שיטת השתלת איון כדי Omentum העכבר

Summary

שיטה השתלת עם פגיעה של איים ב עכבר הוא הציג. איים מבודדים מעורבבים עם הידרוג, התערובת ימוקם לתיק עם פגיעה של עכבר סוכרתית. לאחר מכן, הסוכר מנוטר, מבוצע ניתוח חיסונית-פתולוגיה.

Abstract

השתלת איון הוצע להיות טיפול פוטנציאלי עבור סוכרת מסוג 1. ראיות משכנעות האחרונות מצביע על כך איון קרישה תוך-כלית אינפוזיה הוא רחוק מלהיות אידיאלי, ולכן, omentum הוא מחדש המתעוררים כאתר ערך פוטנציאלי עבור השתלת איון. הניסוי הזה דורש את ניתוקה של איים קטנים באיכות גבוהה ההשתלה של איונים לנמענים סוכרתית. השתלת כדי omentum דורש צעדים כירורגי ניתן כדאי להדגים באופן חזותי. . הנה, השלבים המפורטים עבור הליך זה מוצגים. שתי שיטות של ערבוב של איים מבודדים עם הידרוג לפני הצבת את התערובת לתוך המשקה עם פגיעה בעכברים סוכרתיים מתוארים כאן. Hydrogels שונים משמשים את התנאים שונים. רמות הגלוקוז בדם של העכבר סוכרתיים מקבלי syngeneic איים קטנים ב- omentum נוטרו עד 35 ימים. כמה חיות הוקרבו לאחר 14 ימים לבצע ניתוח חיסונית-פתולוגיה. גישה זו השתלת קליניים יכול לשמש הראשוניים שהובילו תרגום השתלת קליניים.

Introduction

על-פי הבינלאומי לסוכרת הפדרציה (צה ל), סוכרת כיום משפיע 382 מיליון איש, עם עלייה המוקרנת 592 מיליון אנשים על-ידי מלאך¹. שניהם השתלת איון allogeneic, xenogeneic, טיפול לדיכוי המערכת החיסונית מערכתית הכרחי. ללא החיסוני, הדחייה החיסונית הוא הגורם העיקרי לאובדן שתל². יש גם בעיה משמעותית של איון המושתלים אובדן עקב דם מיידית מתווכת תגובה דלקתית (IBMIR)^3,4. עם זאת, אפילו בהיעדר תגובה חיסונית כמו syngeneic או אוטומטי-השתלת מודלים, תאי איון מושתלים לתוך הכבד דרך וריד שער הכבד אובדות עקב דלקת ו/או תנאים סביבתיים שלילי, כגון דם לקויה לספק חמצון מופחתת ו/או חומרים מזינים^5,6. כתוצאה מכך, על מנת להבטיח תפקוד מטבולי לטווח ארוך, מספרי איון גבוהים יותר נחוצים לפצות על אובדן התא הראשוני אשר מפחית את engraftment⁷.

בניסיון לייעל את איון engraftment, מספר אתרים אנטומי חלופי נחקרו ניסיוניים וכן קלינית, עם מבטיח, אך לא מוחלטת תוצאות⁸. ואילו חלק מהאתרים אלטרנטיבית מציעים גישה קלה ובטוחה (למשל. עור, כליות כמוסה, submucosa קיבה, החדר הקדמי של העין) או משטח רחב יותר עבור ההמונים איון גדול יותר (למשל., חלל הצפק), הישרדות, הפיזיולוגיות ביצועי מטבולית איים המושתלים הם עדיין מוגבל ולהישאר הדאגה⁹. החיפוש אחר אתר מתאים יותר עבור איון engraftment עודנו מתנהל.

Omentum היה בין האתרים אנטומיות רבות היו נחקרים בהתפתחות המוקדמת של השתלת איון, הוכיח סביבה מוצלחת איונים^{10,11,12,13, 14}. אולם, איון intraportal אינפוזיה הפך תאריך היעד ברירה קליניים באופן חלקי הפשטות היחסית של ההליך, מוקדם הצלחה של בעל חיים מודלים⁶. גם, בין השאר, התשלילים קשורה עם זה באתר, לאבדן מסיבי במיוחד איון מוקדם, היו פחות מובנים ופחות המגביל בימים הראשונים של השתלת איון ניסיוני כשדה התבגר. עדכנית יותר ראיות משכנעות המציינת כי איון קרישה תוך-כלית אינפוזיה רחוק אידיאלי, omentum יש מחדש המתעוררים כאתר ערך פוטנציאלי עבור השתלת תא.

Omentum (בדמות נרתיק עם פגיעה) מציע יתרונות יחסיים כבד^15,ה-¹⁶. זה vascularized היטב וניתן להגיע אליו בקלות. זה מאפשר אחזור שתל (במקרה הצורך) ו/או ביופסיה. תקופת איסכמי שחוו את איונים מופחתת בהשוואה הכבד, omentum יכולה לקבל יחסית. גושים גדולים איון אשר אינו אפשרי intraportally, שם עלייה בלחץ פורטל יכול לגרום לסיבוכים.

דגם העכבר syngeneic של השתלת שימש את הפרוטוקול נבדק במחקר, העסקת עכברים זכרים C57BL/6 בין 6-8 שבועות עם משקל הגוף של 20 – 25 ג'י איון נמענים היו שניתנו סוכרת עם זריקה אחת של streptozotocin עם מנה של 250 ip מ"ג/ק"ג. תנאי הגיוס של סוכרת יכול להיחשב מוצלח אם רמת הסוכר בדם של העכבר גדול מ- 24 mmol/L 48 שעות לאחר ההזרקה ונותרה שמעל רמה זו למשך תקופה מינימלית של 5 ימים.

Syngeneic איים קטנים היו מבודדים מן הלבלב של תורמים מתאימים-גיל בעקבות שיטות שפורסמו בעבר עם מספר שינויים. בקצרה, collagenase היה מוזרק לתוך כיס המרה במקום המרה. זה נעשה כמו שיפור כדי להקל על הקלות של הזרקה. Collagenase אינפוזיה היה ואחריו דגירה, הפרעה רקמות, ההפרדה הדרגתיות צפיפות יד קטיף כדי לקבל איונים טהור. איונים היו תרבותי בין לילה בינוני CMRL-1066 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ב- T175 מבחנות ב 37 מעלות צלזיוס, מתחת לגיל 95% אוויר - 5% CO₂ לפני ההשתלה.

Protocol

כל העכברים השתמשו במחקר זה, התקבלו את רפואי חיה מרכז של גואנג-דונג. השימוש בבעלי חיים אושרה על ידי החולים אתיקה סקירה הוועדה של שנג'ן השני לאנשים בבית, בהתאם לעקרונות של רווחת בעלי חיים.

1. השתלת איון כדי Omentum

הערה: פרוטוקול זה דורש 2 אנשים להשיג.

1. מצרף את החומרים כירורגי המפורטים בטבלה 1. להכין aseptic שדה באזור כירורגי סטרילי חומרים כגון וילונות חד פעמי ולקיים תנאים aseptic במהלך הניתוח. לעקר כל כלי כירורגי. ללבוש שמלות סטרילי.
2. לבחור את איונים באמצעות טיפ פיפטה 200 µL תחת stereomicroscope. כל עכבר מקבל 450-500 איון שווי ערך (IEQ) לכל tansplant. עבור כל בעל חיים, מקום מספיק איונים להשתלת יחיד לתוך צינור snap-העליון mL 1.5 סטרילי עם µL 100 CMRL-1066 בינוני.
   הערה: איים קטנים יכולים להיות מבודד ביום של השתלת, אבל עדיף לבודד אותם יום לפני כדי לאפשר שחזור עבור תהליך בידוד.
3. לשמור את צינורות snap-העליון עם איים על הקרח עד לבצע השתלה.
4. להפשיר את הידרוג מטריקס קרום המרתף ולשמור אותו על קרח לאחר הסרתו מהמקפיא-20 ° C. הידרוג נוזלי ב 4 ° C ל 10 ° C, עפור בטמפרטורות גבוהות יותר.
5. שוקל ולתייג כל בעכברים סוכרתיים הנמען. הזרקת סודיום פנטוברביטל 60 מ"ג/ק"ג intraperitoneally. הבדיקה העומק של הרדמה על ידי מתן קמצוץ הבוהן. אתן סודיום פנטוברביטל של 10 מ"ג/ק"ג נוספים אם החיה מגיב בלחץ. אם אין לסגת רפלקס, הרמה של הרדמה היא הנכונה לניתוח.
6. ספוגית באתר כירורגית על הבטן באמצעות אתנול 70%. לגלח את השיער מן האתר עם להב razer, לחטא את האזור עם Iodophor. לנהל הוטרינר משחה לעיניים למניעת יובש תחת הרדמה.
7. להשתמש המספריים אופטלמולוגיות לפתיחת הבטן לאורך קו האמצע הבטן עם חתך של 4 עד 5 ס מ. מהלך המעיים בצד שמאל ולכסות עם גזה ספוגים מלוחים כדי למנוע התייבשות יתר במהלך ההליך ניתוח.
8. השתמש ספוגיות כותנה מלאה לחשוף את שדה הראיה של הקיבה ולאתר את omentum (ממוקם מתחת לבטן). השתמש שני זוג מלקחיים בסדר כדי distend את omentum. לטפל כדי למנוע נזק מן לקרוע.
9. הידרוג לחלוטין מופשר הוא בשלב זה. ספין ברכבת התחתית עם איים ב-30 s-200 x g ולהסיר תגובת שיקוע. האחות µL 50 של הידרוג, להוסיף את הצינור המכיל את איים קטנים, resuspend את התערובת בעדינות הימנעות היווצרות בועות. לשמור על הצינורות על קרח במהלך ההליך.
10. השתמש שני זוג מלקחיים כדי לאסוף את הקצוות של omentum ולגדל אותו כדי ליצור חריץ בין קיר הקיבה והמעיים שיכול להכיל אמצעי אחסון קטן של נוזל עם השתל איון בעדינות.
11. תן האדם השני לסייע בהליך, וארוקן את התערובת איון resuspended-הידרוג (את כל התוכן של הצינור) עם טיפ פיפטה 200 µL, לספק את התוכן לתוך החריץ.
12. ודא כי התערובת היא ממוצבת היטב לתוך החריץ מאת בעדינות הגבהה או הנמכה קצות omentum. מלאה מיצוב של התערובת בתוך 3 דקות לפני הידרוג עפור כאפקט של טמפרטורת הגוף. לאחר הידרוג מגדיר, מקפלים את omentum כדי לכסות את השתל.
    הערה: omentum דוגלים לדופן הקיבה שמסביב כמו הידרוג עפור.
13. לאחר הידרוג הוא לחלוטין פני השטח למוצק, להשתמש ספוגיות כותנה כדי למקם מחדש את המעיים בחזרה לתוך חלל הבטן, מטפל לא לגעת האתר של השתלת.
14. הוסף 20 µL של צפלוספורין (5 ~ 10 מ ג) לתוך חלל הבטן כדי למנוע זיהום, לאחר מכן להשתמש בתפר 4-0 כדי לסגור את הבטן.
15. לחזור העכבר בכלוב, חזור על כל השלבים עבור כל נמען העכבר. לחמם את העכברים ונטר חזותית עד שהם לחלוטין ישובו להכרה מספקת כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות. שמור את העכברים נפרדת מבעלי חיים אחרים עד הם התאוששו לגמרי.
16. מזריקים µL 50 של צפאזולין נתרן (0.05 mg/mL) כל יום במשך שבוע כמו טיפול מונע לאחר הניתוח. ניהול Bupivicaine + הבופרנורפין, קרי להחיל 1-3 טיפות של 0.25% Bupivicaine באתר החתך topically לפני השמה של הפצע קליפים. ניהול Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) דרך המסלול בקרום הבטן (IP).
17. למדוד ללא צום רמת גלוקוז בדם של דגימת דם וריד הזנב באמצעות מד הסוכר בדם פעם ביום לאחר ההשתלה. כאשר משתילים כדי omentum, השתל איון ייתכן יש פונקציה עיכוב, לא להגיע אל רמת גלוקוז דם נורמלי לחלוטין במשך 2-3 שבועות.
18. כלים, להסיר השתל עם פגיעה מהעכבר בסוף הניסוי בעקבות השתלת. לתקן את הרקמות לפי הפרוטוקולים היסטולוגית. השתל יכול להיות מנותח ללימודי immunostaining או immunofluorescence.

2. שיטה חלופית עבור השתלת כדי Omentum

הערה: יכול להיות מוחלף של הידרוג פיברין חלופי-תרומבין המשמש בטמפרטורת החדר עבור הידרוג מטריקס קרום המרתף. זה מורכב של רכיבים 2, פיברין סילר לאיטום חלבון פתרון (50 תרומבין U/mL ו- 10 מ"ג/מ"ל פיברינוגן). כאשר המרכיבים מעורבבים, הם יוצרים קריש המחזיק ע במקום.

1. השתמש את הידרוג פיברין-thombin מתחם בטמפרטורת החדר. כמו צעד 1.2, יקבלו כל עכבר מקבילות איון 450-500 (IEQ) לכל השתלת. למקם את איונים צינור snap-העליון mL 1.5 סטרילי עם µL 100 CMRL-1066 בינוני. מיד לפני ההשתלה, וארוקן את איים קטנים לתוך צינורות סטרילי PE50 באורך של 10 ס מ, צנטריפוגה בעדינות (30 s-200 גרם x) כדי ליצור גלולה רופף.
2. הכינו את החיה כאמור לעיל (1.5 צעדים-1.8) עם omentum התפזרו. מערבבים את רכיבי הידרוג (µL/כל 10) ומניחים על omentum. (דמות תלת-ממד)
3. מיד לגרש את איים מתוך הצנרת על גבי הידרוג. הידרוג יוצר קריש דם מסביב איים קטנים. (איור 3E)
4. מקפלים את omentum של הידרוג ושל איונים כדי ליצור כיס. (איור 3F) המשך הצעדים 1.13 כדי 1.18.

תוצאות

המדינה post-digestive של הלבלב מוצג איור 1A. איונים מטוהרים מוצגים איור 1B. Dithizone מכתים ובדיקות הכדאיות של איים מוצגים באיור2. הצעדים העיקריים של השתלת איון כדי omentum מוצגים באיור3. רמות הגלוקוז בדם של הנמענים לאחר ההש...

Discussion

השתלת איון אל הכבד דרך וריד שער הכבד הוא הכי נפוץ בשיטה של השתלת איון בבני אדם, אבל עדיין ישנם חששות בטיחות ויעילות כמו וריד שער הכבד פקקת והכבד steatosis¹⁷. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי omentum עשוי להיות אלטרנטיבה מתאימה הכבד, אבל יותר מחקר צריך להתבצע לפני תרגום קלינית¹²

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5 inch (12-13 cm) Scissors	RWD Life Science	S12030-11
Fine Forceps	RWD Life Science	F11010-13
Small wound clips	RWD Life Science	R33003-01
Acutenaculum	RWD Life Science	F31044-13
2 pair tissue forceps	RWD Life Science	F13023-10
4-0 Suture with needle	Chenghe, China	17094
200 μL Pipette and tips	Gilson	PN11
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
razor blade	Philips	HC1099/15
Material and animals
Pentobarbital Sodium	Sigmaaldrich.com	P3761	For anesthesia
Hydrogel	bdbiosciences.com	356234	Basement Membrane Matrix
Fibrin-Thrombin Hydrogel	Baxter.com	1501250	Components clot when mixed
70% Ethanol	Yingniu medical, Anhui, China	23170608
Iodophor	Lierkang medical technology, Shangdong, China	170521
Normal saline	Baxter.com	2B1324
Cephalosporin	Lukang medical, Shangdong, China	150303
Cefazolin	Baxter.com	2G3508
lubricant eye ointment	Major Pharmaceuticals	203964
streptozotocin	Sigmaaldrich.com	S0130
collagenase Type V	Sigmaaldrich.com	C9262
CMRL-1066 media	celltrans, Wenzhou, China	X018D1
histopaque	Sigmaaldrich.com	10771	density gradient
PE50 tubing	Braintreesci.com	PE50 100 FT	Polyethylene .023" x .038
Calcein AM	Sigmaaldrich.com	C1359
Propidium iodide	Sigmaaldrich.com	P4864
optimal cutting temperature compound (OCT)	Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL	4583	embedding medium
insulin antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	8138S
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	14166S
eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	D1306
C57Bl/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province	/
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
T175 flasks	Falcon	353112
1.5 mL Snap-top tubes	Axygen	MCT-150-C