Метод для трансплантации островковых сальника в мышь

Резюме

Вводится метод сальниковый трансплантации островков в мышь. Изолированные островки смешиваются с гидрогеля и смесь помещается в Сальниковая сумка диабетической мыши. Затем контроль уровня глюкозы в крови, и иммуно гистохимический анализ выполняется.

Аннотация

Трансплантация островковых было предложено быть потенциальным лечения диабета 1 типа. Последние убедительных доказательств указывает, что настой внутрисосудистого островок далека от идеала и таким образом, вновь становится потенциально ценный сайт для трансплантации островковых сальника. Этот эксперимент требует изоляции островков высокого качества и имплантации островков диабетической получателям. Трансплантации сальника требует хирургического шаги, которые могут быть лучше визуально. Здесь представлены подробные шаги для выполнения этой процедуры. Здесь описываются два способа перемешивания изолированных островков с гидрогеля перед укладкой смеси в Сальниковая сумка диабетических мышей. Различные гидрогели, используются для различных условий. Уровень глюкозы в крови получателей диабетической мышь сингенных островков в сальника наблюдали до 35 дней. Некоторые животные были принесены в жертву после 14 дней для выполнения иммуно гистохимический анализ. Этот подход доклинические трансплантация может использоваться как предварительные данные, ведущих к перевод клинических трансплантации.

Введение

По данным Международной Федерации диабета (МФД), сахарный диабет в настоящее время затрагивает 382 млн человек, с прогнозируемым увеличением до 592 миллионов человек к 2035 году¹. В обоих трансплантации аллогенных и культивированная островок необходим системный иммуносупрессивной терапии. Без иммуносупрессии иммунных отказ является одной из основных причин потери трансплантата². Существует также серьезной проблемой трансплантированных островковых потери из-за мгновенного крови опосредованной воспалительной реакции (IBMIR)^3,4. Однако даже в отсутствие иммунного ответа как сингенных или модели Авто трансплантации островковых клеток, пересаженные в печени через воротной вены теряются из-за воспаления и/или неблагоприятных условий окружающей среды, таких как плохой крови Поставка с сокращением оксигенации и/или питательных веществ^5,6. В результате для того чтобы обеспечить долгосрочный метаболические функции, выше островок чисел необходимо компенсировать потерю первоначальных клеток, что уменьшает приживления⁷.

В попытке оптимизировать приживления островок несколько альтернативных анатомические сайты экспериментально исследованы, а также клинически, с перспективными, но не окончательные результаты⁸. В то время как некоторые из альтернативных сайтов предлагают легкий и безопасный доступ (например., спазмолитическое, капсула почек, желудка подслизистой и передней камере глаза) или широкой поверхности для больших масс островок (например., брюшной полости), выживания и физиологическое метаболические производительность пересаженные островки по-прежнему ограничены и остаются озабоченность⁹. Поиск более подходящего места для приживления островок продолжается.

Сальника был среди многих анатомические сайтов, которые были расследованы в раннем развитии трансплантации островковых и оказалась успешной среды для островков^{10,11,12,13, 14}. Однако в части intraportal островок настой стал клинических выбор надлежащего относительной простоте процедуры и ранний успех в животных моделей⁶. Кроме того, в части, негативы связанных с этим сайтом, особенно ранних островок гибели, были менее понятны и меньше сдерживающих в первые дни экспериментальной островок пересадке как поле созрел. С более поздних убедительных доказательств того, что свидетельствует внутрисосудистого островок настой далеко от идеала, сальника возрождается как потенциально ценный сайт для трансплантации клеток.

Сальника (в виде Сальниковая сумка) предлагает относительные преимущества над печени^15,16. Это хорошо васкуляризированной и легко доступны. Это позволяет извлечения трансплантата (если необходимо) и/или биопсия. Периода ишемического, испытываемых островки уменьшается по сравнению с печенью, и сальника может принять относительно большой островок массы, которые не возможно intraportally, где подъем портала давления может привести к осложнениям.

В протоколе испытания в исследовании, используя самцов мышей C57BL/6 между 6-8 недель с массой тела 20 – 25 г. островок получателей были оказаны Диабетическая с одной инъекции Стрептозотоцин с дозой 250 использовалась модель мышь сингенных трансплантации мг/кг ip. Индукции диабета можно считать успешным, если уровень глюкозы в крови мыши больше чем 24 ммоль/Л 48 ч после инъекции и остается выше этого уровня для не менее 5 дней.

Сингенных островков были изолированы от поджелудочной железы соответствует возрасту доноров, после ранее опубликованных методов с некоторыми изменениями. Короче говоря коллагеназа вводили желчного пузыря вместо желчных протоков. Это было сделано как улучшение для облегчения легкость инъекции. Настой коллагеназы был следуют инкубации, разрушение тканей, градиент плотности разделения и рука собирание для получения чистого островков. Островки были культивированный на ночь в среде CMRL-1066, дополнена 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) в T175 колбы при 37 ° C, до 95% воздуха - 5% CO₂ до пересадки.

протокол

Все мыши, используемые в данном исследовании были получены от животных медицинский центр Гуандун провинции. Использование животных был одобрен этики обзора Комитет из Шэньчжэнь второй народный госпиталь, в соответствии с принципами защиты животных.

1. островок пересадке для сальника

Примечание: Этот протокол требует 2 человек для выполнения.

1. Соберите хирургические материалы, которые перечислены в таблице 1. Подготовить асептических поле в хирургические области с стерильных материалов, таких как шторы и расходных материалов и поддержание асептических условий в хирургии. Стерилизуйте всех хирургических инструментов. Носите халаты стерильные.
2. Выберите с помощью кончика пипетки 200 мкл под стереомикроскопом островков. Каждая мышь будет получать 450 – 500 островок эквивалент (IEQ), в tansplant. Для каждого животного место достаточно островков для одного трансплантации в стерильных 1,5 мл трубку оснастки Топ с 100 мкл CMRL-1066 среды.
   Примечание: Островков могут быть изолированы в день трансплантации, но это лучше изолировать их за день до восстановления для изоляции процесса.
3. Держите оснастки верхней трубы с островками на льду до готовности к пересадке.
4. Оттепель гидрогеля матрица базальной мембраны и держать его на льду после его удаления из морозильной камеры-20 ° С. Гидрогель жидким при температуре 4 ° C до 10 ° C и затвердевает при более высоких температурах.
5. Весят и помечать все Диабетическая получателей мышей. Придать Пентобарбитал натрия 60 мг/кг внутрибрюшинно. Тест глубины анестезии управляющими щепотку мыс. Дать дополнительные 10 мг/кг Пентобарбитал натрия, если животное реагирует на крайнем случае. Если не снять рефлекс, уровень анестезии является правильным для хирургии.
6. Тампоном хирургической сайта на животе с помощью 70% этиловом спирте. Бритье волос из сайта с razer лезвием и дезинфицировать области с йодофора. Применять мазь ветеринар глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
7. Используйте ножницы офтальмологические открыть живот вдоль средней линии живота с надрезанными 4-5 см. шаг кишечника с левой стороны и крышка с физиологическим пропитанной марлю, чтобы предотвратить чрезмерное обезвоживание во время процедуры по хирургии.
8. Используйте ватные тампоны для полностью разоблачить зрительного поля желудка и найдите сальника (находится ниже желудка). Используйте две пары тонкой щипцов для раздуваться сальника. Позаботьтесь, чтобы предотвратить повреждения от разрывов.
9. На данный момент полностью разморожен гидрогеля. Спина трубку с островков для 30 s 200 x g и удалить супернатант. Аспирационная 50 мкл гидрогеля, добавить его в пробирку, содержащую островки и Ресуспензируйте смесь осторожно, избегая образования пузырьков. Держите трубы на льду во время процедуры.
10. Используйте две пары щипцов подобрать кромки сальника и аккуратно поднимите его сформировать паз между стенки желудка и кишечника, которые можно разместить небольшой объем жидкости с островка трансплантата.
11. Пусть второй человек помощь в процедуре и аспирационная ресуспензированы Иле гидрогеля смеси (все содержимое трубки) с кончиком пипетки 200 мкл, доставить содержимое в паз.
12. Убедитесь, что смесь хорошо позиционируется в паз, нежно повышение или понижение по краям сальника. Полная позиционирования смеси в течение 3 мин до гидрогеля затвердевает как эффект температуры тела. После того, как Гидрогель множеств, сложите сальника для покрытия трансплантата.
    Примечание: сальника будет придерживаться окружающие желудка стены как Гидрогель затвердевает.
13. После гидрогеля полностью затвердевает, используйте ватные тампоны для перемещения кишечника обратно в брюшной полости, стараясь не коснуться сайте трансплантации.
14. 20 мкл цефалоспоринов (5 ~ 10 мг) в брюшную полость для предотвращения инфекции, затем использовать 4-0 шовный материал для закрытия брюшной полости.
15. Вернуть его клетки мыши и повторите все шаги для каждой мыши получателя. Согревались мышей и визуально контролировать до тех пор, пока они полностью восстановить достаточно сознания для поддержания грудной recumbency. Храните отдельно от других животных мышей до тех пор, пока они полностью выздоровел.
16. Придать 50 мкл Цефазолин натрия (0,05 мг/мл) каждый день в течение недели как профилактика послеоперационных. Администрирование Bupivicaine + бупренорфина, т.е. применять 1-3 капли 0,25% Bupivicaine на сайте разрез местно до размещения рану клипов. Администрирование Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) через внутрибрюшинного маршрут (IP).
17. Измерить пост-уровень глюкозы в крови из вен хвост крови с помощью измерителя глюкозы крови один раз в день после пересадки. При пересадке для сальника, островок трансплантата может иметь функцию задержки и не достигают уровня глюкозы в крови вполне нормальная для 2-3 недели.
18. Для гистологии удалите сальниковый трансплантата из мыши в конце эксперимента после трансплантации. Исправьте ткани по данным гистологических протоколы. Трансплантат могут быть проанализированы для иммуноокрашивания или иммунофлюоресценции исследований.

2. альтернативный метод для трансплантации для сальника

Примечание: Альтернативные фибрин тромбиновое гидрогеля, который используется при комнатной температуре может быть заменен для матрицы гидрогеля базальной мембраны. Он состоит из 2 компонентов, фибринового герметика белка решение (50 ед/мл тромбина и фибриногена 10 мг/мл). Когда компоненты смешиваются, они образуют сгусток, хранящий островки на месте.

1. Используйте фибрин thombin гидрогеля соединения при комнатной температуре. Как шаг 1.2 каждая мышь будет получать 450 – 500 островок эквиваленты (IEQ) за пересадки. Место островки в стерильных 1,5 мл трубки оснастки Топ с 100 мкл CMRL-1066 среды. Сразу же до трансплантации, аспирационная островки в стерильные PE50 трубка длиной 10 см и осторожно центрифуги (30 s на 200 x g) сформировать сыпучих гранул.
2. Подготовьте животное, как указано выше (шаги 1,5-1,8) с сальника, разложить. Смешать компоненты гидрогеля (10 мкл/каждый) и место на сальника. (Рис. 3D)
3. Немедленно изгнать островков из труб на Гидрогель. Гидрогель образует сгусток вокруг островках. (Рисунок 3E)
4. Сложите сальника над гидрогеля и островков сформировать чехле. (Рисунок 3F) Продолжите выполнение шагов 1.13-1.18.

Результаты

POST-DIGESTIVE Состояние поджелудочной железы показана на рисунке 1A. Очищенный островков показаны на рисунке 1B. Дитизон окрашивание и жизнеспособности тестирование островки показаны на рисунке 2. На рисунке 3п...

Обсуждение

Островок пересадке печени через воротной вены является наиболее часто используемый метод трансплантации островковых в организме человека, но есть еще проблемы эффективности и безопасности, такие как стеатоз печени и тромбоз воротной вены¹⁷. Недавние исследования показыв...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5 inch (12-13 cm) Scissors	RWD Life Science	S12030-11
Fine Forceps	RWD Life Science	F11010-13
Small wound clips	RWD Life Science	R33003-01
Acutenaculum	RWD Life Science	F31044-13
2 pair tissue forceps	RWD Life Science	F13023-10
4-0 Suture with needle	Chenghe, China	17094
200 μL Pipette and tips	Gilson	PN11
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
razor blade	Philips	HC1099/15
Material and animals
Pentobarbital Sodium	Sigmaaldrich.com	P3761	For anesthesia
Hydrogel	bdbiosciences.com	356234	Basement Membrane Matrix
Fibrin-Thrombin Hydrogel	Baxter.com	1501250	Components clot when mixed
70% Ethanol	Yingniu medical, Anhui, China	23170608
Iodophor	Lierkang medical technology, Shangdong, China	170521
Normal saline	Baxter.com	2B1324
Cephalosporin	Lukang medical, Shangdong, China	150303
Cefazolin	Baxter.com	2G3508
lubricant eye ointment	Major Pharmaceuticals	203964
streptozotocin	Sigmaaldrich.com	S0130
collagenase Type V	Sigmaaldrich.com	C9262
CMRL-1066 media	celltrans, Wenzhou, China	X018D1
histopaque	Sigmaaldrich.com	10771	density gradient
PE50 tubing	Braintreesci.com	PE50 100 FT	Polyethylene .023" x .038
Calcein AM	Sigmaaldrich.com	C1359
Propidium iodide	Sigmaaldrich.com	P4864
optimal cutting temperature compound (OCT)	Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL	4583	embedding medium
insulin antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	8138S
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	14166S
eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	D1306
C57Bl/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province	/
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
T175 flasks	Falcon	353112
1.5 mL Snap-top tubes	Axygen	MCT-150-C