마우스에 Omentum 작은 섬 이식 하는 방법

요약

마우스에 독도의 omental 이식 하는 방법을 소개 합니다. 격리 된 독도 히드로와 혼합 하 고 혼합 당뇨 마우스의 omental 주머니에 배치 됩니다. 그리고, 혈액 포도 당 감시 면역 조직화 학적인 분석을 수행 합니다.

초록

타입-1 당뇨병에 대 한 잠재적인 치료를 작은 섬 이식 제안 되었습니다. 최근 강력한 증거 나타냅니다 혈관 내 섬 주입 이상 까지입니다 이며 따라서는 omentum 섬 이식에 대 한 잠재적으로 가치 있는 사이트로 다시 신흥. 이 실험에는 고품질 독도의 고립과 당뇨병 받는 사람에 게 독도의 주입 필요합니다. omentum에 이식 수술 단계를 더 시각적으로 설명 될 수 있다 필요 합니다. 여기,이 절차에 대 한 자세한 내용은 표시 됩니다. 당뇨병 쥐의 omental 주머니에 혼합물을 배치 하기 전에 히드로와 격리 된 독도 혼합의 두 가지 방법은 여기 설명 되어 있습니다. 다른 hydrogels 다른 조건을 위해 사용 됩니다. Syngeneic 독도 omentum에서 받는 사람 당뇨 마우스의 혈당은 최대 35 일 동안 감시 되었다. 일부 동물 면역 조직화 학적인 분석을 수행 하기 위해 14 일 후에 희생 되었다. 전 임상 이식 이렇게 예비 데이터 임상 이식에 번역을 사용할 수 있습니다.

서문

국제 당뇨병 연맹 (IDF)에 따르면 당뇨병 mellitus 현재 382 백만 사람들, 2035¹592 백만 명 예상된 증가 함께 적용 됩니다. 두 수용자와 xenogeneic 섬 이식 조직 면역 치료가 필요 합니다. 면역 억제, 없이 면역 거부 이식 손실²의 주요 원인입니다. 또한 중재 인스턴트 혈액 염증 반응 (IBMIR)^3,4인 이식된 섬 손실의 중요 한 문제가입니다. 그러나, syngeneic와 같은 면역 반응의 부재에도 자동 이식 모델, 작은 섬 세포는 문맥을 통해 간으로 이식 가난한 혈액 등 불리 한 환경 조건, 또는 염증 때문에 손실 됩니다 또는 공급 감소 산소 및 영양소^5,6. 그 결과, 장기 신진 대사 기능을 보장 하기 위해 높은 섬 번호는 감소 engraftment⁷초기 세포 손실을 보상 하는 데 필요한.

섬 engraftment를 최적화 하기 위해 시도, 여러 대체 해 부 사이트 실험적으로 조사 뿐 아니라 임상, 약속, 아직 하지 확실 한 결과⁸. 대체 사이트 중 일부는 간단 하 고 안전한 액세스를 제공 하는 반면 (예., 피부, 신장 캡슐, 위 submucosa 및 눈의 앞쪽 챔버) 또는 더 큰 섬 대 중을 위한 더 넓은 표면 (예., 복 막 구멍), 생존 및 생리 신진 대사 이식된 독도의 제한는 성능과 우려⁹유지. 섬 engraftment에 대 한 더 적합 한 사이트에 대 한 검색 진행 중 이다.

omentum 많은 해 부 사이트를 작은 섬 이식의 초기 개발에 조사 하 고 독도^{10,,1112,13, 성공적인 환경 입증 했다 중 하나 였습니다. 14}. 그러나, intraportal 섬 주입 임상 선택 인해 일부 절차의 상대적 단순 되었고 동물에 이른 성공 모델⁶. 또한, 부분적으로, 원판이 관련 사이트, 특히 대규모 초기 섬 손실, 덜 이해 하 고 덜 제한 필드 실험 섬 이식의 초기 시절에 했다 성숙. 최근 강력한 증거를 나타내는 혈관 내 섬 주입에서 멀리 이상적는 omentum은 세포 이식에 대 한 잠재적으로 가치 있는 사이트로 다시 신흥.

(Omental 주머니의 형태로) omentum 간^15,16상대적 이점을 제공합니다. 그것은 쉽게 접근할 수 있는 잘 vascularized입니다. 이식 (필요한 경우) 생 검의 검색 수 있습니다. 독도 의해 경험 하는 허 혈 성 기간 간에 비해 감소 하 고 있는 omentum 불가능 intraportally, 어디 포털 압력에서 상승 큰 섬 대 중 합병증을 일으킬 수 있습니다 상대적으로 받아들일 수 있다.

이식의 syngeneic 마우스 모델 연구, 고용 6-8 주 몸 무게의 20-25 g. 섬 받는 250의 복용량 streptozotocin의 단일 주사와 당뇨병 렌더링 했다와 오래 된 사이 남성 마우스 C57BL/6에서에서 테스트 프로토콜에 사용 된 mg/kg ip입니다. 당뇨병의 유도 경우 마우스의 혈액 포도 당 수준 24 mmol/L 48 h 보다 큰 주입 후 최소 5 일에 대 한 해당 수준의 위 남아 성공적인 간주 될 수 있습니다.

Syngeneic 독도 일부 수정 이전 게시 된 방법에 따라 나이 일치 하는 기증자의 췌 장 으로부터 격리 했다. 간단히는 콜라 대신 담 관 담 낭에 주입 했다. 이 주입의 용이성을 촉진 하기 위하여 개선으로 이루어졌다. 콜라 주입이 했다 뒤에 부 화, 조직 파괴, 밀도 그라데이션 분리 및 순수 독도를 손으로 따기. 독도 아래 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 37 ° C에서 플라스 크 T175에에서 보충 하는 CMRL-1066 매체에서 하룻밤 배양 했다 이식 전에 95% 공기-5% CO₂ .

프로토콜

이 연구에 사용 된 모든 마우스 의료 동물 센터의 광 동성에서 얻은 했다. 동물의 사용은 동물 복지의 원칙에 따라 윤리 검토 위원회의 심천 제 2 인민 병원에 의해 승인 되었다.

1. 섬 이식은 Omentum 하

참고:이 프로토콜 2 인을 달성 하기 위해 필요 합니다.

1. 표 1에 나열 되는 수술 재료를 조립 한다. 커튼 및 disposables와 같은 메 마른 재료로 외과 영역에서 무 균 필드를 준비 하 고 수술을 통해 무 균 상태를 유지. 모든 수술 기구를 소독. 멸 균 가운 착용.
2. 독도 stereomicroscope에서 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 선택 합니다. 각 마우스 450-500 섬 상응 (IEQ) tansplant 당 받게 됩니다. 각 동물에 대 한 CMRL-1066 매체의 100 µ L 살 균 1.5 mL 스냅-탑 튜브에 단일 이식에 대 한 충분 한 독도 놓습니다.
   참고: 독도 이식의 날에 고립 될 수 있다 하지만 격리 프로세스에 대 한 복구를 허용 하도록 하루 전에 그들을 분리 하는 것이 좋습니다.
3. 이식 준비까지 얼음에 독도 스냅-탑 튜브를 유지.
4. 지하실 막 매트릭스 히드로 해 동 고-20 ° C 냉장고에서 그것을 제거한 후 얼음에 그것을 유지. 히드로 4 ° C ~ 10 ° C에 액체 이며 높은 온도에 고형화 한다.
5. 모든 당뇨병 받는 사람 마우스 태그 및 무게. Intraperitoneally 60 mg/kg pentobarbital 나트륨을 주입. 테스트는 발가락 꼬 집 음을 투여 하 여 마 취의 깊이. 동물 꼬 집 음에 반응 하는 경우는 추가 10 mg/kg pentobarbital 나트륨을 제공 합니다. 경우 없는 철수 반사, 마 취의는 수술에 대 한 올바른.
6. 70% 에탄올을 사용 하 여 복 부에 수술 부위의 면봉. Razer 블레이드와 사이트에서 머리를 면도 하 고 소독 Iodophor 지역. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈을 관리 합니다.
7. 복 부 중간에 따라 복 부 절 개의 4 ~ 5 cm. 이동 열 왼쪽에 창 안과 위를 사용 하 고 수술 절차 동안 과도 한 탈수를 방지 하기 위해 염 분 젖은 거 즈로 커버.
8. 면봉을 사용 하 여 완벽 하 게 위장의 시야 노출과 omentum (위 아래에 있는)을 찾습니다. 두 켤레 미세 집게를 사용 하 여 distend는 omentum. 끊어지고 손상 되지 않도록 주의.
9. 완전히는 하이드로 겔이 시점에서 해 동. 30 독도와 튜브를 회전 g 및 제거는 상쾌한 x 200에서 s. 하이드로 겔의 50 µ L 발음, 독도, 포함 된 튜브에 그것을 추가 하 고 부드럽게 거품의 형성을 방지 하는 믹스 resuspend. 절차 동안 얼음에 튜브를 유지.
10. 집게의 2 개 쌍을 사용 하 여는 omentum의 가장자리를 선택 하 고 부드럽게 위 벽과 창 자 섬 이식 한 액체의 작은 볼륨을 수용할 수 있는 사이 홈을 형성 하기 위하여 그것을 인상.
11. 두 번째 사람은 절차에 200 µ L 피 펫 팁 resuspended 섬-히드로 혼합물 (튜브의 전체 내용)를 발음, 홈으로 콘텐츠를 전달 하자.
12. 혼합물 부드럽게 올리거나 낮추는 omentum의 가장자리에 의해 홈에 잘 배치 됩니다 확인 하십시오. 체온의 효과로 하이드로 겔 전에 3 분 이내 혼합물의 위치 완전 한 굳은 것 이다. 후에 하이드로 겔 세트, 커버는 이식 omentum 접어.
    참고:는 히드로 굳은는 omentum 주변 위 벽에 준수 합니다.
13. 히드로 경화 완전히 후 면봉을 사용 하 여 내장을 만지지 이식의 사이트 돌 복 부 구멍으로 위치를.
14. 20 µ L cephalosporin의 추가 (5 ~ 10 mg) 감염을 방지 하기 위해 복 부 구멍으로를 사용 하 여 4-0 봉합 복 부를 닫습니다.
15. 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 하 고 마우스 받는 사람 각각에 대 한 모든 단계를 반복 합니다. 쥐를 따뜻하게 유지 하 고 그들은 완전히 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 때까지 시각적으로 모니터링 합니다. 그들은 완전히 복구 될 때까지 쥐를 다른 동물에서 별도 유지.
16. 수술 후 예방으로 일주일 동안 매일 50 µ L cefazolin 나트륨 (0.05 mg/mL)의 주입. Bupivicaine + Buprenorphine 관리, 즉 0.25%의 1-3 방울을 적용 상처 클립의 배치 이전에 몸에 붙이기도 절 개 사이트에 Bupivicaine. 관리 Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) 복 (IP) 루트를 통해.
17. 측정 비 단식 혈액 포도 당 수준을 혈액 포도 당 미터를 사용 하 여 꼬리 정 맥 혈액 샘플에서 이식 후 하루에 한 번. omentum, 이식 때 섬 이식 지연 기능 하 고 2-3 주 동안 완전 하 게 정상적인 혈액 포도 당 수준에 도달 하지 않을 수 있습니다.
18. 조직학, omental 이식 다음 이식 하는 실험의 끝에 마우스에서 제거 합니다. 조직학 프로토콜에 따라 조직 수정. 이식 immunostaining 또는 면역 형광 연구 분석할 수 있습니다.

2. 대체는 Omentum에 이식 방법

참고: 실 온에서 사용 되는 대체 섬유 소-트 롬 빈 히드로 지하실 멤브레인 매트릭스 하이드로 겔에 대 한 대체 수 있습니다. 2 부품, 섬유 소 마감재 단백질 해결책 (50 U/mL 트 롬 빈 10 mg/mL fibrinogen) 그것에 의하여 이루어져 있다. 구성 요소가 혼합 되어, 그들은 장소에는 독도 보유 하는 응고 형성.

1. 섬유 소 thombin 하이드로 겔 화합물을 사용 하 여 실내 온도에. 1.2 단계에서 각 마우스 이식 당 450-500 섬 등가물 (IEQ)를 받게 됩니다. CMRL-1066 매체의 100 µ L 살 균 1.5 mL 스냅-탑 튜브에는 독도 놓습니다. 즉시 이식, 전에 10 cm의 길이 대 한 살 균 PE50 튜브에는 독도 발음 하 고 부드럽게 원심 (30에서 200 x g s) 느슨한 펠 릿을 형성 하기 위하여.
2. 퍼져 omentum와 (단계 1.5-1.8) 위에 말한 대로 동물을 준비 합니다. 하이드로 겔 구성 요소 (10 µ L/각)을 혼합 하 고는 omentum에. (그림 3D)
3. 바로 독도 히드로에 튜브에서 추방. 히드로 독도 주위 응고를 형성 한다. (그림 3E)
4. 히드로와 주머니를 형성 하는 독도 omentum 접어. (그림 3 층) 1.13 1.18 단계를 계속 합니다.

결과

췌 장 post-digestive 상태는 그림 1A에 표시 됩니다. 순화 독도 그림 1B에서 표시 됩니다. Dithizone 얼룩이 지 고는 독도의 생존 테스트는 그림 2에 표시 됩니다. omentum 작은 섬 이식의 주요 단계는 그림 3에 나와 있습니다. 혈액 포도 당 수준은 omental 이식 후 받는 사람의 그림...

토론

문맥을 통해 간 섬 이식 가장 일반적으로 사용 되는 작은 섬 이식의 방법 인간, 하지만 여전히 포털 정 맥 혈전 증과 간 steatosis¹⁷등 효율성과 안전 문제입니다. 최근 연구는 omentum 간, 하지만 더 많은 연구 필요 임상 번역^12,14,,1819전에 실시 해야 적당 한 대안이 있을 수 있습니다 보여?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5 inch (12-13 cm) Scissors	RWD Life Science	S12030-11
Fine Forceps	RWD Life Science	F11010-13
Small wound clips	RWD Life Science	R33003-01
Acutenaculum	RWD Life Science	F31044-13
2 pair tissue forceps	RWD Life Science	F13023-10
4-0 Suture with needle	Chenghe, China	17094
200 μL Pipette and tips	Gilson	PN11
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
razor blade	Philips	HC1099/15
Material and animals
Pentobarbital Sodium	Sigmaaldrich.com	P3761	For anesthesia
Hydrogel	bdbiosciences.com	356234	Basement Membrane Matrix
Fibrin-Thrombin Hydrogel	Baxter.com	1501250	Components clot when mixed
70% Ethanol	Yingniu medical, Anhui, China	23170608
Iodophor	Lierkang medical technology, Shangdong, China	170521
Normal saline	Baxter.com	2B1324
Cephalosporin	Lukang medical, Shangdong, China	150303
Cefazolin	Baxter.com	2G3508
lubricant eye ointment	Major Pharmaceuticals	203964
streptozotocin	Sigmaaldrich.com	S0130
collagenase Type V	Sigmaaldrich.com	C9262
CMRL-1066 media	celltrans, Wenzhou, China	X018D1
histopaque	Sigmaaldrich.com	10771	density gradient
PE50 tubing	Braintreesci.com	PE50 100 FT	Polyethylene .023" x .038
Calcein AM	Sigmaaldrich.com	C1359
Propidium iodide	Sigmaaldrich.com	P4864
optimal cutting temperature compound (OCT)	Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL	4583	embedding medium
insulin antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	8138S
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	14166S
eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	D1306
C57Bl/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province	/
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
T175 flasks	Falcon	353112
1.5 mL Snap-top tubes	Axygen	MCT-150-C