マウスで大網に膵島移植法

要約

大網移植マウスの島のための方法を紹介します。膵島は、ハイドロゲルと混合され、混合物は糖尿病マウスの大網のポーチに配置されます。血糖値を監視し、免疫組織化学的解析を行っています。

要約

膵島移植は、1 型糖尿病の潜在的な治療であると提案されています。最近の説得力のある証拠は、理想的な膵島の血管内注入を示しますので、大網は膵島移植の可能性がある貴重なサイトとして再浮上。この実験では、高品質の膵島の分離と糖尿病の受信者に膵島移植を必要があります。大網への移植には、視覚的によりよく示すことができる手術の手順が必要です。ここでは、このプロシージャの詳細な手順が掲載されています。糖尿病マウスの大網のポーチに混合物を配置する前にゲルと膵島の混合の 2 つのメソッドは以下のとおりです。別のゲルは、さまざまな条件に使用されます。大網の同系の島の受信者を糖尿病マウスの血糖値は 35 日間の監視されました。免疫組織化学的解析を実行する 14 日後は、いくつかの動物が犠牲になった。この前臨床移植アプローチは、臨床移植への翻訳に至るまで予備のデータとして使用できます。

概要

国際糖尿病連合 (IDF) によると、糖尿病は現在、2035¹5 億 9200 万人に投影された増加との 3 億 8200 万人を影響します。両方の同種および異種膵島移植、全身性の免疫抑制療法が必要です。免疫のない免疫拒絶反応は移植の損失の²の主要な原因です。インスタントの血液を介した炎症反応 (IBMIR)^3,4による移植膵島の損失の重大な問題もあります。ただし、同系のような免疫応答の不在でもまたは自動移植モデル、門脈経由で肝臓に移植する膵島細胞が炎症のためおよび/または貧しい人々 の血液などの好ましくない環境条件に失われました。減らされた酸素や栄養素^5,6を供給します。その結果、長期的な代謝機能を確保するために小島が多いほど生着⁷を減らす最初のセル損失を補うために必要です。

膵島の生着を最適化しようとして、いくつかの代替解剖学的サイト実験を行った結果のよう臨床的に有望なまだ決定的でない⁸。簡単かつ安全なアクセスを提供するいくつかの代替サイトに対し (e.g皮膚、腎被膜、胃粘膜、眼の前房内) またはより大きい島の大衆のためのより広い面 (e.g。、腹腔内)、生存および生理。移植膵島の代謝のパフォーマンスはまだ限られている、懸念⁹を維持します。膵島の生着のためのより適切なサイトの検索が進行中です。

大網は膵島移植の早い開発の調査を行い, 島^{10、11,12,13、成功の環境を証明する多くの解剖学的サイト 14}。ただし、膵島の門脈内注入になった臨床選択期限一部プロシージャの相対的なシンプルさと動物の初期の成功モデル⁶。また、一部では、ネガは、これに関連するサイト、特に大規模な早期膵島の損失、フィールドとして実験的膵島移植の初期の頃に以下の理解なり拘束された成熟します。膵島の血管内注入がから遠いことを示す最近の説得力のある証拠と理想的な大網は細胞移植の可能性がある貴重なサイトとして再浮上。

(大網ポーチの形) で大網肝^15,16上の相対的な利点を提供しています。血管に富んだ、簡単にアクセス可能です。(必要に応じて) 移植や生検の検索をことができます。小島によって経験される虚血期間は肝臓に比べて減り、大網が不可能である門脈的、門脈圧の上昇、大きなアイレット大衆は合併症を引き起こすことができる比較的受け入れることができます。

20-25 g. 小島受信者がレンダリングされた 250 の線量とストレプトゾトシンの単回投与で糖尿病の体重と生後 6-8 週間の間 c57bl/6 男性マウスを用いた研究でテストされたプロトコルに使用された移植の同系マウス モデルmg/kg の ip。糖尿病の誘導は成功とマウスの血糖値は注射後 24 ミリ モル/L 48 h を超えています、上位 5 日の最低レベルのまま。

同系の小島は、以下のいくつかの変更以前に発行された方法年齢一致ドナーの膵臓から分離しました。簡単に言えば、コラゲナーゼは胆管ではなく胆嚢に注入されました。これは、注入の容易さへの改善として行われていた。コラゲナーゼ注入された培養、組織破壊、密度勾配分離に続いて、純粋な島を取得する手摘み。小島未満 10% 熱不活化の牛胎児血清 (FBS) T175 37 ° C でフラスコを添加した CMRL 1066 培地で一晩培養移植前に 95% の空気-5% CO₂ 。

プロトコル

本研究で使用されるすべてのマウスは、医療動物センターの広東省から得られました。動物の使用は、倫理審査委員会の深セン第二人民病院、動物福祉の原則によって承認されました。

1 大綱膵島移植

注: このプロトコルには、達成するために 2 人が必要です。

1. 表 1に記載されている手術の材料を組み立てます。カーテンなど使い捨て滅菌材料で外科領域で無菌のフィールドを準備し、手術中の無菌状態を維持します。すべての手術器具を滅菌します。滅菌ガウンを着用します。
2. 個人差で 200 μ L ピペット チップを用いた膵ランゲルハンス島を選ぶ。各マウスは 450-500 膵島と同等 (IEQ) tansplant あたりを受け取ります。それぞれの動物 CMRL 1066 媒体の 100 μ L 滅菌 1.5 mL スナップ トップ チューブに単一移植のため十分な島に配置します。
   注: 小島は移植の日に分離することが、分離プロセスのための回復を許可する前に日を分離するほうがいい。
3. 移植する準備ができるまで氷の上の小島にスナップ トップ チューブを保ちます。
4. 基底膜マトリックス ハイドロゲルを解凍-20 ° C のフリーザーから除去した後氷の上保管してください。ヒドロゲルは 10 ° C への 4 ° C で液体で、高温で塗りつぶされます。
5. 重さし、タグのすべての糖尿病の受信者のマウス。60 mg/kg のペントバルビ タール ナトリウムを腹腔内に挿入します。テスト、つま先ピンチを投与することによって麻酔の深さ。ピンチに動物が反応する場合は、追加の 10 の mg/kg のペントバルビ タール ナトリウムを与えます。ある場合ない麻酔のレベルが手術の正しい反射を撤回します。
6. 70% のエタノールを使用して腹部に手術部位を綿棒します。Razer のブレードを持つサイトから髪を剃るし、Iodophor を使用して領域を消毒します。麻酔中の乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を管理します。
7. 眼科用のハサミを使用して、左側に腸移動 4 に 5 cm。 の切開で腹部正中線に沿って腹部を開く、外科プロシージャの間に過度の脱水症状を防ぐために生理食塩水浸したガーゼでカバーします。
8. 綿棒を使用して、完全に胃の視覚的なフィールドを公開し、大網 (胃の下にある) を探します。大網を広げるために微細鉗子の 2 つのペアを使用します。断裂から損傷を防ぐために注意してください。
9. ヒドロゲルへ完全にこの時点で凍結されています。30 の膵管をスピン x g と削除上清 200 で s。ハイドロゲルの 50 μ L を吸引、膵管内に追加して、優しく泡の形成を回避するミックスを再懸濁します。プロシージャの間に氷の上の管を保ちます。
10. 大網のエッジをピックアップし、胃の壁や腸膵島移植と液体の少量を収容できる間の溝を形成することをゆっくりと上げて鉗子の 2 つのペアを使用します。
11. 2 人目の手順で支援し、200 μ L ピペット チップの再懸濁のアイレット ヒドロゲル混合物 (管の全体の内容) を吸引、溝にコンテンツを配信できます。
12. 混合物もそっと上げたり下げたりして大網のエッジ投稿溝に配置されることを確認します。ヒドロゲルの前に 3 分以内の混合物の位置決め完了体の温度の効果として立体化します。ヒドロゲルを設定すると後、は、移植をカバーする大網を隠します。
    注: ヒドロゲルを確固たるものとして、大網は周囲の胃壁に付着します。
13. ヒドロゲルは完全に固化した後は、移植のサイトに触れないように世話、腹腔内に腸の位置を変更するのに綿棒を使用します。
14. セファロスポリンの 20 μ L を追加 (5 ~ 10 mg) 腹腔内感染を防ぐために、腹部を閉じます 4-0 縫合糸を使用します。
15. そのケージに戻すには、マウス受信者ごとにすべての手順を繰り返します。マウスを暖かく保つ、彼らは完全に胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻すまでを視覚的に監視します。マウスは、彼らが完全に回復するまで他の動物別保管してください。
16. 術後予防として 1 週間毎日セファゾリンナトリウム (0.05 mg/mL) の 50 μ L を注入します。Bupivicaine + ブプレノルフィンを管理、すなわち 0.25% の 1-3 滴を適用傷のクリップの配置前に局所的に切開部位で Bupivicaine。管理 Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) 腹腔内 (IP) 経由。
17. 血糖測定器を使用して尾静脈血液サンプルから非空腹時血糖値を測定、移植後一日一回。大網移植、膵島移植があります遅延機能を持っているし、2-3 週間、完全に正常な血糖値のレベルに達しない。
18. 組織の次の移植実験の終わりにマウスから、大網を削除します。組織のプロトコルに従って組織を修正します。移植は、免疫染色や蛍光の研究分析できます。

2. 大網への移植方法

注意: 基底膜マトリックス ハイドロゲルの室温で使用される代替フィブリン トロンビン ハイドロゲルを代えることができます。2 つのコンポーネント、フィブリン シーラー タンパク質溶液 (50 U/mL トロンビンおよび 10 mg/mL フィブリノゲン) で構成されています。コンポーネントを混在している場所で、島を保持する血栓が形成されます。

1. 室温でフィブリン thombin ハイドロゲル複合を使用します。1.2 の手順のように各マウス移植あたり 450-500 アイレット同等 (IEQ) が表示されます。CMRL 1066 媒体の 100 μ L 滅菌 1.5 mL スナップ トップ チューブに島を配置します。すぐに移植、前に 10 cm の長さのための無菌 PE50 チューブに小島を吸引し、軽く遠心分離機 (30 200 x g で s) 緩やかなペレットを形成します。
2. 広がる大網と (手順 1.5-1.8) 上記のように、動物を準備します。ハイドロゲル成分 (10 μ L/各) をミックスし、大網に置きます。(図 3 D)
3. すぐに、ハイドロゲルにチューブから島を追放します。ヒドロゲルは、独島のまわりの血栓を形成します。(図 3E)
4. 大網を折り重ね、ハイドロゲルと袋を形成する島。(図 3 f)1.13 に 1.18 の手順に進みます。

結果

膵臓の post-digestive の状態は、図 1 aに表示されます。精製小島は図 1 bに示します。ジチゾン染色と小島の生存率試験は、図 2のとおりです。大網に膵島移植の主な手順は、図 3のとおりです。大網移植後受信者の血糖値は、図 4のとおりです。移植後の組織?...

ディスカッション

門脈を介して肝膵島移植はヒトでは、最もよく使われる膵島移植の方法がまだ門脈血栓症と肝脂肪変性¹⁷など効率と安全性の懸念があります。最近の研究では、大網肝臓臨床翻訳^12,14,18,19の前に実施するより多くの研究ニーズに適切な代わりであるかもしれないことを示します。...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5 inch (12-13 cm) Scissors	RWD Life Science	S12030-11
Fine Forceps	RWD Life Science	F11010-13
Small wound clips	RWD Life Science	R33003-01
Acutenaculum	RWD Life Science	F31044-13
2 pair tissue forceps	RWD Life Science	F13023-10
4-0 Suture with needle	Chenghe, China	17094
200 μL Pipette and tips	Gilson	PN11
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
razor blade	Philips	HC1099/15
Material and animals
Pentobarbital Sodium	Sigmaaldrich.com	P3761	For anesthesia
Hydrogel	bdbiosciences.com	356234	Basement Membrane Matrix
Fibrin-Thrombin Hydrogel	Baxter.com	1501250	Components clot when mixed
70% Ethanol	Yingniu medical, Anhui, China	23170608
Iodophor	Lierkang medical technology, Shangdong, China	170521
Normal saline	Baxter.com	2B1324
Cephalosporin	Lukang medical, Shangdong, China	150303
Cefazolin	Baxter.com	2G3508
lubricant eye ointment	Major Pharmaceuticals	203964
streptozotocin	Sigmaaldrich.com	S0130
collagenase Type V	Sigmaaldrich.com	C9262
CMRL-1066 media	celltrans, Wenzhou, China	X018D1
histopaque	Sigmaaldrich.com	10771	density gradient
PE50 tubing	Braintreesci.com	PE50 100 FT	Polyethylene .023" x .038
Calcein AM	Sigmaaldrich.com	C1359
Propidium iodide	Sigmaaldrich.com	P4864
optimal cutting temperature compound (OCT)	Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL	4583	embedding medium
insulin antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	8138S
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	14166S
eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	D1306
C57Bl/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province	/
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
T175 flasks	Falcon	353112
1.5 mL Snap-top tubes	Axygen	MCT-150-C