Adacık nakli için Mouse omentumun için bir yöntemi

Özet

Bir mouse adacıkları omental nakli için bir yöntem tanıttı. İzole adacıkları hidrojel ile karıştırılır ve karışımı bir diyabetik fare omental kese yerleştirilir. Daha sonra kan şekeri izlenir ve IMMUNO-histochemical çözümleme yapılır.

Özet

Adacık nakli tip 1 diyabet için potansiyel bir tedavi olmak için teklif edildi. Son esaslı bir kanıt bulmadığınız intravasküler adacık infüzyon ideal çok uzak olduğunu gösterir ve bu nedenle, omentumun yeniden ortaya çıkan adacık nakli için potansiyel olarak değerli bir site olarak. Bu deney yalıtım kaliteli adacıkları ve diyabetik alıcılara adacıkları implantasyonu gerektirir. Nakli için omentumun daha iyi görsel olarak göstermiş olabilir cerrahi adımları gerektirir. Burada, bu yordam için ayrıntılı adımlar sunulmaktadır. Karışımı diyabetik farelerin kese omental yerleştirmeden önce hidrojel ile izole adacıkları karıştırma için iki yöntem burada açıklanmıştır. Farklı hydrogels farklı koşulları için kullanılır. Kan şekeri düzeyleri diyabetik fare alıcıların omentumun syngeneic adacıklar 35 gün için takip. Bazı hayvanlar IMMUNO-histochemical analizi yapmak için 14 gün sonra kurban edildi. Bu önceden klinik nakli yaklaşım klinik nakli için çeviri kadar önde gelen ön veriler olarak kullanılabilir.

Giriş

Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF) göre diyabet Şu anda 592 milyon kişi 2035¹tarafından öngörülen bir artış ile 382 milyon insanı etkiliyor. Her iki allojeneik ve xenogeneic adacık nakli sistemik immünsupresif tedavi gereklidir. İmmünosupresyon bağışıklık ret greft kaybı²önemli bir nedenidir. Transplante adacık kaybı nedeniyle anında kan aracılı inflamatuar reaksiyon (IBMIR)^3,4önemli bir sorun da vardır. Ancak, syngeneic olduğu gibi böyle bir bağışıklık yanıtı yokluğunda bile veya auto-nakli modelleri, adacık hücreleri karaciğer portal ven yoluyla içine nakledilen iltihap nedeniyle ve/veya zayıf kan gibi olumsuz çevre koşulları için kayıp düşük oksijen ve/veya besin^5,6ile sağlayın. Sonuç olarak, uzun vadeli metabolik işlevi sağlamak için adacık numaraları daha büyük engraftment⁷azaltır ilk hücre kaybı için telafi etmek gereklidir.

Adacık engraftment optimize etmek için bir girişim, birkaç alternatif anatomik sitesi deneysel olarak araştırılması gibi klinik olarak, yapılan umut verici ile henüz değil kesin görüntülenen⁸. Bazı alternatif siteleri kolay ve güvenli erişim sunan ise (Örneğin., cilt, böbrek kapsülü, gastrik submukoza ve gözün ön odası) veya daha büyük adacık kitleler için daha geniş bir yüzey (e.g., periton boşluğu), hayatta kalma ve fizyolojik transplante adacıklar metabolik performans ve hala sınırlı bir endişe⁹kalır. Adacık engraftment için daha uygun bir site için arama devam ediyor.

Omentumun adacık nakli erken gelişme araştırıldı ve başarılı bir ortam adacıkları^{10,11,12,13kanıtlamış birçok anatomik siteler arasında yapıldı, 14}. Ancak, intraportal adacık infüzyon klinik seçim nedeniyle kısmen yordamı göreli kolaylığı oldu ve⁶hayvan erken başarı modelleri. Ayrıca, kısmen, negatifleri ilişkili ile bu site, özellikle büyük erken adacık kaybı vardı daha az anlaşılan ve daha az alan olarak deneysel adacık nakli ilk günlerinde sınırlama olgunlaştı. Damar içi adacık infüzyon uzakta olduğunu belirten daha yeni zorlayıcı kanıtlarla omentumun yeniden ortaya çıkan hücre transplantasyonu için potansiyel olarak değerli bir site olarak idealdir.

Omentumun (omental bir kese şeklinde) karaciğer^15,16göreli avantaj sunar. İyi bozukluklarına ve kolayca erişilebilir. Greft (gerekirse) ve/veya biyopsi alınmasını sağlar. Tarafından adacıkları deneyimli iskemik dönem karaciğer ile karşılaştırıldığında azalır ve omentumun nispeten intraportally, bir artış nerede portal basınç mümkün değil büyük adacık kitleler komplikasyonlara neden olabilir kabul edebilir.

Bir syngeneic fare modeli nakli C57BL/6 erkek fareler arasında 6 – 8 haftalık 20-25 g. adacık alıcılar ile streptozotocin tek bir enjeksiyon 250 doz ile diyabetik hale vücut ağırlığı ile istihdam çalışmada test protokolü kullanıldı mg/kg IP. Kan şekeri düzeyini fare enjeksiyon sonra 24 mmol / M 48 h büyüktür ve bu düzeyi en az 5 gün için yukarıda hala diyabet indüksiyon başarılı kabul edilebilir.

Syngeneic adacıkları yaş eşlemeli bağış bazı değişikliklerle daha önce yayımlanmış yöntemleri takip pankreas dan izole edildi. Kısacası, collagenase safra kesesi safra kanalını yerine içine enjekte ettiler. Bu enjeksiyon kolaylığı kolaylaştırmak için bir gelişme yapıldı. Collagenase infüzyon kuluçka, doku bozulması, yoğunluk gradient ayırma tarafından izlenen ve el-toplama saf adacıkları elde etmek için. Adacıkları gecede ile % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum (FBS) 37 ° C'de T175 şişeler içinde küçük takıma CMRL-1066 ortamda kültürlü % 95 hava - %5 CO₂ nakli önce.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm fareler tıbbi hayvan merkezi Guangdong eyaleti elde edilmiştir. Hayvanlar kullanımı hayvan refah ilkelerine uygun olarak etik İnceleme Komitesi, Shenzhen ikinci halk Hastanesi tarafından kabul edildi.

1. adacık nakli için omentumun

Not: Bu protokol gerçekleştirmek 2 kişilik gerektirir.

1. Tablo 1' de listelenen cerrahi malzemeleri bir araya getirin. Perdeler ve tek kullanımlık gibi steril malzemeler ile cerrahi alanındaki aseptik alan hazırlamak ve cerrahi aseptik koşullarını korumak. Tüm cerrahi aletler sterilize. Steril önlük giymek.
2. Stereomicroscope altında 200 µL pipet ucu kullanarak adacıkları seç. Her fare 450-500 adacık eşdeğer (IEQ) tansplant ücret alacaksınız. Her hayvan için yeterli adacıkları tek nakli için CMRL-1066 orta 100 µL ile steril 1,5 mL ek-üst tüp içine koyun.
   Not: Adacıkları nakli günü izole, ama onları kurtarmaya yalıtım işlem için izin verecek bir gün önce yalıtmak daha iyi.
3. Buzda adacıkları ile ek alıcı tüpler nakli için hazır kadar tutun.
4. Membran matris hidrojel çözülme ve -20 ° C dondurucudan çıkardıktan sonra buz üzerinde tutun. Hidrojel sıvı 4 ° c ile 10 ° C ve daha yüksek sıcaklıklarda katılaşır.
5. Tartmak ve tüm diyabetik alıcı fare etiket. 60 mg/kg Fentobarbital sodyum intraperitoneally enjekte et. Test bir ayak çimdik yönetmek anestezi derinliği. Bir ek 10 mg/kg Fentobarbital sodyum hayvan için çimdik tepki vermek. Eğer hiçbir anestezi ameliyat için doğru seviyesidir refleks, geri çekilin.
6. % 70 etanol kullanarak Karin cerrahi ücreti temizle. Saç sitesinden bir razer bıçak ile tıraş ve Iodophor ile alanı dezenfekte. Veteriner merhem kuruluk anestezi iken altında önlemek için gözlere yönetmek.
7. Oftalmik makas sol tarafa bağırsak karın orta çizgi boyunca karın bir kesi 4-5 cm. hareket ile açmak için kullanın ve cerrahisi prosedürü sırasında aşırı su kaybı önlemek için tuz batırılmış gazlı bezle kapak.
8. Pamuk temizleme bezi tam olarak görme alanı mide ortaya çıkarmak ve (mide yer alan) omentumun bulmak için kullanın. Omentumun distend için iyi forseps iki çift kullanın. Yırtılma gelen hasarı önlemek için dikkat ediniz.
9. Hidrojel tamamen bu noktada çözdürülen. 30 adacıkları ile tüp spin 200 g ve Kaldır süpernatant x s. Hidrojel 50 µL Aspire edin, adacıkları içeren tüp ekleyin ve karışımı yavaşça kabarcıklar oluşumunu önleme resuspend. Buz üzerine boruları işlem sırasında tutmak.
10. Forseps iki çift omentumun kenarları al ve yavaşça bir oluk adacık nakli ile sıvı hacmi çok küçük kapasiteli bağırsak ve mide duvar arasında forma yükseltmek için kullanın.
11. İkinci kişi yordamda yardımcı olmak ve resuspended adacık-hidrojel karışımı (tüp tüm içeriğini) 200 µL pipet ucu ile Aspire, oluk içine içeriği teslim izin.
12. Karışım iyi oluk içine yavaşça yükselterek veya omentumun kenarlarını düşürücü konumlandırıldığından emin olun. Tam karışımı hidrojel önce 3 dakika içinde konumlandırma vücut ısısı bir etkisi olarak dönüşür. Hidrojel kurmasından sonra omentumun greft kapsayacak şekilde katlayın.
    Not: hidrojel katılaşır gibi omentumun çevreleyen gastrik duvar için uygun olacaktır.
13. Sonra hidrojel tamamen katılaşmış, pamuk temizleme bezi bağırsak nakli sitenin dokunmak dikkat çekici geri karın boşluğuna, yeniden konumlandırmak için kullanın.
14. Sefalosporin 20 µL ekleyin (5 ~ 10 mg) enfeksiyonu önlemek için karın boşluğuna sonra 4-0 dikiş karın kapatmak için kullanın.
15. Fareyi onun kafes dönmek ve her fare alıcı için tüm adımları yineleyin. Fareler sıcak tutmak ve onlar tamamen sternal recumbency korumak için yeterli kendine gelmek kadar görsel olarak izleme. Tamamen iyileştin mi kadar fareler diğer hayvanlardan ayrı tutun.
16. 50 µL sülfadiyazin sodyum (0,05 mg/mL) ameliyat sonrası profilaksi olarak bir hafta boyunca her gün enjekte. Yönetmek bölgelerelidokain + buprenorfin, yani uygulamak 1-3 damla % 0.25 bölgelerelidokain topikal önce yerleştirme yara klip kesi yerinde. Yönetmek Buprenorphine(0.03 mg/ml with sterile 0.9% saline, 0.05-0.10 mg/kg) mayi (IP) yolu ile.
17. Sigara açlık kan şekeri düzeyini bir kan şekeri ölçüm cihazı kullanarak kuyruk-damar kan örneği üzerinden ölçmek nakilden sonra günde bir kez. Omentumun için dikim zaman adacık nakli gecikmiş bir işlevi vardır ve tamamen normal kan şekeri düzeyi 2-3 hafta boyunca ulaşamadığı.
18. Histoloji için omental greft nakli sonrasında deney sonunda fare kaldırın. Histolojik protokolleri göre doku düzeltmek. Greft immunostaining veya ayirt çalışmaları için analiz edilebilir.

2. alternatif yöntem nakli için omentumun için

Not: oda sıcaklığında kullanılan bir alternatif fibrin-Trombin hidrojel membran matris hidrojel için yerine olabilir. 2 bileşenlerden bir fibrin mühürleyen protein çözüm (50 U/mL Trombin ve 10 mg/mL Fibrinojen) oluşur. Bileşenler karışık zaman onlar adacıkları yerinde tutan bir kan pıhtısı oluşturur.

1. Fibrin thombin hidrojel bileşik oda sıcaklığında kullanın. Adım 1.2 olduğu gibi her fare nakli başına 450-500 adacık eşdeğerleri (IEQ) alacaksınız. CMRL-1066 orta 100 µL ile steril 1,5 mL ek-üst tüp adacıkları yerleştirin. Hemen 10 cm uzunluğunda için steril bir PE50 boru içine adacıkları nakli önce Aspire ve yavaşça santrifüj kapasitesi (30 s 200 x g) gevşek Pelet oluşturmak için.
2. Hayvan yayılmış omentumun ile (adımları 1.5-1.8) belirtildiği gibi hazırlayın. Hidrojel bileşenleri (10 µL/her) mix ve omentumun yerleştirin. (Şekil 3D)
3. Hemen adacıkları boru hidrojel üzerine gelen sınırdışı. Hidrojel adacıkları etrafında pıhtı oluşturur. (Şekil 3E)
4. Omentumun hidrojel ve bir kese şeklinde adacıkları üzerinde kat. (Şekil 3F) 1,13 1,18 adımlara devam edin.

Sonuçlar

Pankreas Post-digestive durumunu Şekil 1Aile gösterilir. Arıtılmış adacıkları Şekil 1Badımında gösterilir. Dithizone boyama ve canlılığı adacıkları test Şekil 2' de gösterilmiştir. Adacık nakli ana adımları omentumun için Şekil 3' te gösterilmektedir. Kan şekeri düzeyleri alıcılarının omental nakli sonra Şekil 4

Tartışmalar

Portal ven yoluyla karaciğere adacık nakli en yaygın olarak kullanılan yöntem adacık nakli, insanlarda, ama hala portal ven trombozu ve karaciğer yağlanma¹⁷gibi verimlilik ve güvenlik endişeleri vardır. Son araştırmalar, omentumun karaciğer ama önce klinik çeviri^12,14,18,19yapılacak daha fazla araştırma ihtiyacı için uygun bir alternatif olabilir gö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
5 inch (12-13 cm) Scissors	RWD Life Science	S12030-11
Fine Forceps	RWD Life Science	F11010-13
Small wound clips	RWD Life Science	R33003-01
Acutenaculum	RWD Life Science	F31044-13
2 pair tissue forceps	RWD Life Science	F13023-10
4-0 Suture with needle	Chenghe, China	17094
200 μL Pipette and tips	Gilson	PN11
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system	Johnson & Johnson	33391713
razor blade	Philips	HC1099/15
Material and animals
Pentobarbital Sodium	Sigmaaldrich.com	P3761	For anesthesia
Hydrogel	bdbiosciences.com	356234	Basement Membrane Matrix
Fibrin-Thrombin Hydrogel	Baxter.com	1501250	Components clot when mixed
70% Ethanol	Yingniu medical, Anhui, China	23170608
Iodophor	Lierkang medical technology, Shangdong, China	170521
Normal saline	Baxter.com	2B1324
Cephalosporin	Lukang medical, Shangdong, China	150303
Cefazolin	Baxter.com	2G3508
lubricant eye ointment	Major Pharmaceuticals	203964
streptozotocin	Sigmaaldrich.com	S0130
collagenase Type V	Sigmaaldrich.com	C9262
CMRL-1066 media	celltrans, Wenzhou, China	X018D1
histopaque	Sigmaaldrich.com	10771	density gradient
PE50 tubing	Braintreesci.com	PE50 100 FT	Polyethylene .023" x .038
Calcein AM	Sigmaaldrich.com	C1359
Propidium iodide	Sigmaaldrich.com	P4864
optimal cutting temperature compound (OCT)	Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL	4583	embedding medium
insulin antibody	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	8138S
hematoxylin staining media	Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923	14166S
eosin staining media	Beyotime Biotech, China	C0109
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	D1306
C57Bl/6 Mice	Medical Animal Center of Guangdong Province	/
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30084
T175 flasks	Falcon	353112
1.5 mL Snap-top tubes	Axygen	MCT-150-C