Une méthode pour la Transplantation d’îlots à l’épiploon dans la souris

Résumé

On introduit une méthode pour l’épiploïques transplantation d’îlots dans une souris. Les îlots sont mélangés avec hydrogel et le mélange est placé dans la pochette omentaux de souris diabétique. Ensuite, la glycémie est contrôlée et l’analyse immuno-histochimique est réalisée.

Résumé

La transplantation d’îlots a été proposée pour être un traitement potentiel pour le diabète de type 1. Des preuves convaincantes récente indiquent qu’îlot intravasculaire infusion est loin d’être idéale et par conséquent, l’épiploon est ré-émergent comme un site potentiellement intéressants pour la transplantation d’îlots. Cette expérience nécessite l’isolement des îlots de haute qualité et l’implantation des îlots aux personnes diabétiques. Transplantation à l’épiploon requiert des étapes chirurgicales qui peuvent mieux démontrer visuellement. Ici, les étapes détaillées pour cette procédure sont présentés. Deux méthodes de mélange des îlots isolés avec hydrogel avant de placer le mélange dans la poche épiploïques des souris diabétiques sont décrites ici. Hydrogels différents sont utilisés pour les différentes conditions. Le taux de glucose sanguin des récipiendaires de souris diabétiques des îlots syngéniques dans l’épiploon ont été suivi pendant 35 jours. Certains animaux ont été sacrifiés après 14 jours pour réaliser une analyse immunohistochimique. Cette approche de transplantation préclinique peut servir de données préliminaires menant à la traduction de transplantation clinique.

Introduction

Selon la Fédération internationale du diabète (FID), mellitus de diabète touche actuellement 382 millions de personnes, avec une augmentation prévue à 592 millions de personnes par 2035¹. Dans les deux greffes d’îlots xénogéniques et allogéniques, traitement immunosuppresseur systémique est nécessaire. Sans immunosuppression, rejet immunitaire est une cause majeure de perte de greffon². Il y a aussi un grave problème de perte des îlots transplantés en raison du sang immédiate médiée par réaction inflammatoire (IBMIR)^3,4. Cependant, même en l’absence d’une réponse immunitaire comme syngéniques ou modèles auto-transplantation, des cellules des îlots transplantés dans le foie via la veine porte sont perdues en raison d’une inflammation et/ou à des conditions environnementales défavorables, tels que le mauvais sang d’alimentation avec oxygénation réduite et/ou nutriments^5,6. Ainsi, afin d’assurer des fonctions métaboliques à long terme, îlot des nombres plus élevés sont nécessaires pour compenser la perte de la cellule initiale qui réduit la prise de greffe⁷.

Dans le but d’optimiser la greffe d’îlots pancréatiques, plusieurs sites anatomiques alternatifs ont été étudiées expérimentalement ainsi que sur le plan clinique, avec prometteur, encore non définitif résultats⁸. Considérant que certains des sites alternatifs offrent un accès facile et sûr (par exemple., la peau, capsule rénale, sous-muqueuse gastrique et la chambre antérieure de le œil) ou une surface plus large pour les plus grandes masses d’îlot (e.g., cavité péritonéale), survie et physiologiques rendement métabolique des îlots transplantés sont encore limitée et demeurent une préoccupation⁹. La recherche d’un site plus approprié pour la greffe d’îlots pancréatiques est en cours.

L’épiploon était parmi les nombreux sites anatomiques qui ont été étudiés dans le développement de la transplantation d’îlots et s’est avérés un environnement fructueux pour les îlots^{10,11,12,13, 14}. Cependant, perfusion intraporte îlot est devenu la raison choice clinique en partie à la relative simplicité de la procédure, et le succès rapide des animaux modèles⁶. Aussi, en partie, les négatifs associés avec ce site, perte d’îlot précoce particulièrement massive, étaient moins connus et moins contraignante dans les premiers jours de la transplantation d’îlots expérimentale que le champ est arrivée à échéance. Avec les plus récentes preuves convaincantes indiquant que la perfusion intravasculaire îlot est loin d’être idéale, l’épiploon est ré-émergent comme un site potentiellement intéressants pour la transplantation de cellules.

L’épiploon (sous la forme d’une poche épiploïques) offre des avantages relatifs sur le foie^15,16. Elle est très vascularisée et facilement accessible. Il permet la récupération de la prothèse (si nécessaire) et/ou une biopsie. La période ischémique vécue par les îlots est réduite par rapport au foie, et l’épiploon peut accepter relativement masses grand îlot qui n’est pas possible au, où une augmentation de la pression portale peuvent entraîner des complications.

Un modèle de souris syngénique des greffes a été utilisé dans le protocole testé dans l’étude, qui emploient les souris C57BL/6 mâles entre 6 à 8 semaines avec un poids de 20 – 25 bénéficiaires îlot g. ont été rendus diabétiques avec une seule injection de streptozotocine avec une dose de 250 mg/kg ip. L’induction du diabète peut être considéré comme réussie si le niveau de glucose sanguin de la souris est supérieur à 24 mmol/L 48 h après l’injection et se maintient au-dessus de ce niveau pendant au moins 5 jours.

Syngéniques îlots ont été isolés par le pancréas des donneurs appariés selon l’âge suivant des méthodes publiées antérieurement avec quelques modifications. En bref, la collagénase a été injecté dans la vésicule biliaire au lieu de la voie biliaire. Cela a été fait comme une amélioration pour faciliter l’injection. Infusion de collagénase a été suivie de l’incubation, perturbation du tissu, séparation gradient de densité et de cueillette à la main pour obtenir des îlots pures. Îlots ont été cultivées pendant la nuit dans un milieu CMRL-1066 additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) dans des flacons de T175 à 37 ° C, moins 95 % de l’air - 5 % CO₂ avant la transplantation.

Protocole

Toutes les souris utilisées dans cette étude proviennent de la Province médicale Animal Center du Guangdong. L’utilisation des animaux a été approuvée par hôpital l’éthique examen Comité de Shenzhen deuxième populaire, conformément aux principes du bien-être animal.

1. Transplantation d’îlots pancréatiques de l’épiploon

Remarque : Ce protocole nécessite 2 personnes à accomplir.

1. Assembler des matériaux chirurgicaux qui sont énumérés au tableau 1. Préparer le champ aseptique dans domaine chirurgical stérile matériaux tels que des rideaux et produits jetables et maintenir des conditions d’asepsie tout au long de la chirurgie. Stériliser tous les instruments chirurgicaux. Porter des robes de chambre stériles.
2. Choisissez les îlots à l’aide d’une pointe de pipette 200 µL sous le stéréomicroscope. Chaque souris recevra 450 – 500 îlots équivalents (IEQ) par tansplant. Pour chaque animal, placer suffisamment îlots pour une greffe unique dans un tube stérile de 1,5 mL à casser-dessus avec 100 µL de milieu CMRL-1066.
   Remarque : Les îlots peuvent être isolés sur le jour de la transplantation, mais il est préférable d’isoler la veille pour permettre la récupération pour le processus d’isolement.
3. Garder les lampes casser-dessus avec îlots sur la glace jusqu’au moment de la transplantation.
4. Décongeler la membrane basale matrice hydrogel et gardez-le sur la glace après son retrait du congélateur-20 ° C. L’hydrogel est liquide à 4 ° C à 10 ° C et se solidifie à des températures plus élevées.
5. Peser et marquer toutes les souris diabétiques de destinataire. Injecter le pentobarbital sodique de 60 mg/kg par voie intrapéritonéale. Test le la profondeur de l’anesthésie par l’administration d’un pincement de l’orteil. Donner un pentobarbital sodique de 10 mg/kg supplémentaires si l’animal réagit à la pincée. Si il n’y a aucun retrait réflexe, le niveau de l’anesthésie est correct pour la chirurgie.
6. Tamponner le site chirurgical sur l’abdomen à l’aide d’éthanol à 70 %. Se raser les cheveux sur le site avec une lame de razer et désinfecter la zone avec iodophore. Administrer vétérinaire onguent pour les yeux à prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
7. Utiliser les ciseaux ophtalmiques pour ouvrir l’abdomen le long de la médiane de l’abdomen par une incision de 4 à 5 cm. déplacer les intestins vers le côté gauche et couvrir avec une gaze imbibée saline pour prévenir la déshydratation excessive au cours de la procédure de chirurgie.
8. Utiliser des cotons-tiges pour exposer le champ visuel de l’estomac puis Localisez l’épiploon (situé sous l’estomac). Utiliser deux paires de pinces fines à distendre l’épiploon. Prendre soin d’éviter d’endommager de déchirement.
9. L’hydrogel est complètement décongelée à ce stade. Tourner le tube avec les îlots de 30 s à 200 x g et enlever le surnageant. Aspirer 50 µL d’hydrogel, ajoutez-le dans le tube contenant les îlots et remettre en suspension le mélange doucement en évitant la formation de bulles. Garder les tubes sur la glace lors de la procédure.
10. Utiliser deux paires de pinces pour ramasser les bords de l’épiploon et soulevez doucement pour former un sillon entre la paroi gastrique et l’intestin qui peut accueillir un petit volume de liquide avec la greffe d’îlots pancréatiques.
11. Laissez la seconde personne assister dans la procédure et aspirer le mélange resuspendues îlot-hydrogel (tout le contenu du tube) avec une pointe de pipette de 200 µL, délivrer le contenu dans la rainure.
12. Veiller à ce que le mélange est bien positionné dans la rainure en élevant ou en abaissant les bords de l’épiploon doucement. Positionnement du mélange moins de 3 min avant l’hydrogel complète se solidifie sous l’effet de la température corporelle. Après que l’hydrogel définit, plier l’épiploon pour couvrir la prothèse.
    NOTE : l’épiploon va adhérer à la paroi gastrique environnante comme l’hydrogel se solidifie.
13. Après que l’hydrogel est complètement solidifié, utiliser cotons-tiges pour repositionner les intestins dans la cavité abdominale, en prenant soin de ne pas pour toucher le site de la transplantation.
14. Ajouter 20 µL de céphalosporine (5 ~ 10 mg) dans la cavité abdominale pour prévenir l’infection, puis utilisez la suture 4-0 pour fermer l’abdomen.
15. Retourner la souris à sa cage et répétez toutes les étapes pour chaque destinataire de la souris. Réchauffer les souris et surveiller visuellement jusqu'à ce qu’ils reprennent pleinement conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Séparer les souris des autres animaux jusqu'à ce qu’ils ont pleinement récupéré.
16. Injecter 50 µL de céfazoline sodique (0,05 mg/mL) chaque jour pendant une semaine en prophylaxie post-opératoire. Administrer Bupivicaine + buprénorphine, c'est-à-dire appliquer 1 à 3 gouttes de 0,25 % Bupivicaine sur le site de l’incision par voie topique avant la pose de clips de la plaie. Administrer Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) par voie intrapéritonéale (IP).
17. Mesurer le niveau de glucose de sang non-jeûne auprès d’un échantillon de sang de la veine caudale à l’aide d’un lecteur de glycémie une fois par jour après la transplantation. En transplantant à l’épiploon, la greffe d’îlots pancréatiques peut avoir une fonction de retardée et n’atteint pas un niveau de glycémie tout à fait normal pendant 2 – 3 semaines.
18. Pour histologie, retirer la prothèse omentaux de la souris à la fin de l’expérience après la transplantation. Fixer le tissu selon les protocoles histologiques. La prothèse peut être analysée pour études immunostaining ou immunofluorescence.

2. autre méthode destinés à la Transplantation de l’épiploon

Remarque : Un hydrogel de fibrine-thrombine alternatif qui est utilisé à la température ambiante peut se substituer à la membrane basale matrice hydrogel. Il se compose de 2 éléments, une solution de protéine de fibrine scellant (50 U/mL thrombine et le fibrinogène de 10 mg/mL). Lorsque les composants sont mélangés, ils forment un caillot qui maintient les îlots en place.

1. Utiliser la fibrine-thrombine hydrogel composé à température ambiante. Comme à l’étape 1.2, chaque souris recevra 450 – 500 îlots d’équivalents (IEQ) par greffe. Placer les îlots dans un tube stérile de 1,5 mL de casser-dessus avec 100 µL de milieu CMRL-1066. Immédiatement avant la transplantation, aspirer les îlots dans un tuyau PE50 stérile pour une longueur de 10 cm et centrifuger doucement (30 s à 200 x g) pour former une boulette de lâche.
2. Préparer l’animal comme indiqué ci-dessus (étapes 1,5-1,8) avec l’épiploon étalé. Mélanger les composants hydrogel (10 µL/chacun) et le placer sur l’épiploon. (Figure 3D)
3. Immédiatement expulser les îlots de la tubulure sur l’hydrogel. L’hydrogel forme un caillot autour des îlots. (Figure 3E)
4. Repliez l’épiploon l’hydrogel et les îlots pour former une pochette. (Figure 3F) Suivez les étapes 1.13 à 1,18.

Résultats

Post-digestive état du pancréas est montré dans la Figure 1 a. Îlots purifiées sont indiquées dans la Figure 1 b. Dithizone coloration et viabilité des îlots sont indiquées à la Figure 2. Les principales étapes de la transplantation d’îlots à l’épiploon sont indiquées à la Figure 3. Le taux de glucose sanguin des destinataires après transplantation ?...

Discussion

Transplantation d’îlots pancréatiques pour le foie via la veine porte est la plus couramment utilisée méthode de transplantation d’îlots pancréatiques chez l’homme, mais il y a encore des préoccupations de l’efficacité et la sécurité comme veine thrombose et foie stéatose¹⁷. Des études récentes montrent que l’épiploon peut être une alternative appropriée pour le foie, mais des efforts supplémentaires de recherche à effectuer avant la traduction clinique

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5 inch (12-13 cm) Scissors	RWD Life Science	S12030-11
Fine Forceps	RWD Life Science	F11010-13
Small wound clips	RWD Life Science	R33003-01
Acutenaculum	RWD Life Science	F31044-13
2 pair tissue forceps	RWD Life Science	F13023-10
4-0 Suture with needle	Chenghe, China	17094
200 μL Pipette and tips	Gilson	PN11
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
razor blade	Philips	HC1099/15
Material and animals
Pentobarbital Sodium	Sigmaaldrich.com	P3761	For anesthesia
Hydrogel	bdbiosciences.com	356234	Basement Membrane Matrix
Fibrin-Thrombin Hydrogel	Baxter.com	1501250	Components clot when mixed
70% Ethanol	Yingniu medical, Anhui, China	23170608
Iodophor	Lierkang medical technology, Shangdong, China	170521
Normal saline	Baxter.com	2B1324
Cephalosporin	Lukang medical, Shangdong, China	150303
Cefazolin	Baxter.com	2G3508
lubricant eye ointment	Major Pharmaceuticals	203964
streptozotocin	Sigmaaldrich.com	S0130
collagenase Type V	Sigmaaldrich.com	C9262
CMRL-1066 media	celltrans, Wenzhou, China	X018D1
histopaque	Sigmaaldrich.com	10771	density gradient
PE50 tubing	Braintreesci.com	PE50 100 FT	Polyethylene .023" x .038
Calcein AM	Sigmaaldrich.com	C1359
Propidium iodide	Sigmaaldrich.com	P4864
optimal cutting temperature compound (OCT)	Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL	4583	embedding medium
insulin antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	8138S
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	14166S
eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	D1306
C57Bl/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province	/
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
T175 flasks	Falcon	353112
1.5 mL Snap-top tubes	Axygen	MCT-150-C