערבבים את הזרז ואת הבסיס של סיליקוןE מזרק דבק והניח טיפה של אלסטומר בתוך השרוול בדיקה פריזמה לכסות את העדשה בדיקה העליון כדי למנוע כל נזק ואבק מ להתיישב.
19. הסר את החיה מן המסגרת stereotaxic ולאפשר התאוששות מן ההרדמה בחדר חם. ניהול ketoprofen (2.5 מ"ג / ק"ג) או carprofen (2.5 מ"ג / ק"ג) תת עורית, ולהחזיר את החיה לכלוב הבית נקי פעם זה אמבולטורי. בית בודד כל הנושאים כדי להגן על השתל ולחזור על המינון 24 שעות מאוחר יותר.

4. מצורף Baseplate עבור מיקרוסקופ מיניאטופ התקנה

1. שבוע עד 10 ימים לאחר השתלת בדיקה פריזמה, לבדוק את הביטוי וירוס ברקמה באמצעות בדיקה המנסר המושתל, וכן לצרף baseplate על הגולגולת אם ההכנה מראה פעילות התא. המיקרוסקופ יהיה עגן על baseplate במהלך הדמיה חיה.
2. בצע את השלבים המתוארים בהליך טרום אופרטיבי להכנת החיה עבור המצורף baseplate.
3. הסר את הכובע דבק סיליקון על פני השטח של העדשה מנסר בדיקה מנסרה למעלה. בחן את משטח בדיקה העדשה, לנקות את כל פסולת בעדינות עם נייר העדשה ואתנול 70% כדי להבטיח את השטח הדמיה נקי.
4. חבר את המיקרוסקופ לתיבת DAQ וחבר אותו דרך יציאת USB3 למחשב.
5. פתח את תוכנת הרכישה במחשב לחבר את המיקרוסקופ דרך יציאת USB3. השתמש בתוכנת הרכישה לבדיקת פעילות עצבית, ולמדוד ולתעד את שדה הגדרות התצוגה עבור הקלטות עתידיות בנושא זה.
6. צרף baseplate למיקרוסקופ ולהדק את הבורג להגדיר baseplate להחזיק את baseplate במצב, ולאבטח את המיקרוסקופ לתוך תפסן מיקרוסקופ על הזרוע micromanipulator stereotaxic על ידי הגוף של המיקרוסקופ. צרף את gripper למוט ניופורט, אשר יכול להיות מותקן על הזרוע micromanipulator stereotaxic.
7. מקמו את המיקרוסקופ מעל העדשה פריזמה בדיקה באמצעות sהזרוע micromanipuator tereotaxic. בחן את האוריינטציה על-ידי צפייה בעדשת הפריזמה מהצד ובגב הבמה. הצירים האופטיים של שניהם המטרה מיקרוסקופ העדשה מנסרה בדיקה חייב להיות מיושר.
8. הפעל את מיקרוסקופ LED דרך התוכנה. להעריך את האיכות של היישור מיקרוסקופ על ידי התמקדות הפנים העליון של העדשה מנסרה בדיקה מנסר בתוכנה הרכישה. כאשר מיושר כראוי, את הקצוות של העדשה פריזמה העדשה העליונה צריך להיות חד.
9. התאם את המרחק הפיזי של המיקרוסקופ מעל בדיקה פריזמה מושתל באמצעות הזרוע מניפולטור stereotaxic להשיג את המטוס המוקד הרצוי בתוך הרקמה. המרחק אופטי אופטימלי בין המטרה מיקרוסקופ עדשת GrIN מושתל ~ 500 מיקרומטר.
10. שמור תמונה הקרינה התייחסות פעם המטוס הדמיה הרצוי נתפס.
    נקודה קריטית: מנקודה זו ואילך, אין לשנות את המיקום של המיקרוסקופ, כמו זה ישתנה locatiעל המטוס הדמיה ברקמה.
    הערה: החלת דבק בשלב הבא כדי לתקן באופן קבוע את המיקום של baseplate ביחס מכסה גולגולתי. דבק עשוי לחוות כמה התכווצות נפח ביום או יומיים הבאים, אשר יכול לשנות את המטוס המוקד ברקמה. Preemptively להסביר את זה על ידי מדידת כמות הצטמקות עבור תערובת דבק שלך ואת vivo המרחק לשעבר , ואז גיבוי עמדת Z הסופי של מיקרוסקופ + baseplate על ידי סכום זה לפני התקדמות לשלב יישום דבק.
11. השתמש אקריליק שיניים או cyanoacrylate לצרף לצמיתות את baseplate לכובע אקרילי מכסה הגולגולת של החיה, גישור על הפער עם אקריליק או דבק. החלת אקריליק שיניים / cyanoacrylate בהדרגה ריפוי בשלבים מרובים עשוי למזער את ההשפעה של הצטמקות שהוזכרו לעיל על המיקום הסופי של המטוס התמונה של מיקרוסקופ.
    1. שלב קריטי: יש לדאוג בעת החלת שינייםאקרילי / cyanoacrylate כדי למנוע כל חומר מן המגע העדשה אובייקטיבי של מיקרוסקופ, בורג להגדיר, או את הגוף מיקרוסקופ, אשר ימנע הפעלה נאותה של המכשור מאוחר יותר.
    2. צעד קריטי: בעת החלת דבק, לא לדחוף על המיקרוסקופ. לחץ על מיקרוסקופ או baseplate יכול לגרום תנועה של המטרה מיקרוסקופ יחסית העדשה פריזמה הבדיקה, אשר עלול לגרום misalignment או שינוי של המטוס המוקד ברקמה הדורשת התאמה מחדש מהירה.
12. ודא כי אקריליק שיניים / cyanoacrylate יש לרפא וקשיח על ידי הקשה על אקריליק עם זוג מלקחיים או קצה מזרק. רכישת התמונה הסופי הקרינה הפניה עם תוכנת הרכישה.
13. שחרר את המיקרוסקופ מ gripper ו retract את gripper מן המיקרוסקופ. אם cyanoacrylate או דבק שקוף אחר שימש, לכסות אותו עם לק ציפורן שחור או שכבה של מלט שיניים שחור כדי למנועMbient דליפת אור לתוך מכסה הראש, אשר יכול לזהם תמונות עתידיות שנרכשו במהלך הניסויים.
14. בשלב זה, להסיר את המיקרוסקופ אם יש צורך. להפרדת המיקרוסקופ מהבסיס, שחררו את בורג הבורגנים על ידי סיבוב בורג המערכת כ - ½ פונה בכיוון השעון. קמצוץ את הגוף מיקרוסקופ תוך תמיכה baseplate וכובע אקרילי ביד השנייה, ולמשוך את המיקרוסקופ ישר למעלה. החלף אותו במיכל האחסון שלו.
15. הגן על המנסרה פריזמה מושתלים עם כיסוי baseplate. זה ימנע כל חלקיקי אבק להתיישב על משטח העדשה, אשר יכול להיות מסובך לנקות לאחר baseplate הותקן.
16. חבר את כיסוי לוח הבסיס על לוח הבסיס והתקדם את בורג הסט בחוזקה של חצי כיוון בכיוון השעון או עד שבורג הבורג מסומק עם כיסוי לוח הבסיס. אל תגזירו.
17. הסר את החיה מן הרדמה לפקח בחדר התאוששות חמה עד אמבולטורי. חזורE animal לכלוב הבית שלה. סינגלי הבית כל בעלי חיים עם baseplates מושתלים כדי להגן על השתל.

5. הדמיה שכבות קליפת המוח מרובים בעכבר נע בחופשיות

1. הכן את מנגנון התנהגותי, ( למשל Phenotyper, Noldus) על ידי ניקוי וחיטוי זה ומנגב עם פתרון אקונומיקה 10%.
2. חבר את המיקרוסקופ לתיבת DAQ שלו, וחבר אותו למחשב ולהפעיל את תוכנת הרכישה.
3. בדוק אם יש מספיק שטח אחסון של קבצים במחשב הרכישה ופשוט מקום לסרטים הדמיה סידן. שמור ישירות מתוך התוכנה לדיסק הקשיח המקומי, במקום לכתוב לכונן קשיח חיצוני, כדי להתאים את קצב העברת הנתונים גבוה בין המיקרוסקופ למחשב ולמנוע אובדן נתונים במהלך הקלטות.
4. להרדים את החיה עם isoflurane (5% חמצן) בחדר אינדוקציה לצרף את המיקרוסקופ. לחלופין, בעדינות scruff החיה או להשתמש ער ראש קבוע ההתקנהעם ראש אם ההרדמה ידועה להפריע הפרדיגמה ההתנהגותית של בחירה.
5. הסר את כיסוי לוח הבסיס על-ידי סיבוב מגירת לוח הבסיס נגד כיוון השעון והרמת כיסוי הבסיס.
6. מושב את המיקרוסקופ ב baseplate על החיה. המיקרוסקופ צריך להצמיד למקומו בעזרת מגנטים על הבסיס. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
   1. שלב קריטי: לא להדק את בורג להגדיר את הבסיס כדי למנוע נזק הדיור מיקרוסקופ.
7. בדוק את המטוס הדמיה ברקמה על ידי רכישת תמונה פלואורסצנטי בתוכנה, ואם יש צורך להתאים את המטוס המוקד ברקמה על ידי שחרור של הצריח בורג מיקרוסקופ להגדיר, סיבוב הצריח מיקרוסקופ כדי להתאים את המיקוד בסדר, ולאחר מכן הידוק מחדש את הצריח בורג להגדיר דיור.
   1. שלב קריטי: לעולם אל תכריח את הצריח להסתובב מבלי לשחרר תחילה את בורג המערכת, ולא להדק את הבורג סט הצריח.
8. אם ביצוע מחקר אורך, לחזור למצב הצריח הפיזי ללכוד את אותו שדה של נוף. בחומרה, לציין את מספר פונה הצריח, או את המיקום הפיזי של הצריח, עבור כל חיה הדמיה עם מיקרוסקופ אותו עבור החזרה מהירה באותו שדה של נוף.
9. שחרר את החיה נושאת את המיקרוסקופ לתוך כלוב הבית שלה או חדר התנהגותי עבור הסתגלות, ולהמתין ללבוש את ההרדמה אם רלוונטי.
   1. שלב קריטי: לאמן את בעלי החיים לשאת את משקלו של המיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופ דמה עבור מספר מפגשים עד מובטחת כי לבישת המיקרוסקופ לא להפריע ההתנהגות הרגילה שלהם, לפני תחילת הפעלות ניסיוני. טיפול שוטף והכשרה לאיפוק ער, ימנעו מתח מופרז לבעלי החיים.
10. בחר את הגדרות הרכישה שישמשו לאיסוף נתונים. זה כולל את שבירהלי שיעור עבור לכידת נתונים ( למשל 20 fps, רווח של 1, ואת כוח LED של 50%). בדוק את היסטוגרמה התמונה בעת בחירת ההגדרות כדי להבטיח טוב SNR.
    הערה: הצמצם המספרי של אוסף הקרינה הוא 0.35 עבור 1 מ"מ פריזמה בדיקה לעומת 0.5 עבור 1 מ"מ ישר בדיקה.
11. הפעל את התוכנה התנהגותית תוכנית זה להפעיל את המיקרוסקופ במחזור הקלטה הדמיה הרצוי ( למשל 4X 5 דקות על 2 דקות OFF). חבר את יציאת TTL בתיבה Noldus IO ליציאת ה- TRIG על תיבת DAQ באמצעות כבל RJ45 ל- BNC.
12. מניחים את החיה בזירה ההתנהגותית אם לא כבר שם, ולהתחיל את הניסוי.
13. לאחר רכישת הנתונים הרצויים, מחדש להרדים את החיה עם isoflurane (5% חמצן) בחדר אינדוקציה, או בעדינות ער - לרסן את החיה.
14. שחרר את הבורג להגדיר בורג ו לנתק את המיקרוסקופ מן baseplate ידי משיכת בעדינות את המיקרוסקופ. החזר את כיסוי לוח הבסיס והדק בעדינות את הבסלהTe בורג להגדיר.
15. להחזיר את החיה לכלוב הביתה עד הפגישה הבאה ההקלטה. השתמש בתמונות הקרינה התייחסות כמדריך עבור הפעלות הדמיה הבאים לחזור לאותו שדה להציג.

6. הערכת בקנה מידה גדול Ca ^{2 +} נתונים הדמיה

1. כדי לחלץ את מיקום התא ו Ca ^{2 +} דינמיקה בתחום התצוגה של נתונים, פלטפורמות שונות ניתוח נתונים ניתן להשתמש. פסיפס, פלטפורמת ניתוח נתונים שתוכננה במיוחד כדי לעבד בקנה מידה גדול Ca ^{2 +} סרטים הדמיה שימש במחקר זה כאן.
2. תיקון פיקסלים פגומים אינטרפולציה כל הפרט ירד במסגרות בסרטים גלם בשלב עיבוד מראש. סל את התמונות בחלל מתוך שדה מלא 1,440 x 1,080 פיקסלים של נוף ל 720 x 540 פיקסלים כדי להקטין את טביעת הרגל הנתונים.
3. כדי לתקן את ההצעה artifacts במוח ביחס חיישן התמונה מיקרוסקופ, לרשום את הסרטים באמצעות תמונה קפדנית ImageJ מבוססאלגוריתם (טורבו).
4. כדי לזהות נוירונים בודדים, להביע מחדש את התמונות כמו שינויים יחסיים הקרינה ΔF / F ₀ = FF ₀ / F ₀ כאשר F ₀ היא התמונה הממוצע המתקבל על ידי ממוצעים של הסרט כולו.
5. זהה את המסננים המרחביים המתאימים לתאים בודדים באמצעות אלגוריתם מיון מבוסס תאים. כאן השתמשנו העיקריים ניתוח רכיב בודדים ²¹ לזהות נוירונים בודדים.
   הערה: אירוע צוין כאשר משרעת שיא של אירוע במעקב היה יותר מ 8 סטיות תקן מן הבסיס של עקבות להגדיר הנתונים שלנו ואת מיקום התא ואת Ca ^{2 +} נתונים דינמיקה יוצאה לניתוח נוסף.

תוצאות

פרוטוקול המתואר כאן מתאר דרך יעילה ויעילה לבצע אורך רב שכבת Ca ^{2 +} הדמיה של מאות נוירונים קליפת המוח בעכברים מתנהג בחופשיות באמצעות בדיקות פריזמה ( איור 1 ). גישות קודמות כלפי רב שכבתיים הדמיה קליפתית יש בעיקר היה מוגבל חיות בראש קבוע ^{22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27} . על מנת לרכוש את רמת הנתונים הזאת בהקשר חופשי, נעשה שימוש בפלטפורמת מיקרוסקופ מיניאטורה לגמישות התנהגותית; אינדיקטור סידן מקודד גנטית (GCaMP6f) שימש למקד אוכלוסיות תאים ספציפיים (CAMKII + תאים בקליפת המוח); ו פריזמה בדיקה נבחרה לספק כרונית, רב שכבת שדה של נוף.

-Together.within-page = "1"> הראינו את זרימת העבודה להכנת החיה לצורך הדמיה. וקטור ויראלי קידוד מחוון סידן מתאים הוזרק לתוך קליפת המוח ( איור 2 , שלב 1), לפני כרוני השתלת בדיקה פריזמה כדי לאפשר גישה אופטית לתאים שכותרתו ( איור 2 , שלב 2). A baseplate המשמש כמעגן מאובטח, זמני למיקוד של המיקרוסקופ במהלך הפגישות הדמיה הותקן אז מעל הראש של החיה ( איור 2 , שלב 3), המאפשר הדמיה של פעילות קליפת המוח על פני שכבות תאים מרובים ב ערני מתנהג ניסיוני ( איור 2 , שלב 4).

כדי להבטיח כי האוכלוסייה הסלולרית הרצוי היה להיות ממוקד, לאחר המוות ממותה בסעיף המוח מעכבר נציג מוצג באיור 3 עם דגימת בדיקה פריזמה שדה הראייה מסומן יחסית המעבדה GCaMP6fEled נוירונים בשכבות 2/3 ו 5 של קליפת המוח סומטו-סנסורי.

במהלך התעוררות הדמיה התנהגות עם המערכת, הפעילות של נוירונים קליפת המוח somatosensory נרשמה כאשר העכבר נחשף לשלוש סביבות שונות - שדה פתוח (יום 1), אובייקט היכרות (יום 2-4) ו רומן אובייקט (יום 5) ( איור 4 ). ביום הראשון הונח העכבר בזירה התנהגותית נטולת חפצים. ביום 2-4 העכבר הונח בזירה עם שני אובייקטים שונים מבחינה טקסטורלית (בלוק ג'ל ובלוק עץ). ביום 5 הוחלף אחד החפצים באובייקט חדש. החיה היה צילמו על פני 5 ימים במשך 20 דקות בכל יום.

בעקבות מיצוי התא באמצעות Ca ^{2 +} נתונים תוכנת ניתוח נתונים, מסננים מרחביים המתאים מיקומי התא היו עלים על הקרנת עוצמת פלואורסצנטי הממוצע של נתוני הקלטה מיקרוסקופ( איור 5) . קו מקווקו לבן מפריד שכבות 2/3 ו 5 תאים. מקבילים Ca ^{2 +} עקבות מ 5 תאים מכל אחת השכבות להראות את דפוס הירי של התאים בשתי הקשרים התנהגותיים שונים - היכרות אובייקט וחשיפה אובייקט רומן. שכבת 2/3 תאים היו פעילים יותר לעומת שכבת 5 תאים ביום שבו העכבר נחשף אובייקט חדש. זה ניכר גם מן החלקות רסטר המציגים את פעילות הירי thresholded של כל תאים צילמו בימים 1, 4 ו - 5.

איור 1: בויו Ca ^{2 +} הדמיה על פני שכבות קליפת המוח מרובים בחופשיות העברת עכברים. ( א ) מפרטים פריזמה בדיקה ותיאור של המטוס הדמיה. ציפוי רפלקטיבית על החלק הפנימי של hypotenuse מאפשר הדמיה 90 ° מן המטוס הכניסה של בדיקה פריזמה. העדשה cuFf משתלב עם מחזיק העדשה, אשר מייעלת את הליך ההשתלה ומאפשר צפייה פוטנציאלית של הקרינה רקמות הסביבה במהלך ההשתלה ( B ) (i). איור של מיקום של craniotomy בדיקה פריזמה חתך סכין יחסית לאתר הזרקת הנגיף, ו (ii) איור של מיקום של פריזמה בדיקה בצד שטוח יחסית לחתך סכין אתר הזרקת וירוסים. ( C ) איור של in-vivo Ca ^{2 +} הגדרת הדמיה מראה את הנתיב האור עבור שטח קטן בתוך שדה מלא של נוף באמצעות בדיקה פריזמה מושתל קליפת עכבר. ( ד ) שדה שדה תצוגה במהלך ההתקנה פריזמה בדיקה. מיקרוסקופ מיניאטורי מחובר מחזיק העדשה, המחזיקה בדיקה פריזמה המאפשר לבדוק את הביטוי וירוס במהלך ההתקנה פריזמה בדיקה. ( E ) שילוב של מיקרוסקופ עם בדיקה מנסרה עבור הדמיה קליפתית רב שכבתיים של GCaMP6f שכותרתו תאים S1. שדה שדה לדוגמה לדוגמהבמהלך ההתקנה. נקה כלי הדם דפוס גלוי בזמן baseplate להתקין עם כמה תאים בתמונה גלם. תאים נוספים נראים בבירור כאשר DF / F מופעל בחלון רכישת התוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: סכמטי מציג את ציר הזמן של אירועים זרימת עבודה עבור פריזמה בדיקה השתלת מיקרוסקופ התקנה. מספר השבועות מיוצגים על ציר ה- X ואת שלבי העבודה של ההליכים לאורך ציר ה- Y. ( A ) גרפי הממחישות הזרקת ויראלי (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) לאורך ציר dorso- הגחון אותו, כדי התווית מספר שכבות של קליפת המוח somatosensory. ( ב ) 2 שבועות לאחר זריקות וירוסים, בעיה פריזמהE הוא מושתל על ציר מקביל לאתרים הזרקת הנגיף. ( ג ) כשבוע לאחר ההשתלה בדיקה פריזמה, החיה נבדקת עבור הביטוי עם מיקרוסקופ ו baseplate מותקן על הראש אם אוכלוסייה של תאים גלוי. ( D ) בעל החיים הוא מוכן אז הדמיה כרונית במהלך משימות התנהגותיות רלוונטיות (קליפ עכבר אמנות שונה לאחר אישור מ - UW מדיסון ביוכימיה MediaLab). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: אימות שלאחר המוות היסטולוגית של מיקום פריזמה בדיקה הביטוי GCaMP. ( א ) סעיף העטרה ממוח העכבר עכבר מראה את המסלול בדיקה פריזמה עם הצד הדמיה שלה פונהאת התאים GCaMP6f להביע (AAV1.CaMKII.GCaMP6f לידי ביטוי נוירונים בשכבות 2/3 ו 5). ( ב ) באותו המוח המוח העטרה הבאים מכתים עבור DAPI. סולם בר = 250 מיקרומטר ( C ) זום לאור תאי GCaMP6f להביע בקורטקס סומאטוסנסורי. סולם בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: פעילות עכבר במהלך הרגלה, היכרות, וחפץ אובייקט חדש בדיקה היה מעקב וידאו באמצעות תוכנת וידאו. ( א ) ביום הראשון, החיה הונחה בזירה התנהגותית נטולת חפצים (שדה פתוח). ( ב ) בימים 2-4, שני אובייקטים שונים מבחינה טקסטורלית (בלוק ג'ל ובלוק עץ) הונחו בזירה (אובייקט Fami). ( ג ) ביום 5, אחד האובייקטים הוחלף עם חפץ חדש (בלוק עץ עם נייר חול) (רומן אובייקט חשיפה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5: דינאמיקה סידן מ שכבות שטחיות ועמוקות של קליפת המוח סומטו-סנסורי של עכבר נציג צילמו עם המיקרוסקופ. ( א ) תמונה ממוזגת של מסננים נוירונים מרחביים (כתמים ירוקים) ואת הקרינה מתכוונת עוצמת הקרינה של הקלטה מיקרוסקופ דרך שדה בדיקה פריזמה של נוף. גבול בין שכבות על-גבייות ושכבות אינפרא-גרנריות המצוין על ידי קו מקווקו לבן. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( ב ) עקבות סידן מחמישה תאים שטחיים ושכבה עמוקה (מלא כחול ואדום גElls בחלונית A), המציין יחידות של סטיית תקן של הקרינה הבאים העיקריים ניתוח רכיב עצמאי. סרגל סולם אופקי 50 s וסרגל מידה אנכי 10 SD ( C ) Raster העלילה של תאים משטחית (שכבות 2/3) ושכבות עמוקות (שכבה 5) המוצגות מעל שדה פתוח, היכרות אובייקט וחפץ אובייקט חדש. סולם בר = 100 s. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הבנת פעילות מעגל עצבי במהלך התנהגות ערנית היא רמה חיונית של החקירה neuroscientific צורך ביעילות לנתח את תפקוד המוח בבריאות ומחלות. הקורטקס הוא אזור חשוב במיוחד כדי ללמוד בהקשר של התנהגות ער, שכן הוא ממלא תפקיד חשוב בהרבה תפקודים חושיים, קוגניטיביים ומבצעים ^{28 , 29} .

הטור הקורטיקלי נחשב ליחידה הפונקציונלית הבסיסית בקליפת המוח, והפעילות ברמת האוכלוסין של תאי קליפת המוח ידועה בהתאם למיקומם הפיזי בעמודה. לדוגמה, נוירונים מעוררים בשכבות 2/3 בפרויקט הקורטקס הסומאטוסנסורי, בעיקר לאזורים ניאו-קורטיקליים אחרים, ומאופיינים ברשתות קורטיקליות אחרות ³⁰ , בעוד שהתאים בשכבות עמוקות יותר מתמקדים בעיקר באזורים תת-קורטיקליים כמו התלמוס ³¹ . הקלטה של ​​פעילות של מאותS של תאים קליפת המוח שנקבע מראש בו זמנית ובאופן אמין לאורך זמן על פני lamina שונים בחופשיות נושאים מתנהג מאוד לקדם את ההבנה שלנו של זרימת מידע קליפת המוח, ומאפשר לנתח תפקודית עדינה של עמודות קליפת המוח ידי מידע התנהגותי בזמן אמת, מאזניים.

איסוף זה ברמה של נתונים מעגל עצביים מתאפשר עם שימוש יעיל ויעיל פלטפורמת מיקרוסקופ מיניאטורי לנהל בקנה מידה גדול Ca ^{2 +} הדמיה בנושאים מתנהגים בחופשיות (או נושאים קבוע בראש לפי הצורך). משמש עם מחווני סידן מקודדים מבחינה גנטית כדי לאפשר תא מסוג ספציפי מיקוד, הדמיה שדה רב שכבתית של נוף המסופק על ידי בדיקה פריזמה מושתל כרונית, פרוטוקול זה בחנו מקרה אחד בין יישומים אפשריים רבים: התבוננות הבדלים למינרית בעיבוד קליפת המוח somatosensory כאשר עכברים פיזית עוסקת עם אובייקט חדש ( איור 5 ).זהו האיור הפרוצדורלי הראשון מסוג זה של סוג תא ספציפי, בגישה vivo ללמוד שכבות קליפת המוח מרובים ער, מתנהג בחופשיות בעלי חיים, ומרחיב את הספקטרום של שיטות ניסיוניות זמין כדי להבין מבנים למינרית במוח הפעיל.

שדה הראייה פריסקופי מופעלת על ידי בדיקה פריזמה בטכניקה זו יכול להיות מוחל על מבנים מוחיים אחרים כאשר שימור הרקמות ישירות הגב אל אזור של עניין הוא הרצוי; לדוגמה, הדמיה CA3 יכול להיות מושגת ללא הפרעה של תפקוד בהיפוקמפוס.

פריזמה בדיקה המבוססת על גישה הדמיה Ca ^{2 +} פעילות מחייב את ההכנסה פיזית השתלה קבועה של microprism לתוך קליפת המוח, אשר משווה את היצירה של הנגע קליפת המוח שבו בדיקה העדשה מוכנס. זה עלול לגרום שיבושים המעגלים העצביים המקומיים, כולל ניתוק של דנדריטים ותהליכים אפיים. Tההליך שלו גם יגרום הפעלה ראשונית של תאים גליה באזור, אם כי זה צפוי להיות מקומי לרקמה על 150 מיקרומטר מ הפנים פריזמה, וכדי להירגע לאחר המוח ריפא ²² . חשוב מאוד לשקול אם טכניקה זו תשפיע על אנטומיה מעגל רגיל ו / או התנהגות של בעלי החיים בעת תכנון ניסויים. קבוצות בקרה התנהגותיות צריכות תמיד להתבצע על מנת להבטיח כי אין שינויים משמעותיים בהתנהגויות בסיסיות שעלולות לגרום לתוצאות ניסוי מבולבלות.

שימוש זה מיניאטורי, נייד Ca ^{2 +} טכניקה הדמיה עם מניפולציה neuropharmacological, שונים קוגניטיבית, חברתית, מוטורית או פרדיגמות התנהגותיות, ולשלב אותו עם מדדים פיזיולוגיים אחרים יכולים להעמיק ולהעשיר מחקרים התמקד בהבנת תפקידים תפקודיים של מעגלים עצביים בהתנהגות האות עיבוד ³² דיכוי או הפעלהAtion של מסלולים מסוימים מאופיינים על ידי תרופות יכול להשפיע על התנהגויות הקשורות, אשר ניתן ללמוד בקלות באמצעות טכנולוגיה זו ³³ . הסתעפות לתוך סוגי תאים שונים על ידי שינוי המיקוד של מחוון סידן עוד יישום חזק ושימושי, ומאפשר שילובים יצירתיים רבים של כלים ניסיוניים כדי לענות על מגוון רחב של שאלות מעגל עצבי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 963SD	Surgery
Stereoscope	Labomed	Prima DNT	Surgery and Imaging
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6 mm diameter) - 1/4" Jack	FHC	40-90-5D-02	Surgery
Heating Pad 5 X 12.5 cm	FHC	40-90-2-07	Surgery
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D	Surgery
Microsyringe Pump	World Precision Instruments	UMP3 model; serial 155788 F110	Surgery
NanoFil 10 μL Syringe	World Precision Instruments	NANOFIL	Surgery
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK	World Precision Instruments	NF35BV-2	Surgery
Omnidrill35, 115 - 230 V	World Precision Instruments	503598	Surgery
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Surgery
nVista	Inscopix	100-001048	Imaging
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-1-PV3435	Surgery
Ketoprofen	Victor Medical	5487	Surgery
Carprofen	Victor Medical	1699008	Surgery
Isoflurane	Victor Medical	1001054	Surgery
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)	Pfizer (Fisher Scientific)	NC9841478	Surgery
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35	Surgery
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30	Surgery
Dissecting knives	Fine Science Tools	10055-12	Surgery
ProView Implant Kit	Inscopix	100-000756	Surgery and Imaging
ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length	Inscopix	100-000592	Surgery and Imaging
Kwik-Sil adhesive pack of 2	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Surgery
Kwik-Cast Sealant	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Surgery and Imaging
Miniature Optical Mounting Post	Newport	M-TSP-3	Imaging
Microscope Baseplate	Inscopix	BPL-2	Imaging
Microscope Baseplate Cover	Inscopix	BPC-2	Imaging