Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Resumo

É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.

Resumo

Transplante de ilhotas tem sido proposto para ser um potencial tratamento para o diabetes tipo 1. Recentes evidências indicam que a infusão intravascular Ilhéu está longe do ideal e, portanto, o omento é re-emergente como um local potencialmente valioso para transplante de ilhotas. Esse experimento requer o isolamento de ilhotas de alta qualidade e a implantação dos ilhéus aos destinatários diabéticos. Transplante para o omento requer etapas cirúrgicas que podem ser melhor demonstradas visualmente. Aqui, as etapas detalhadas para este procedimento são apresentadas. Dois métodos de misturar as ilhotas isoladas com hidrogel antes de colocar a mistura dentro da bolsa omental de ratos diabéticos são descritos aqui. Hidrogel diferentes é utilizados para as diferentes condições. Níveis de glicose de destinatários de rato diabético de ilhotas syngeneic no omento foram monitorados por até 35 dias. Alguns animais foram sacrificados após 14 dias para realizar a análise imuno-histoquímico. Esta abordagem pré-clínico de transplante pode ser usada como dados preliminares que antecederam a tradução para transplante clínico.

Introdução

De acordo com a Federação Internacional de Diabetes (IDF), o diabetes mellitus afeta atualmente 382 milhões de pessoas, com um aumento previsto de 592 milhões de pessoas por 2035¹. Em ambos os transplante alogênico e xenogénica ilhéu, terapia imunossupressora sistêmica é necessária. Sem imunossupressão, imune a rejeição é das principais causas de perda de enxerto². Há também um problema significativo de perda de ilhéu transplantado devido o sangue instantânea mediada por reação inflamatória (IBMIR)^3,4. No entanto, mesmo na ausência de uma resposta imune, tal como em syngeneic ou modelos de autotransplante, células das ilhotas transplantadas para o fígado através da veia porta são perdidas devido à inflamação e/ou a condições ambientais desfavoráveis, tais como sangue pobre fornecer com oxigenação reduzida e/ou nutrientes^5,6. Como resultado, para assegurar a função metabólica a longo prazo, os números mais altos da ilha são necessários para compensar a perda de célula inicial que reduz a enxertia⁷.

Na tentativa de otimizar a enxertia ilhéu, vários sítios anatômicos alternativos têm sido investigados experimentalmente bem como clinicamente, com promissor, ainda não definitiva resulta⁸. Considerando que alguns dos sites alternativos oferecem acesso fácil e seguro (ex., pele, cápsula renal, submucosa gástrica e câmara anterior do olho) ou uma superfície mais ampla para maiores massas ilhéu (EG., cavidade peritoneal), sobrevivência e fisiológica performance metabólica dos ilhéus transplantados ainda são limitado e permanecem uma preocupação⁹. A busca de um local mais apropriado para enxertia Ilhéu está em curso.

O omento estava entre os muitos sites anatômicos que foram investigados no desenvolvimento precoce do transplante de ilhotas e provou ser um ambiente bem sucedido para Ilhéus^{10,11,12,13, 14}. No entanto, infusão intraportal ilhota tornou-se o clínico escolha devido em parte para a relativa simplicidade do procedimento e⁶modelos de sucesso precoce no animal. Também, em parte, os negativos associados com este site, particularmente maciça perda precoce do Ilhéu, eram menos compreendido e menos a restrição nos primeiros dias do transplante de ilhotas experimental como o campo amadureceu. Com as mais recentes evidências indicando que a infusão intravascular Ilhéu está longe do ideal, o omento é re-emergente como um local potencialmente valioso para transplante de células.

O omento (sob a forma de uma bolsa omental) oferece vantagens relativas sobre o fígado^15,16. É facilmente acessível e bem vascularizado. Permite a recuperação do enxerto (se necessário) e/ou biópsia. O período isquêmico vivido por Ilhéus é reduzido em comparação com o fígado, e o omento pode aceitar relativamente massas ilhéu grande, que não é possível intraportally, onde um aumento da pressão portal podem causar complicações.

Um modelo de mouse syngeneic de transplante foi usado no protocolo testado no estudo, empregando camundongos C57BL/6 do sexo masculino entre 6-8 semanas de idade com um peso corporal de 20 – 25 destinatários do Ilhéu de g. foram renderizados diabéticos com uma única injeção de estreptozotocina com uma dose de 250 mg/kg ip. A indução do diabetes pode ser considerada bem sucedida se o nível de glicose do sangue do rato é maior que 24 mmol/L 48 h após a injeção e permanece acima desse nível por um período mínimo de 5 dias.

Syngeneic ilhéus foram isoladas a partir do pâncreas de doadores de idade-combinadas seguindo métodos publicados anteriormente, com algumas modificações. Em breve, a colagenase foi injetado a vesícula em vez do ducto biliar. Isso foi feito como uma melhoria para facilitar a facilidade de injeção. Infusão de colagenase foi seguido de incubação, rompimento de tecido, separação de gradiente de densidade e de mão-colheita para obter puras ilhotas. Ilhéus foram cultivados durante a noite em CMRL-1066 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) em balões T175 a 37 ° C, abaixo dos 95% ar - 5% CO₂ antes do transplante.

Protocolo

Todos os mouses utilizados neste estudo foram obtidos a partir da centro médico Animal de Guangdong província. A utilização de animais foi aprovada pelo Hospital de ética revisão Comissão de Shenzhen segundo do povo, em conformidade com os princípios de bem-estar animal.

1. ilhéu transplante para o omento

Nota: Este protocolo requer 2 pessoas realizar.

1. Monte o material cirúrgico, que está listado na tabela 1. Preparar o campo asséptico na área cirúrgica com materiais estéreis, como cortinas e descartáveis e manter condições assépticas durante cirurgia. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos. Use vestidos estéril.
2. Escolha os ilhéus usando uma ponta de pipeta 200 µ l sob o microscópio. Cada rato receberá 450-500 ilhéu equivalente (IEQ) por transplante. Para cada animal, coloque bastante Ilhéus para um único transplante em um tubo de pressão-top estéril 1,5 mL com 100 µ l de meio CMRL-1066.
   Nota: Ilhéus podem ser isoladas no dia do transplante, mas é melhor para isolá-los um dia antes para permitir a recuperação para o processo de isolamento.
3. Manter os tubos de pressão-top com ilhotas no gelo até que esteja pronto para o transplante.
4. Descongelar o hidrogel de matriz da membrana basal e mantê-lo no gelo depois de removê-lo do congelador a-20 ° C. O hidrogel é líquido a 4 ° C a 10 ° C e solidifica a temperaturas mais altas.
5. Pesar e etiquetar todos os mouses destinatários diabéticos. 60 mg/kg pentobarbital de sódio injete intraperitonealmente. Teste a profundidade da anestesia através da administração de uma pitada de dedo do pé. Dar um adicional de 10 mg/kg pentobarbital de sódio, se o animal reage para o aperto. Se não houver nenhum retirar o reflexo, o nível da anestesia é correto para a cirurgia.
6. Esfregue o local cirúrgico no abdômen usando etanol a 70%. Raspar o cabelo do site com uma lâmina de razer e desinfetar a área com Iodofor. Administre o vet pomada para os olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
7. Utilizar a tesoura oftalmológica para abrir o abdômen ao longo da linha média do abdômen com uma incisão de 4 a 5 cm. movimento dos intestinos para o lado esquerdo e cobrir com gaze embebida salina para prevenir a desidratação excessiva durante o procedimento de cirurgia.
8. Use cotonetes de algodão totalmente expor o campo visual do estômago e localize o omento (localizado abaixo do estômago). Use dois pares de pinças bem para distender o omento. Tome cuidado para evitar danos de destruírem.
9. O hidrogel é completamente descongelado neste ponto. Girar o tubo com os ilhéus por 30 s em 200 x g e remover o sobrenadante. Aspirar a 50 µ l de hidrogel, adicioná-lo ao tubo contendo os ilhéus e ressuspender a mistura suavemente, evitando a formação de bolhas. Manter os tubos em gelo durante o procedimento.
10. Use dois pares de pinças para pegar as bordas do omento e delicadamente levantá-lo para formar um sulco entre a parede gástrica e intestinos que podem acomodar um pequeno volume de líquido com o enxerto de ilhéu.
11. Deixe a segunda pessoa ajudar no procedimento e aspirar a mistura de ressuspensão ilhéu-hidrogel (todo o conteúdo do tubo) com uma ponta de pipeta de 200 µ l, entregar o conteúdo na ranhura.
12. Certifique-se de que a mistura está bem posicionada no sulco suavemente, aumentando ou diminuindo as bordas do omento. Completa de posicionamento da mistura dentro de 3 min antes o hidrogel se solidifica como um efeito da temperatura do corpo. Depois define o hidrogel, dobre o omento para cobrir o enxerto.
    Nota: O omento irá aderir à parede gástrica circundante como o hidrogel solidifica.
13. Depois que o hidrogel é completamente solidificado, use cotonetes para reposicionar os intestinos volta na cavidade abdominal, tomando cuidado para não tocar o site de transplante.
14. Adicionar 20 µ l de cefalosporina (5 ~ 10 mg) na cavidade abdominal, para prevenir a infecção, em seguida, use 4-0 sutura para fechar o abdome.
15. Retorne o mouse para sua gaiola e repetir todos os passos para cada destinatário de rato. Manter os ratos quentes e monitorar visualmente até totalmente recobra a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Manter os ratos separado dos outros animais até que eles se recuperaram totalmente.
16. Injete 50 µ l de sódio cefazolina (0,05 mg/mL) a cada dia por uma semana como profilaxia pós-operatório. Administrar bupivacaina + buprenorfina, ou seja, aplicar 1-3 gotas de 0.25% bupivacaina no local da incisão topicamente antes da colocação de clipes de ferida. Administrar Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) via via intraperitoneal (IP).
17. Medir o nível de glicose no sangue não-jejum de uma amostra de sangue da cauda-veia usando um medidor de glicose de sangue uma vez por dia após o transplante. Ao transplantar para o omento, o enxerto de ilhéu pode ter uma função retardada e não alcançar um nível de glicose no sangue completamente normal para 2-3 semanas.
18. Para histologia, remova o enxerto omental do mouse ao final do experimento após o transplante. Fixe o tecido de acordo com os protocolos histológicos. O enxerto pode ser analisado para estudos de imunocoloração ou imunofluorescência.

2. título subsidiário para transplante para o omento

Nota: Um hidrogel de fibrina-trombina alternativo que é usado em temperatura ambiente pode ser substituído para o hidrogel de matriz de membrana basal. Consiste em 2 componentes, uma solução de proteína de selante de fibrina (50 U/mL trombina e fibrinogênio de 10 mg/mL). Quando os componentes são misturados, formam um coágulo que prende as ilhotas no lugar.

1. Use o hidrogel de fibrina-thombin composto à temperatura ambiente. Como na etapa 1.2, cada rato receberá equivalentes do Ilhéu de 450-500 (IEQ) por transplante. Coloca os ilhéus num tubo estéril 1,5 mL agarrar-parte superior com 100 µ l de meio CMRL-1066. Imediatamente antes do transplante, Aspire os ilhéus para um tubo estéril de PE50 para um comprimento de 10 cm e centrifugar suavemente (30 s a 200 x g) para formar uma bola solta.
2. Prepare o animal como acima referido (etapas 1.5-1.8) com o omento espalhar-se. Misturar os componentes de hidrogel (10 µ l/cada) e coloque sobre o omento. (Figura 3D)
3. Imediatamente expulse os ilhéus da tubagem para o hidrogel. O hidrogel forma um coágulo em torno dos ilhéus. (Figura 3E)
4. Dobre o omento o hidrogel e ilhotas para formar uma bolsa. (Figura 3F) Continue com passos 1.13 para 1.18.

Resultados

Post-digestive estado do pâncreas é mostrado na figura 1A. Purificada ilhotas são mostradas na figura 1B. Ditizona manchando e teste de viabilidade dos ilhéus são mostrados na Figura 2. As principais etapas da transplante de ilhotas para o omento são mostradas na Figura 3. Os níveis de glicose do sangue dos destinatários após transplante omental são mostrados n...

Discussão

Transplante de ilhotas no fígado através da veia portal é o método mais usado de transplante de ilhotas em seres humanos, mas ainda existem preocupações de segurança e eficiência como a veia porta-trombose e fígado esteatose¹⁷. Estudos recentes mostram que o omento pode ser uma alternativa adequada para o fígado, mas mais pesquisa precisa ser realizada antes da tradução clínica^{12,14,18,<...}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5 inch (12-13 cm) Scissors	RWD Life Science	S12030-11
Fine Forceps	RWD Life Science	F11010-13
Small wound clips	RWD Life Science	R33003-01
Acutenaculum	RWD Life Science	F31044-13
2 pair tissue forceps	RWD Life Science	F13023-10
4-0 Suture with needle	Chenghe, China	17094
200 μL Pipette and tips	Gilson	PN11
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
razor blade	Philips	HC1099/15
Material and animals
Pentobarbital Sodium	Sigmaaldrich.com	P3761	For anesthesia
Hydrogel	bdbiosciences.com	356234	Basement Membrane Matrix
Fibrin-Thrombin Hydrogel	Baxter.com	1501250	Components clot when mixed
70% Ethanol	Yingniu medical, Anhui, China	23170608
Iodophor	Lierkang medical technology, Shangdong, China	170521
Normal saline	Baxter.com	2B1324
Cephalosporin	Lukang medical, Shangdong, China	150303
Cefazolin	Baxter.com	2G3508
lubricant eye ointment	Major Pharmaceuticals	203964
streptozotocin	Sigmaaldrich.com	S0130
collagenase Type V	Sigmaaldrich.com	C9262
CMRL-1066 media	celltrans, Wenzhou, China	X018D1
histopaque	Sigmaaldrich.com	10771	density gradient
PE50 tubing	Braintreesci.com	PE50 100 FT	Polyethylene .023" x .038
Calcein AM	Sigmaaldrich.com	C1359
Propidium iodide	Sigmaaldrich.com	P4864
optimal cutting temperature compound (OCT)	Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL	4583	embedding medium
insulin antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	8138S
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	14166S
eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	D1306
C57Bl/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province	/
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
T175 flasks	Falcon	353112
1.5 mL Snap-top tubes	Axygen	MCT-150-C