Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

Özet

Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca ²⁺ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Özet

In vivo devreler ve hücresel düzeydeki fonksiyonel görüntüleme beyindeki hareketleri anlamada kritik bir araçtır. İki fotonlu mikroskop ile fare kortikal nöronlarının yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, korteks yapısı, fonksiyonu ve plastisite ile ilgili benzersiz bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar baş sabit hayvanlarla sınırlıdır ve bu çalışma için olan davranışsal karmaşıklığı büyük ölçüde azaltır. Bu yazıda, serbestçe davranan farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlüğe sahip kronik floresan mikroskobu gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Birkaç gün boyunca yeni bir nesne arama görevinde bulunan fare, somatosensor korteksin çok katmanlarında yüzlerce nöronun kalsiyum dinamiklerini aynı anda görselleştirmek ve kaydetmek için implante edilmiş bir prizma probu ile birlikte entegre bir minyatür floresan mikroskop kullandık. Bu teknik, farklı davranış türlerine göre farklı hayvan türlerinde diğer beyin bölgelerine uyarlanabiliraradigms.

Giriş

Korteks dikkat, duyusal algılama ve yukarıdan aşağıya doğru bilişsel kontrol ^{1 , 2 , 3'ten} motivasyon, ödül ve bağımlılık yolları ^{4 , 5'e} kadar bir çok karmaşık zihinsel ve davranışsal işlevin önemli bir oyuncusu. İşlevinin altında yatan hesaplama süreçlerini anlamak, birçok zihinsel ve davranışsal bozukluğun daha iyi klinik anlayışını sağlamak için önemli bir hedeftir.

Birçok psikiyatrik hastalık kuramı, kortikal sinirsel devre disfonksiyonu ya da discoordinasyonun şizofreni ⁶ , otizm ⁷ ya da obsesif-kompülsif bozukluk gibi koşulların ayırıcı özelliklerinden biri olan bilişsel ve davranışsal anormallikler altında yattığı fikrinin etrafında toplanmaktadır. Böylece, toplum düzeyinde sinir aktivitesi verileri co eldeEşzamanlı davranışsal bilgi bağlamında rtical devreler çok önemlidir ve ideal olarak ince sinirsel devre diseksiyonu için spesifik hücre tiplerini hedef alabilir.

İmplante edilebilir gradyan refraktif indeks (GRIN) mikrolensiyonlarıyla birlikte küçültülmüş mikroskoplar, korteks ^{14 , 15 , 16} da dahil olmak üzere olası beyin bölgelerinden ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} çeşitliliğinden serbestçe hareket eden şartlar altında nöronal topluluklara optik erişim sağlar. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleriyle birleştirilmiş bir mobil mikroskopi sistemi kullanarak birçok beyin bölgesindeki 9 günde haftada yüzlerce nöronun bulunduğu aynı hücresel popülasyonun tutarlı şekilde görüntülenmesi sağlanır veGenetik olarak viral vektör veya transjenik teknikler kullanılarak spesifik hücre tiplerini hedef almıştır.

Korteks'in farklı fonksiyonları desteklediği ve hücrelerin kortikal tabakasında ^{17 , 18 , 19} bulunan yerlerine bağlı olarak farklı beyin bölgelerine bağlandığı bilinmektedir, uyanık davrandıkları konularda eşzamanlı çok katmanlı sinirsel aktivite elde etmekle ilgileniyoruz. Burada korteksi çok katmanlı bir görünüm sunan implante edilmiş bir prizma probu ile eşleştirilmiş olan minyatür flüoresan mikroskop 20'yi kullanarak günlerce serbestçe farları davrandıkça yüzlerce floresan etiketli nöronun nasıl görüntüleneceğini göstermektedir ( Şekil 1 ).

Burada kullanılan prizma probu iki ayrı GRIN lensinden oluşur: bir prizma ve bir silindirik röle lensi ( Şekil 1 ). Mikroskoptaki ışık, flüoresan etiketliProbların prizma bölümünün hipotenüsünden yansıyan prizma probunun görüntüleme yüzü boyunca yer alan hücreler. Hücrelerden yayılan ışık aynı zamanda prizmanın hipotenüsünü yansıtır, mikroskopun amacı aracılığıyla toplanır ve mikroskopta sensöre ulaşır. Bu prosedürde kullanılan prizma probu standart stereotaksik ekipmanlarla kolay kullanım için uyarlanmıştır.

Minyatür floresans mikroskopu ²⁰ , tek hücreli çözünürlükte nöronal popülasyonlarda aksiyon potansiyelinden uyarılmış Ca ²⁺ geçişlerini saptar ve bu hücreler özellikle Ca ^2+' ya duyarlı genetik olarak kodlanmış fluoresan göstergelerle etiketlenir. Bu protokolde, viral bir vektöre (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) kodlanmış Ca ²⁺ göstergesi enjekte ediyoruz, bir prizma probu yerleştiriyoruz, mikroskopu taktıktan sonra, birden çok gün somatosensoriyel (S1 arka bacak) nöral aktivite verilerini elde ediyoruz Bir hayvandan maruz kalmaD) serbest araştırmalar sırasında yeni nesne yüzeylerine bırakın ( Şekil 2 ).

Protokol

Hayvanları ilgilendiren prosedürler, Kaliforniya'daki NASA Ames Araştırma Merkezi'ndeki LifeSource Biyomedikal Hizmetleri'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Preoperatif Hazırlık

1. Cerrahi prosedürlerde kullanılacak aletleri bir sıcak boncuk sterilizatöründe sterilize edin ve ameliyat alanını% 70 etanol ile silin. Stereotaksik aşama üzerine yerleştirilen ısıtma pedini açın ve 37 ° C'de muhafaza edin.
2. Hayvanı izofluran kullanarak anestezi altına alın (indüksiyon için% 5, bakım için% 1-2, 0.6-0.8 L / dak O2). Anestezinin derinliğini değerlendirmek için ayak parmak refleksinin yokluğunu kontrol edin.
3. Hayatı, kulak ve diş çubuklarıyla donatılmış stereotaksik bir çerçeveye monte edin.
4. Hayvan gözlerine oftalmik merhem uygulayın ve kuruma ve yoğun cerrahi ışıklardan korumak için onları koyu renkli bir kağıtla örtün.
5. Hayvana, deri altından ketoprofen (2.5Mg / kg) veya karprofen (2.5 mg / kg)

2. Virüs Enjeksiyonu Ameliyatı

1. Kafa derisini gözler ve kulaklar arasında traşlayın ve tıraş edin ve% 70 etanol ve betadin ile 3 alternatif svapla cildi dezenfekte edin.
2. Kafa derisini, gözler arasında başlayarak ve steril bir cerrahi bıçak ile 1.5 cm rostrokarayı uzatarak kafa derisini keserek kafatasını ortaya koyun. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi açın ve pamuklu çubuklar ve bir neşter kullanarak arzu edilen enjeksiyon yerindeki periostu çıkartın. Kafatasını steril PBS ile durulayın. Pamuklu çubuklarla kafatasını temizleyin ve parlatın.
3. Kafatasını düzleştirin ve bir işaretleyici ile virüs enjeksiyonu için stereotaksik koordinatları işaretleyin. Yüksek hızda bir mikro delme (yaklaşık 7.000-10.000 dev / dak) üzerine 0.5 mm'lik çapak kullanarak, kafatasında küçük bir delik oluşturun. Delik açarken hafif basınç uygulayın ve kemik tozu aralıklı olarak temizleyin ve beynin aşırı ısınmasını önlemek için steril PBS ile nemlendirin, beyin yüzeyi tekrar ortaya çıkıncaya kadarağrıyordu. Deli delinmiş beyni nemli tutun.
4. Mikro sirkülasyonda virüsü ( örn. AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) almak için 26 G'lik bir iğne kullanın ve enjeksiyon için 35 G'lik bir iğne ile değiştirin. Stereotaksik aparatın manipülatör koluna virüs yüklü mikrozirjeri takın.
5. Şırıngayı enjeksiyon bölgesi deliğine yakın hale getirin ve iğnenin açısını ayarlayarak beyin yüzeyine 90 ° açıyla girmesini sağlayın. İğneyi pia mater'e dokunana kadar indirin ve durayı delin. İstenen derinliğe (z) ulaşıncaya kadar iğneyi 10 μm / s'lik artışlarla düşürmeye başlayın. Stereotaksik kol kullanarak iğne yerini düzeltin.
6. Mikro şırınga pompasını 25 nL / dak'da 250 nL virüs enjekte edecek şekilde ayarlayın.
   1. Kritik adım: Enjekte edilecek virüs hacmi titreye ve seyreltmeye bağlı olduğundan, görüntüleme hücreleri için optimum hacim ve konsantrasyon kriterlerini oluşturmak için önceden seyrelme deneyleri yapınDeneyde.
7. Bazı virüs enjeksiyon yerinden dışarıya sallanan görülürse, enjeksiyonu duraklatın ve beyin dokusu virüs damlasını emene kadar bekleyin. İğneyi geri çekmeden önce toplam hacim enjekte edildikten sonra 5-7 dakika bekleyin. Hızlı yeşil gibi boyalar, virüsün beyin yüzeyinden dışkılandığı görüldüğünde enjeksiyon oranını kontrol etmeye yardımcı olmak için virüs solüsyonuna eklenebilir.
8. Kortekste birden fazla katmanın etiketlenmesi için, gerekirse birden fazla enjeksiyon kullanın. Enjeksiyon sonrasında 5-7 dakika bekleyerek ve enjeksiyon için en sonraki dorsal noktaya kadar iğneyi yukarı çekerek ventral en siteye başlayın ( örn . -1.0 mm AP, 1.5 mm ± ML ve 400 ve 600 μm'de enjekte edin DV). İğneyi çıkarmadan ve stereotaksik kurulumdan çıkarmadan önce son enjeksiyondan 10 dakika sonra bekleyin.
9. In vivo biyouyumlu bir şeffaf elastomer yapıştırıcıyı, çift barar şırıngadan küçük bir miktar karıştırın (Örneğin Kwik-Sil) ve kafatası deliğini örtün. Siyanoakrilat yapıştırıcıyı elastomer yapışkan tabakasının üzerine uygulayın ve iyileşmesine izin verin.
10. Kafa derisini dikin ve hayvanın ayakta tutulana kadar sıcak bir kurtarma kafesindeki anesteziden kurtulmasına izin verin. Hayvanı eve götürmeden önce ketoprofen (2.5 mg / kg) veya karprofen (2.5 mg / kg) subkütan uygulayın. Ameliyat bölgesini korumak için ameliyattan sonra bireysel olarak eve gidin ve 24 saat sonra tekrarlayın.
11. Mikro sirkeyi çıkardıktan sonra, 26 G ve 35 G iğnelerini depolamadan önce temizlemek için 7-10 kez damıtılmış su ile yıkayın.

3. Prism Prob İmplant Cerrahisi

1. Virüs enjeksiyonundan 1-2 hafta sonra, prizma probu implant ameliyatına hazır olun. Prizma probunu% 70 etanol içinde dezenfekte edin ve lens kağıdıyla temizleyin. Prizma probunu lens tutucu aletine takın ve altıgen vidayı tornavida ile sıkın. Mikroskopı taban tutacağına oturtun (Mıknatıslar yerinde tutacaktır).
2. Hayvanı Pre-operatif Hazırlık bölümünde özetlendiği gibi hazırlayın.
3. Hayvanların başını gözler ve kulaklar arasında traşlayın ve tıraş edin ve% 70 etanol ve betadin'in alternatif svapları ile cildi dezenfekte edin.
4. Cilde bir steril makasla incense getirerek kafatasını ortaya çıkarın ve cilt kapağını ve alttaki periostu çıkarın. Kafatasını pamuklu çubuklarla kurutun ve parlatın. Aşağıdaki adımlara hazırlıklı olarak temiz, kuru, geniş bir kemik teması oluşturmak için çevreleyen kas dokusunun yeterli şekilde çıkarılmasını sağlayın.
5. İmplant kafatası, kontrlateral hemisferde implantın sabit ve güvenli olmasını sağlamak için vidalanır. Bölüm 5'deki deneysel görüntüleme oturumları için hayvanı hazır hale getirmek için uyanık kafa tespiti için bir başlık koymak için bunlar da yararlı olabilir.
6. Kafatasını düzleştirin ve bir işaretleyici ile lens takılması için AP ve ML koordinatlarını işaretleyin. Mikrodalgada 0.5 mm'lik çapak kullanarak, yuvarlak bir kraniyotomi açarak,Kraniotomi çapı prizmadan daha büyük, yani bu durumda 1.0 mm'dir. Kafatasını steril PBS ile yıkamak için aralıklı olarak duraklayarak yavaşça matkap yapın ve pamuklu çubukla emdirin. Oluşturulan kemik tozunu çıkarın.
   1. Kritik adım: Kraniyotomiyi prizmayı kortekse yerleştirirken düz kenarını (görüntüleme yüzeyi) virüs enjeksiyon bölgesine bakacak ve 150-200 μm yarıçap içinde olacak şekilde yerleştirin.
7. Kafatası tamamen inceltilmeden önce sondajı durdurun. Kan damarları inceltilmiş kemik vasıtasıyla görünür olmalıdır. Kemik tapasını hafif 45 ° forseps ile hafifçe çıkarın.
8. Dura # 5 forseps ile çıkarın.
   1. Kritik adım: Beyin dokusu maruz kaldıktan sonra daima dokuyu nemli tutun. Kraniyotomi üzerine steril tuzlu suya batırılmış pamuklu çubuk yerleştirin. Bu aynı zamanda doku üzerinde baskı oluşturacaktır.
9. Beyindeki doku içindeki basıncı hafifletmek içinPrizma probunun halka takılması, önceden bir giriş yolu oluşturun. Stereotaksik aparatın elektrot tutucu koluna düz kenarlı bir diseksiyon bıçağı takın ve bıçak bıçağının kafatasının eğriliğine dik olacak şekilde (bu durumda 10 ° açı) dikey açıdan stereotaksik aparat üzerine monte edin (bu durumda 10 ° açı) ve Virüs enjeksiyon sütununa paralel düzlem.
10. Bıçağı bu durumda ön medial kenarı boyunca kraniotominin üzerinde dikkatlice konumlandırın ve kesme kenarı posteriora bakacak şekilde virüs enjeksiyon bölgesine ~ 200 μm lateralden yerleştirin ( Şekil 1 ). Bıçak ucu piyaya dokunduğunda Z eksenini sıfırlayın ve onu (10 μm / s'lik artışlarla) yavaşça prizma probunun ekleneceği bir derinliğe indirin. Daha sonra prizmanın ön kenarı için bir yol oluşturmak için bıçağı 1 mm geriye doğru hareket ettirin. Önceden steril olmayan salinle ıslatılmış bir gelfoam parçası ile insizyon yaparken oluşabilecek kanamaları durdurun ve kontrol edin.
11. Bıçak bu konumdaysa, siteyi steril salinle yıkayın ve herhangi bir kanamanın sönene kadar bekleyin. Daha sonra stereotaksik kol mikromanipülatörü kullanarak 10 μm / s'lik artışlarla bıçağı yavaşça geri çekin ve kesikten steril salinle ıslatılmış bir parça gelfoam sünger koyun.
12. Mercek tutucuyu (prizma probu ve mikroskop ile birlikte) stereotaksik manipülatör koluna önceki adımdaki bıçakla aynı açıda tutturun. Prizmi prizmanın düz tarafının kesi ve virüs enjeksiyon sütununa paralel olacak şekilde hizalayın. Bu adım, stereotaksik kol pozisyonunun biraz düzeltilmesini gerektirebilir. Daha hızlı sonuç almak için kafatasına yakın durarak hizalamayı ayarlayın.
13. Prizma doğru açıdaysa, beyin yüzeyinden başlamak üzere, bu prob için kademeli olarak beyinde 10 μm artışlarla 1.1 mm nihai bir z'ye indirin. Beyin dokusu prizmanın etrafında genişleyecek ve oluşturulan herhangi bir baskı, görselleştirmenin arkasındaUçağa bindirir ve görüş alanını etkilemez. Mikroskopu, bir USB3 portu ile kurulan edinim yazılımıyla bir bilgisayara takın ve LED'i açarak alan flüoresanını görselleştirin.
14. 25G'lik bir iğne kullanarak çok ince bir elastomer yapıştırıcı tabakasında kraniyotomideki prizmanın çevresindeki maruz kalan dokuları kapatın.
15. Elastomer yapışkan iyileştirildikten sonra (genellikle ~ 3-5 dakika içinde) lensin içeri hareket etmesini önlemek için prizma lensinin camını elastomer yapışkan tabakasının üzerine bitişik kafatasına tutturmak için bazı siyanoakrilat yapıştırıcı uygulamak için 25G'lik bir iğne kullanın. Kraniyotomi. Daha iyi yapışma için prizma sondası manşonunun kenarlarını ekleyin. İmplante prizma probunun üst yüzüne herhangi bir yapışkan vermeyin. Siyanoakrilat yapıştırıcı sertleştikten sonra lens tutucusunu sökün ve dikkatle mikroskopu çıkartın. Ardından stereotaksik manipülatör kolunu yavaşça geri çekerek prizma probunu güvenli bir şekilde yerleştirin.
16. Bir diş akriliği katın veyaSiyanoakrilat yapıştırıcı, maruz kalmış tüm kafatası yüzeyini örtecek şekilde, etrafında geri çekilen kas dokusuna dokunmaksızın implant etrafında tutunur. Bu kafatası kapağı ile büyük bir kafatası örtüsü daha sonra taban plakası eki yardımcı olacaktır. İmplant alanının çevresindeki cilt kafa tabanı etrafında iyileşmelidir.
    1. Kritik adım: Yapışkanın çevresindeki deri veya kas dokusuna dokunmamasına ve kafatası kapağındaki herhangi bir cildi tıkamamasına izin vermeyin. Bunu yapmak deriyi tahriş eder ve aşırı çizilme ve implantın potansiyel hasar görmesine neden olabilir.
17. İsteğe bağlı: Hayvanları kısaca anesteziye tabi tutmak ya da tarak yapmak yerine mikroskopu deneysel görüntüleme oturumlarında bir hayvanın taban plakasına tutturmak ve sökmek için uyanık başlı bir kurulum kullanmak istiyorsanız, uyanık bir kafa ile uyumlu kafatası başlıkına bir başlık koyun, Sabit kurulum (bu protokolde gösterilmemiş).
18. Katalizörü ve bazını bir silikondanE yapışkanlı bir şırınga yerleştirin ve herhangi bir hasar ve çökmeyi önlemek için prob lensinin üstünü örtecek şekilde prizma sondası manşonunun içine bir damla elastomer koyun.
19. Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve sıcak bir odadaki anesteziden kurtulmanıza izin verin. Deri altı olarak ketoprofen (2.5 mg / kg) veya karprofen (2.5 mg / kg) uygulayın ve hareketsiz kaldıktan sonra hayvanı temiz bir ev kafesine geri koyun. İmplantı korumak için tek tek eve konular yerleştirin ve 24 saat sonra tekrarlayın.

4. Minyatür Mikroskop Kurulumu için Baz Platform Ataşmanı

1. Prizma probunu yerleştirdikten sonra bir hafta ila 10 gün sonra, implante prizma probu vasıtasıyla dokuda virüs ekspresyonu olup olmadığını kontrol edin ve preparat hücre aktivitesi gösteriyorsa kafatasına bir taban plakası takın. Mikroskop, canlı görüntüleme sırasında taban plakasına sabitlenir.
2. Hayvanı taban plakası eki için hazırlamak için preoperatif prosedürde belirtilen adımları izleyin.
3. Silikon yapışkan kapağı implante edilmiş prizma probu lensinin üst yüzeyinden çıkarın. Lens prob yüzeyini inceleyin ve görüntü yüzeyinin temiz olmasını sağlamak için herhangi bir enkaz lens kağıdıyla ve% 70 etanol ile hafifçe temizleyin.
4. Mikroskopu DAQ kutusuna takın ve onu USB3 portundan bilgisayara bağlayın.
5. Edinme yazılımını bilgisayarda açıp mikroskopu USB3 portundan bağlayın. Sinir aktivitesini kontrol etmek ve bu konudaki gelecek kayıtlar için görüş alanlarını ölçmek ve belgelemek için edinim yazılımını kullanın.
6. Mikroskop bir taban plakası takın ve taban plakası yerinde tutmak için taban plakası set vida bağlamak ve mikroskop gövdesi tarafından stereotaksik micromanipulator kol mikroskop tutucu içine mikroskop sabitleyin. Tutucuyu, stereotaksik mikromanipülatör koluna monte edilebilen bir Newport çubuğa takın.
7. Mikroskopu prizma prob lensinin üzerine sTereotaksik mikromanipuatör kolu. Prizmayı, hayvan sahnesinin yanından ve arkasından görüntüleyerek yönlendirmeyi denetleyin. Hem mikroskop objektif hem de prizma prob lensinin optik eksenleri hizalanmalıdır.
8. Yazılım aracılığıyla mikroskop LED'ini açın. Edinim yazılımındaki implante edilmiş prizma prob lensinin üst yüzüne odaklanarak mikroskop uyumunun kalitesini değerlendirin. Düzgün hizalandığında, prizma probu mercek üst yüzünün kenarları keskin olmalıdır.
9. Doku içinde istenilen odak düzlemini elde etmek için stereotaksik manipülatör kolu kullanarak implante prizmadan önceki mikroskopun fiziksel mesafesini ayarlayın. Mikroskop objektif ile implante edilen GRIN lens arasındaki optik olarak optimize edilmiş mesafe ~ 500 μm'dir.
10. Arzulanan görüntüleme düzlemi yakalandıktan sonra bir referans floresans görüntüsünü kaydedin.
    Kritik nokta: Bu noktadan itibaren, mikroskopun konumunu ayarlamayın, çünkü bu yer değiştirirDoku üzerindeki görüntüleme düzleminin üstünde.
    NOT: Taban plakasının kafatası başlığına göre kalıcı olarak sabitlenmesi için bir sonraki aşamada yapıştırıcı uygulayın. Yapıştırıcı, ertesi gün ya da iki gün içinde dokudaki odak düzlemini değiştirebilecek miktarda küçülme yaşayabilir. Yapışkan karışımınızdaki büzülme miktarını ve eks vivo mesafeyi ölçerek bunu önleyici olarak hesaplayın, daha sonra yapışkan uygulama aşamasına geçmeden önce mikroskop + taban plakasının son Z konumunu bu miktara yedekleyin.
11. Dental akrilik veya siyanoakrilat kullanarak, taban plakasını hayvanın kafatasını örten akrilik kapağa yapıştırın ve boşluğu akrilik veya yapışkanla köprüleyin. Diş akrilik / siyanoakrilatın aşamalı olarak uygulanması ve birden fazla aşamada iyileştirilmesi, daha önce belirtilen büzülmenin mikroskop görüntü düzleminin son konumu üzerindeki etkisini en aza indirebilir.
    1. Kritik adım: Dental uygularken dikkat edin.Akrilik / siyanoakrilat, herhangi bir malzemenin mikroskop objektif merceği, ayar vidası veya mikroskop gövdesi ile temas etmesini önlemek için daha sonra enstrümantasyonun düzgün çalışmasını önleyecektir.
    2. Kritik adım: Yapıştırıcıyı uygularken mikroskopu zorlamayın. Mikroskop veya taban plakasındaki basınç, mikroskop objektifinin, prizma prob lensine göre hareket etmesine neden olabilir; bu da, hizalama veya dokudaki odak düzleminin, hızlı yeniden ayarlama gerektirecek bir değişiklikle sonuçlanmasına neden olabilir.
12. Diş akrilik / siyanoakrilatın akrili bir çift forseps veya şırınga ucu ile dokunarak sertleştiğini ve sertleştirildiğini doğrulayın. Edinme yazılımı ile nihai bir referans floresans görüntüsünü elde edin.
13. Mikroskopu tutucudan serbest bırakın ve tutacağı mikroskoptan çekin. Siyanoakrilat veya başka bir şeffaf yapışkan kullanılmışsa, bunu önlemek için siyah tırnak cilası veya bir siyah çimento tabakası ile örtün.Deneyler sırasında elde edilen gelecek görüntüleri kirletebilecek baş başlığına sızıntı yapar.
14. Bu noktada, gerekirse mikroskopu çıkarın. Mikroskopu taban plakasından ayırmak için ayar vidasını saat yönünün aksine yaklaşık ½ tur döndürerek taban plakası tespit vidasını serbest bırakın. Diğer eliyle taban plakasını ve akrilik kapağı desteklerken mikroskop gövdesini sıkıştırın ve mikroskopu düz olarak yukarı çekin. Depo kabında değiştirin.
15. İmplante edilmiş prizma sondasını bir taban plakası örtüsüyle koruyun. Bu, mercek yüzeyinde toz parçacıklarının çökelmesini önleyecektir; taban plakası takıldıktan sonra temizlenmesi zor olabilir.
16. Taban plakası kapağını taban plakasına tutturun ve ayar vidasını saat yönünde yaklaşık ½ tur ilerleterek veya ayar vidası taban plakası kapağı ile aynı hizaya gelene kadar ilerletin. Aşırı sıkıştırmayın.
17. Hayvanı anesteziden çıkarın ve ambulatuvara kadar sıcak bir toparlanma odasında izleyin. DönüşE hayvan onu ev kafesine. İmplantın korunması için tüm hayvanları tekli olarak yerleştirin.

5. Serbestçe Hareketli Bir Fare'de Çoklu Kortikal Katman Görüntüleme

1. Davranış aparatını ( örneğin Phenotyper, Noldus) temizleyip dezenfekte edip% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile silinerek hazırlayın.
2. Mikroskopu DAQ kutusuna takın ve bilgisayara bağlayın ve satın alma yazılımını çalıştırın.
3. Edinme bilgisayarında yeterli dosya depolama alanı olup olmadığını kontrol edin ve kalsiyum görüntüleme filmleri için yer bırakın. Mikroskop ile bilgisayar arasındaki yüksek veri aktarım oranını karşılamak ve kayıtlar sırasında veri kaybını önlemek için doğrudan yazılımdan harici bir sabit sürücüye yazma yerine yerel sabit diske kaydedin.
4. Mikroskop takmak için bir indüksiyon odasında izofluran (% 5 oksijen) ile hayvana anestezik. Alternatif olarak, hayvanı nazikçe ovmak veya uyanık başlı bir kurulum kullanmakAnestezinin seçtiği davranışsal paradigmayı etkilediği biliniyorsa bir baş çubuğu ile.
5. Taban plakası tespit vidasını saat yönünün tersine çevirerek ve taban plakası kapağını kaldırarak taban plakası kapağını çıkartın.
6. Hayvanın taban plakasına mikroskop yerleştirin. Mikroskop, taban plakasındaki mıknatısların yardımı ile yerine oturmalıdır. Hafif direnç hissedilene kadar taban plakası ayar vidasını ileri alın.
   1. Kritik Adım: Mikroskop muhafazasının hasar görmesini önlemek için taban plakası tespit vidasını aşırı sıkmayın.
7. Yazılımda bir florasan anlık görüntüsünü elde ederek dokudaki görüntüleme düzlemini kontrol edin ve gerekirse, ince odaklamayı ayarlamak için mikroskop taretini döndürerek, vidayı mikroskop taretini gevşeterek dokudaki odak düzlemini ayarlayın, daha sonra tareti tekrar sıkın Mahfaza seti vidası.
   1. Kritik Adım: Taretin, önce ayar vidasını gevşetmeden döndürmeye zorlamayınız veTaret set vidasını aşırı sıkmayın.
8. Uzunlamasına bir çalışma yürütüyorsanız, aynı görüş alanını yakalamak için fiziksel taret konumuna geri dönün. Donanımda, aynı görüş alanına hızlıca geri dönmek için her bir hayvan için aynı mikroskopla görüntülendiğinde taret dönüşlerinin sayısını veya taretin fiziksel konumunu not edin.
9. Mikroskopu taşıyan hayvanı evde beslenen kafese ya da davranış odasına alıştırmak için serbest bırakın ve mümkünse anestezinin yıpranmasını beklemek.
   1. Kritik Adım: Deneysel oturumlara başlamadan önce, mikroskopu giymenin, birkaç seans için bir kukla mikroskop kullanarak mikroskobun ağırlığını taşımak için hayvanları eğitin; böylece deney oturumlarına başlamadan önce, normal davranışlarına müdahale etmez. Uyanık kısıtlama için düzenli taşıma ve eğitim hayvanlara aşırı stres yaratmamaya yardımcı olur.
10. Veri toplamak için kullanılacak satın alma ayarlarını seçin. Buna fra( Ör. 20 fps, Kazanç 1 ve LED gücü% 50). İyi SNR sağlamak için ayarları seçerken görüntü histogramını kontrol edin.
    NOT: Floresan toplama için sayısal diyafram, 1 mm'lik prizma probu için 0,35, 1 mm'lik düz prob için 0,5'tir.
11. Davranışsal yazılımı başlatın ve istenen görüntüleme kayıt döngüsünde mikroskopu tetikleyecek şekilde programlayın ( örn. , 4X 5 dakika ON 2 dak OFF). Noldus IO kutusundaki TTL bağlantı noktasını bir RJ45-BNC kablosu aracılığıyla DAQ kutusundaki TRIG bağlantı noktasına bağlayın.
12. Hayvanı davranışsal alana yerleştirin, deneyin başlatın.
13. İstenilen veriyi elde ettikten sonra, bir indüksiyon odasında izofluran (% 5 oksijen) ile hayvanı tekrar anestezi altına alınız veya hayvanı nazikçe uyanık tutunuz.
14. Taban plakası ayar vidasını gevşetin ve mikroskopu yavaşça yukarı çekerek mikroskop taban plakasından ayırın. Taban plakası kapağını yerine takın ve taban plakasını yavaşça sıkıştırınVida ayarla.
15. Bir sonraki kayıt oturumuna kadar hayvanı ev kafesine geri getirin. Aynı görüş alanına dönmek için sonraki görüntüleme oturumları için referans floresans görüntülerini kılavuz olarak kullanın.

6. Büyük Ölçekli Ca ²⁺ Görüntüleme Verilerinin Değerlendirilmesi

1. Veri alanından hücre alanı ve Ca ²⁺ dinamiklerini çıkarmak için farklı veri analiz platformları kullanılabilir. Bu çalışmada, büyük ölçekli Ca ²⁺ görüntüleme filmlerini işlemek üzere özel olarak tasarlanmış bir veri analiz platformu olan Mosaic kullanılmıştır.
2. Arızalı pikselleri düzeltin ve ön işleme aşamasındaki ham filmlerdeki düşen tek tek kareleri enterpole edin. Veri alanını azaltmak için görüntülerin tam 1,440 x 1,080 piksellik alanından 720 x 540 piksele kadar görüntüleri boşaltın.
3. Beyindeki hareket bulguları mikroskop görüntü sensörüne göre düzeltmek için, filmleri sıkı bir ImageJ tabanlı görüntü kullanarak kayıt ettirinDüzenleme algoritması (TurboReg).
4. Tek tek nöronları tanımlamak için, görüntüleri flüoresandaki göreli değişiklikler olarak yeniden ifade edin. ΔF / F ₀ = FF ₀ / F ₀ Burada F ₀ tüm filmi ortalamayla elde edilen ortalama görüntüdür.
5. Belirli bir hücre ayırma algoritması kullanarak, tek tek hücrelere karşılık gelen uzamsal filtreleri belirleyin. Burada bireysel nöronları tanımlamak için temel ve bireysel bileşen analizi ²¹ kullanılmıştır.
   NOT: Bir olayın bir tepkinin tepe amplitüdünün veri kümesinde iz temelinden 8'den fazla standart sapma olduğu ve hücre konumu ve Ca ²⁺ dinamik verileri daha ileri analiz için verildiğinde bir olay belirtildi.

Sonuçlar

Burada özetlenen protokol, prizm probları kullanarak serbestçe davranan farelerde yüzlerce kortikal nörondan boyuna çok katmanlı Ca ²⁺ görüntülemeyi gerçekleştirmenin etkili ve etkili bir yolunu anlatmaktadır ( Şekil 1 ). Çok katmanlı kortikal görüntülemeye yönelik önceki yaklaşımlar başlıca sabit hayvanlar ^{22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27} ile sınırlandırılmıştır. Bu verilerin seviyesini özgürce davranan bir bağlamda elde edebilmek için davranış esnekliği için minyatür bir mikroskop platformu kullanıldı; Genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörü (GCaMP6f) belirli bir hücre popülasyonunu (kortekste CAMKII + hücreleri) hedeflemek için kullanıldı; Ve bir prizma probu, kronik, çok tabakalı bir görüş alanı sağlamak için seçildi.

Hayvanı görüntüleme için hazırlama iş akışını gösterdik. Etiketli hücrelere optik erişim sağlamak için kronik olarak bir prizma probu implante etmeden önce, uygun bir kalsiyum indikatörü kodlayan bir viral vektör kortekse enjekte edildi ( Şekil 2 , Adım 1) ( Şekil 2 , Adım 2). Görüntüleme oturumları sırasında mikroskop yerleştirilmesi için güvenli, geçici bir platform görevi gören bir taban plakası daha sonra hayvanın başının üzerine yerleştirildi ( Şekil 2 , Adım 3), çok hücreli katmanlar arasındaki kortikal aktivitenin uyanık bir davranış deneyselinde görselleştirilmesini sağladı Kurulum ( Şekil 2 , Adım 4).

İstenen hücresel popülasyonun hedeflendiğinden emin olmak için, temsil eden bir fare için post-mortem bir koronal beyin bölümü, Şekil 3'te prizma sondası kanalı ve görüş alanı GCaMP6f laboratuara göre işaretlenmiştirSomatosensoriyel kortekste Katman 2/3 ve 5'de bulunan nöronlar.

Açık alan (Gün 1), Nesnelerin Tanıtılması (Gün 2-4) ve Roman Nesnesi (Gün 5) olmak üzere üç farklı ortama maruz kaldığında uyanık sistemli görüntüleme sırasında somatosensor kortikal nöronların aktivitesi kaydedildi ( Şekil 4 ). Gün 1, fare herhangi bir nesneden yoksun bir davranış alanına yerleştirildi. 2-4. Günlerde fare, aynı iki dokusal açıdan farklı cisimler (bir jel yatağı ve bir ahşap blok) ile arenaya yerleştirildi. 5. gün, nesnelerden biri yeni bir nesneyle değiştirildi. Hayvan 5 gün boyunca her gün 20 dakika boyunca görüntülendi.

Ca ²⁺ görüntü veri analiz yazılımı kullanılarak hücre ekstraksiyonunu takiben, hücre konumlarına karşılık gelen mekansal filtreler, mikroskop kayıt verilerinin ortalama floresan yoğunluğu projeksiyonu üzerine bindirildi( Şekil 5) . Beyaz kesikli çizgi, katmanları 2/3 ve 5 hücrelerini ayırır. Katmanların her birinden 5 hücreye karşılık gelen Ca ²⁺ izleri, hücrelerin ateşleme modelini iki farklı davranışsal bağlamda göstermektedir: Nesneleri Tanıma ve Roman Nesneye Maruz Kalma. Katman 2/3 hücreleri, fare yeni bir nesneye maruz kaldığı gün katman 5 hücreleriyle karşılaştırıldığında daha aktifti. Bu aynı zamanda, 1., 4. ve 5. günlerde tüm görüntü hücrelerinin eşikli ateşleme aktivitesini gösteren raster çizimlerden anlaşılmaktadır.

Şekil 1: Serbestçe hareket eden farelerde çoklu kortikal katmanların karşısındaki In Vivo Ca ²⁺ Görüntüleme. ( A ) Prizma prob özellikleri ve görüntüleme düzlemi gösterimi. Hipotenürün iç kısmındaki yansıtıcı kaplama, prizma probunun ekleme düzleminden 90 ° görüntüleme sağlar. Mercek cuFf, implantasyon prosedürünü düzene sokan ve implantasyon sırasında çevresel doku floresansının potansiyel olarak görüntülenmesine izin veren lens tutucusu ile bütünleşir ( B ) (i). Virüs enjeksiyon bölgesine göre prizma sondası kraniotomisinin ve bıçak kesiğinin yerleştirilmesi ve (ii) bıçak kesi ve virüs enjeksiyon bölgesine göre prizma sondasının düz tarafının konumunun gösterilmesi. ( C ) Fare korteksine yerleştirilen prizma probu vasıtasıyla tam alan içinde küçük bir alan için ışık yolunu gösteren in-vivo Ca ²⁺ görüntüleme düzeneğinin illüstrasyonu. ( D ) Prizma probu takılması sırasında örnek alan. Minyatür mikroskop, prizma probunu tutan lens tutucusuna tutturularak prizma probu kurulumu sırasında virüs ifadesinin kontrol edilmesine izin verir. ( E ) GCaMP6f etiketli S1 hücrelerinin çok katmanlı kortikal görüntülemesi için mikroskop ile prizma probu entegrasyonu. F Örnek alanTaban plakası kurulumu sırasında. Açık kan damarı deseni, ham görüntüde bazı hücrelerle taban plakası kurulumu sırasında görülür. Toplama yazılımı penceresinde DF / F açıldığında daha fazla hücre açıkça görülür. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Prizma Prob İmplantasyonu ve Mikroskop Kurulumu için İş Akışı Olaylarının Zaman Çizelgesi Gösterilen Şematik. Hafta sayısı, X ekseni üzerinde ve Y ekseni boyunca işlemlerin iş akışı adımları üzerinde gösterilir. ( A ) Aynı dorso-ventral eksende fare somatosensoriyel korteksin çok katmanlarını etiketlemek için viral enjeksiyon (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) gösteren grafik. ( B ) virüs enjeksiyonlarından 2 hafta sonra, bir prizma probuE, virüs enjeksiyon bölgelerine paralel olan bir eksene yerleştirilir. ( C ) Prizma probu implantasyonundan yaklaşık bir hafta sonra, hayvanın mikroskop ile ekspresyonu kontrol edilir ve bir hücre popülasyonu görülebiliyorsa kafaya bir taban plakası monte edilir. ( D ) Hayvan, daha sonra, ilgili davranışsal görevler sırasında kronik görüntüleme için hazırdır (Mouse clip art, UW-Madison Biochemistry MediaLab'ın izninin ardından değiştirilmiştir). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Prism Probe Yerinin ve GCaMP İfadesinin Postmostem Histolojik Onaylaması. ( A ) Prizma prob yolunu gösteren ve görüntüleme tarafı bakan temsili fare beynindeki koronal kesitGCaMP6f ifade eden hücreleri (AAV1.CaMKII.GCaMP6f nöronlarda katmanlar 2/3 ve 5'de ifade edilir). ( B ) DAPI için boyanmayı takiben aynı koronal beyin bölümü. Ölçek çubuğu = 250 μm ( C ) Somatosensoriyel kortekste GCaMP6f eksprese eden hücreler ışığında büyütülmüştür. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: Habitüasyon sırasında Fare Aktivitesi, Tanılama ve Yeni Nesne Pozlama Testi, Video Yazılımı kullanılarak Video İzlenmiştir. ( A ) 1. Gün, hayvan herhangi bir nesneden yoksun bir davranış alanına yerleştirildi (Açık Alan). ( B ) 2-4. Günlerde aynı iki dokusal açıdan farklı nesne (jel ped ve ahşap blok) arenaya yerleştirildi (Object Familiarization). ( C ) 5. günde, nesnelerden biri yeni bir nesneyle (kum kağıdı ile ahşap blok) değiştirildi (Novel Object Exposure). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5: Mikroskop ile Görüntülenen Temsilci Bir Farenin Somatosensor Korteksinin Yüzeysel ve Derin Katmanlarından Kalsiyum Dinamiği. ( A ) Nöronal uzaysal filtrelerin (yeşil bloklar) ve prizma tarama alanı üzerinden mikroskop kayıtlarının ortalama floresans yoğunluğu projeksiyonunun birleştirilmiş hali. Beyaz kesikli çizgi ile gösterilen supragranular ve infragranular tabakalar arasındaki sınır. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ) Yüzeysel ve derin tabakalı beş örnek hücrenin (dolu mavi ve kırmızı cTemel A ve bağımsız bileşen analizini takiben floresansın standart sapması birimleri belirtir. Yatay ölçek çubuğu 50 s ve dikey ölçek çubuğu 10 SD ( C ) Açık alan, Nesne Tanıtımı ve Roman nesnesi araştırması üzerinde gösterilen yüzeysel (katmanlar 2/3) ve derin katmanlardan (katman 5) hücrelerin raster çizimi. Ölçek çubuğu = 100 s. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Uyanıklık davranışı sırasında nöral devre aktivitesini anlamak, sağlık ve hastalıkta beyin fonksiyonunu etkin bir şekilde incelemek için gerekli olan hayati bir nevrofizyolojik araştırmanın seviyesidir. Korteks uyanık davranış bağlamında çalışmak için özellikle önemli bir bölgedir çünkü birçok hayati duyu, bilişsel ve yürütücü işlevlerde önemli rol oynar ^{28 , 29} .

Korteksin korteksdeki temel işlevsel birimi olduğu düşünülür ve kortikal hücrelerin popülasyon düzeyindeki aktivitelerinin sütundaki fiziksel konumlarına göre farklılık gösterdiği bilinir. Örneğin, somatosensoryal korteksteki katmanlardaki 2/3 katmanlı eksitatör nöronlar öncelikle diğer neokortikal bölgelere yönelir ve diğer korteks ağlarını ³⁰ modüle eder, buna karşın daha derin tabakalardaki hücreler esas olarak talamus ³¹ gibi kortikal bölgelere yansıtılır. Yüz etkinliklerinin kaydedilmesiÖnceden belirlenmiş kortikal hücrelerin eş zamanlı olarak serbestçe davrandıklarında farklı lamina boyunca aynı anda ve güvenilir şekilde kortikal bilgi akışı konusundaki anlayışımızı ilerleteceğini ve kortikal sütunların gerçek zamanlı davranışsal bilgi ve görevle ilişkili zamana bağlı bilgi ile daha ince fonksiyonel diseksiyona izin verdiğini, ölçekler.

Bu seviyedeki sinir devresi verilerini toplamak, serbestçe davranıyor konularda (veya istenen baş-sabit konular) büyük ölçekli Ca ²⁺ görüntülemeyi gerçekleştirmek için etkin ve düzenli bir minyatür mikroskop platformu kullanılarak mümkün hale gelir. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ile hücre tipi spesifik hedeflemeyi etkinleştirmek ve kronik implante edilmiş bir prizma probu tarafından sağlanan çok katmanlı bir görüş alanını görüntülerken kullanılan bu protokol, pek çok olası uygulama arasında bir vaka araştırmıştır: farelerde somatosensoriyel kortikal işlemedeki laminar farklılıkların gözlenmesi Fiziksel olarak yeni bir cisim ile etkileşimde bulunur ( Şekil 5 ).Bu, uyanıkken çoklu korteks tabakalarını çalışma özgürlüğü içinde davranan bu tür hücre tipine özgü, in vivo yaklaşımın ilk prosedürel örneğidir ve aktif beyindeki laminer yapıları anlamak için mevcut deneysel yöntemlerin spektrumunu genişletir.

Bu tekniğin prizma probu tarafından sağlanan periskopik görüş alanı, doğrudan ilgi alanına doğru doku korunması istenildiğinde diğer beyin yapılarına uygulanabilir. Örneğin, CA3 görüntüleme, hipokampal fonksiyonun kesintiye uğramadan başarılabilir.

Ca ²⁺ aktivitesini görüntüleme için Prism probuna dayalı yaklaşım, bir mikro prizmanın kortekse fiziksel olarak yerleştirilmesini ve kalıcı bir şekilde implantasyonunu gerektirir; bu, lens probunun yerleştirildiği bir kortikal lezyonun yaratılmasına denktir. Bu, apikal dendritlerin ve süreçlerin kesilmesi de dahil olmak üzere, lokal sinirsel devrelerde bozulmalara neden olabilir. TOnun prosedürü aynı zamanda bölgedeki glial hücrelerin ilk kez aktivasyonuna neden olur, ancak bunun prizma yüzünden yaklaşık 150 mikron dokuya lokalize edilmesi ve beynin iyileşmesi sonrasında düşmesi beklenir22. Deney planlanırken bu tekniğin normal devre anatomisini ve / veya hayvanların davranışını etkileyip etkilemeyeceğini düşünmek çok önemlidir. Davranışsal kontrol grupları her zaman karıştırılarak deneysel sonuç üretebilecek temel davranışlarda önemli bir değişiklik olmadığından emin olunması için yürütülmelidir.

Sinirsel farmakolojik manipülasyona sahip bu minyatür mobil Ca ²⁺ görüntüleme tekniğini, çeşitli bilişsel, sosyal, motor veya intrinsik davranış parametrelerini kullanarak ve diğer fizyolojik ölçümlerle birleştirerek sinirsel devrelerin davranış ve sinyaldeki işlevsel rollerini anlamaya odaklanan çalışmaları derinleştirebilir ve zenginleştirebilir Işleme ³² . Bastırma veya aktiviteİlaçlar tarafından modüle edilen bazı yolların ationu, bu teknolojiyi kullanarak kolayca incelenebilen ilişkili davranışları etkileyebilir ³³ . Kalsiyum göstergesinin hedeflemesini değiştirerek farklı hücre türlerine dalmak, başka güçlü ve kullanışlı bir uygulamadır ve çeşitli sinirsel devre sorularını çözmek için birçok deneysel araç kombinasyonuna olanak tanır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument	Kopf	Model 963SD	Surgery
Stereoscope	Labomed	Prima DNT	Surgery and Imaging
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6 mm diameter) - 1/4" Jack	FHC	40-90-5D-02	Surgery
Heating Pad 5 X 12.5 cm	FHC	40-90-2-07	Surgery
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D	Surgery
Microsyringe Pump	World Precision Instruments	UMP3 model; serial 155788 F110	Surgery
NanoFil 10 μL Syringe	World Precision Instruments	NANOFIL	Surgery
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK	World Precision Instruments	NF35BV-2	Surgery
Omnidrill35, 115 - 230 V	World Precision Instruments	503598	Surgery
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Surgery
nVista	Inscopix	100-001048	Imaging
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40	Penn Vector Core	AV-1-PV3435	Surgery
Ketoprofen	Victor Medical	5487	Surgery
Carprofen	Victor Medical	1699008	Surgery
Isoflurane	Victor Medical	1001054	Surgery
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)	Pfizer (Fisher Scientific)	NC9841478	Surgery
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35	Surgery
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30	Surgery
Dissecting knives	Fine Science Tools	10055-12	Surgery
ProView Implant Kit	Inscopix	100-000756	Surgery and Imaging
ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length	Inscopix	100-000592	Surgery and Imaging
Kwik-Sil adhesive pack of 2	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Surgery
Kwik-Cast Sealant	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Surgery and Imaging
Miniature Optical Mounting Post	Newport	M-TSP-3	Imaging
Microscope Baseplate	Inscopix	BPL-2	Imaging
Microscope Baseplate Cover	Inscopix	BPC-2	Imaging