צמיחה אנאירובית ותחזוקה של שורות תאים בתרבית

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת טיפוח לטווח ארוך אנאירובית של שורות תאים הוקמה. הזמן המרבי הישרדות שבו נבדקה הוא 17 ימים. שיטה זו מתאימה בדיקה של סוכנים ציטוטוקסיות, חקר הפיזיולוגיה של anoxically שכפול התאים.

Abstract

ביותר הרירית משטחים יחד עם האמצע בין גידולים בתאי גזע נישות הם אזורים גיאוגרפיים של הגוף שאינן אנאוקסיים. מחקרים קודמים מראים כי הדגירה ב- normoxic (5% CO₂ באוויר) או מחוסר חמצן (רמות חמצן נמוכות) תנאים ואחריו תוצאות אנאוקסיים דגירה (היעדרות של חמצן חופשי) ב מוגבלת הכדאיות (2-3 ימים). מתודולוגיה הרומן פותחה המאפשרת של הטיפוח סלולריים אנאוקסיים (עבור פחות 17 ימים; משך הזמן המרבי נבדק). ההיבט הקריטי ביותר של מתודולוגיה זו היא להבטיח כי אין חמצן הוא הציג לתוך המערכת. זה מתקבל על ידי degassing של התקשורת, ועל ידי צינורות שטיפה, מאכלים, מבחנות, פיפטות עם תערובת גז אנאירובית (H₂, CO₂, N₂) ואחריו המתיר את החומרים כדי equilibrate לסביבה (ללא חמצן) אנאוקסיים לפני השימוש. טיפול נוספים החייבים אימון בעת רכישת photomicrographs על מנת להבטיח כי micrographs שהושגו אינם מכילים ממצאים. בהעדר חמצן, מורפולוגיה תאים זה שינו באופן משמעותי. שני morphotypes נפרדים מצוינים עבור כל התאים תוצרת anaerobically. ניתן להחיל את היכולת לגדול ולתחזק בתרבית של תאים, בהעדר חמצן לניתוח של פיזיולוגיה של התא polymicrobial אינטראקציות, אפיון biosynthetic הוחלף נגזר מסלולים עבור פיתוח תרופות הסרטן הרומן.

Introduction

קיימים תאים של גידולים מוצקים, נישות תאי גזע אלה המצפים את המשטחים הרירית בסביבות חווים רמות חמצן מופחתת, כולל אנוקסיה^1,2,3,4. בארצות הפיזיולוגיות נורמלי, חמצון משתנה מעבר לזה של היפוקסיה אנוקסיה (העדר מוחלט של חמצן)^5,6. ההבנה כי חמצן אטמוספרי משפיע לרעה על שכפול בתרבית של תאים, את צמיחת תאים במבחנה ניתן למטב בתנאים חמצן מדולדל דווח בשנות השבעים המוקדמות. . ריכטר ואח ⁷ הראה כי רמות החמצן (היפוקסיה)-1-3% משופרת ציפוי יעילות לעומת חמצן אטמוספרי (20%). תוחלת החיים של האדם תא דיפלואידי נמתח גם התנאים תרבות ובשפתיים⁸.

In vivo, תנאים ובשפתיים להתרחש כאשר חנויות חמצן מדולדל (למשל, במהלך פעילות גופנית אינטנסיבית), שבו ייצור ATP הוא החליף בשריר השלד של נשימה אירובית כדי התסיסה (נשימה אנאירובית) עם המוצר הסופי של חומצה לקטית⁹. פתולוגית, בגידולים סרטניים, הפנים של הגידול בנפח גדול הוא ובשפתיים כדי אנאוקסיים בשל עניים vascularization¹⁰. השפעת זלוף מוגבלת על הגידול פנים תאומת באופן עצמאי על-ידי הגידול פנים בידי אווירני anaerobes¹. Mechanistically, גידול התא הישרדות היפוקסיה נחשב להיות תלויים אך ורק הביטוי של הגן גורם היפוקסיה-inducible 1-אלפא (HIF1-alpha), וזו התגובה הספונטנית הראשונית היפוקסיה^{4,11 , 12}. HIF1-אלפא הנגרמת מחוסר חמצן בתנאים על ידי חלבוני הלם חום לאגד את HIF1-מקדם אלפא ו upregulate שעתוק גנים¹². אלו חלבונים הלם חום הם האמינו כדי לסייע אינדוקציה של פנוטיפים שונים אצל microenvironment שתקבעו הגידול. אלה פנוטיפים התערוכה ביטוי מוגבר של קרום התא הגלוקוז למעליות, הקצב של גליקוליזה (אפקט ורבורג)¹³. התוצאה היא מתג מ מיטוכונדריאלי זרחון חמצוני כדי לקטט תסיסה.

הישרדות אנאוקסיים יכולים לנצל גם חלופות גלוקוז כדי לתמוך את התופעה^14,של הישרדות¹⁵. הדוגמה יונקים למד בצורה הטובה ביותר היא העכברוש השומה, אשר יכול לשרוד במשך כמעט 20 דקות בלי חמצן דרך מסלול מונחה פרוקטוז תסיסה glycolytic¹⁴. עיבוד חלופיות מתרחשת אצל דגים מסוימים (למשל, קרפיון [קרסיוס sp.], אשר יכול לשרוד באופן משמעותי יותר פרקי זמן שימוש גליקוליזה עם אתנול תוצר לוואי מסוף)¹⁵. בשני המקרים, תסיסה מניע את חילוף החומרים הפעלת הישרדות בהיעדר חמצן. ההשערה הנוכחי להישרדות אנאוקסיים זה כל כך הרבה זמן כמו HIF1-אלפא מופעל במהלך היפוקסיה, נשימה מיטוכונדריאלי, ללא צורך חמצן, מתרחשת תחת תנאים אנאירוביים¹⁶. יתר על כן, זה הוא שמהווה השימוש שביל fermentative להישרדות ובשפתיים/אנאוקסיים משפר הישרדות הגידול מאז התאים למנוע סטרס חמצוני, אשר יכול להוכיח להיות מזיקה הישרדות תא¹⁷. אקסיומת זה נתמך על ידי מחקר שנערך לאחרונה, אשר מראה כי בעוד cardiomyocytes, היפוקסיה מפחית את הלחץ חמצוני על ה תא הגידול¹⁷.

עד כה, מהות חיוני שביל fermentative להישרדות אנאוקסיים בתרבית של תאים יש כבר טבוע עמוק בספרות, בשל, במידה רבה, עד לחוסר בתאים בתרבית של תרבות העדר מוחלט של חמצן במשך יותר מ- 3 ימים. עם זאת, אלטרנטיבה גליקוליזה למען הישרדות אנאירובית מתרחשת אצל חיידקים. בחיידקים מסוימים, חנקן או סולפט (בין תרכובות אחרות) יכול לשמש acceptors אלקטרון מסוף עבור מערכת ציטוכרום אוקסידאז בהיעדר חמצן¹⁸. למרות ההתפתחות בקטריאליים ו האיקריוטים התרחשה במקביל מאז מתפצל מן האב נפוצות הקדמון, ההערכה היא כי המיטוכונדריה שאתם מספקים אנרגיה לתאים 1.542 מיליון שנה לפני חמצון של האוקיינוסים¹⁹ . מאז חוקרים יש הראו כי המיטוכונדריה מבודד יכול לייצר ATP בהעדר חמצן, עם חנקיתי כמו מקבל אלקטרון מסוף, סביר להניח כי תאים שיכלה לשמש לפרקי זמן ארוכים יותר מ-3 ימים בהיעדר חמצן ^{20 , 21 , 22 , 23}. המתודולוגיה המתוארים במחקר זה יש כלי הגידול אנאירובית בתרבית של תאים של שורות תאים רבים.

Protocol

1. מכינים את המדיה לתרבות אנאירובית של קווי בתרבית של תאים שונים

1. להפוך את המדיום PS-74656 מלאה עבור התרבות תאים אנאוקסיים²⁵.
   1. להפוך את הפתרון מניות חנקיתי סטרילי (5 מ'; 100 x) על ידי המסת 17.25 גר' חנקיתי ב 50 מ של מים מזוקקים יונים, ואז לסנן לחטא זה.
   2. להוסיף 0.5 מ"ל של הפתרון מניות חנקיתי לכל 50 מ של גלוקוז נמוך DMEM (1 g/L של גלוקוז) עם 110 מ ג/ליטר של L-גלוטמין, 584 mg/L של נתרן פירובט, סרום שור עוברית 10% (FBS; לא פעיל-חום).
      הערה: השימוש FBS ריכוזים הגדול מ- 10% הם רעילים. ראוי לציין, סרטן התא בשורה אחת נבדק היו רגישות נמוכה עבור מדיה עם חנקיתי (מד א-MB-231, השד סרטן תאים בטור) והוא, לפיכך, גדל, בהעדר חנקיתי. בנוסף, למרות PS-74656 בינוני נתמך הגידול של כל הקווים תא שנבדקו (n = 9), וודאי שורות תאים (למשל, תאים Vero) הציג ריכוז גבוה של התא ואת הכדאיות גבוה יותר ב- PS-74656 עם גלוקוז גבוהות (4.5 g/L) DMEM ²⁵.
   3. מקום 20 מ"ל של מדיום שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 50 מ. אין לחזק את הכובע; זה צריך להיות חופשי.
   4. דה-גז המדיום על-ידי הצבת את הצינורית בתוך צנצנת ואקום-כ 45 ° זווית, להגדיל את שטח הפנים בינוני.
   5. החל ואקום באמצעות משאבת ואקום או שווה ערך, בטמפרטורת החדר. לשמור על שואב האבק עד בועות הם כבר לא נצפו (24-48 שעות).
   6. להסיר את הצינור מצנצנת וסגור מיד את הכיפה, איטום צינור כדי למזער את המבוא של אוויר לתוך האמצעי.
   7. מקם את הצינור בבית הבליעה אנאירובית מסחרי.
   8. שחרר את הצינורית ולאפשר את האווירה בצינור כדי equilibrate עם זה של תערובת הדלק אנאירובית בבית הבליעה לפחות 24 שעות.
      הערה: המדיום צריכים להישאר בחדר עד שהוא משמש. להאצת התהליך, סומק הצינור לפחות 3 x עם תערובת גז אנאוקסיים באמצעות פיפטה העברה סטרילי מלא גז אנאוקסיים, אשר מורכב של H₂, CO₂ו- N_2-
   9. דגה לכל הצינורות (10-15 דקות) ממוקמים בבית הבליעה אנאירובית כמתואר לעיל לפני איטום הצינור והצבת בבית הבליעה. לפני השימוש, לשטוף את זה עם תערובת גז אנאירובית באמצעות פיפטות העברה 1.5 – 2 מ"ל או טיפים פיפטה כי יש כבר סמוקות עם אנאוקסיים גז לפחות 3 x.
   10. בעוד בבית הבליעה אנאירובית, הוצא 100 µL של המדיום לרכבת התחתית מיקרו-צנטריפוגה degassed סטרילי ובדוק זה עבור החמצן המומס באמצעות בדיקה של חמצן בתוך החדר.
       הערה: האלקטרודה חמצן מכויל לכל פרוטוקול של היצרן לפני השימוש. קריאות של התקשורת תערובת גז אנאירובית כראוי degassed ו equilibrated הם 0.
       התראה: אם הקריאות מעל 0.3 ppm של חמצן, להמשיך דגירה התקשורת בבית הבליעה אנאירובית מאז נדרש יותר זמן equilibrate של המדיום.

2. אנאוקסיים טיפוח של קווים בתרבית של תאים שונים

1. ביום המיועד-1
   1. לגדול תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) בבקבוקון T150 90% זרימה עבור הפקד תרבות אנאוקסיים ו- normoxic לספק מספר מספיק של תאים עבור 24-ובכן שלושה לוחות (80% זרימה).
      הערה: במחקר זה, תאים הלה 229 ו- Vero שימשו. פרוטוקול זה היה גם נבדק, עלתה יפה הצמיחה ותחזוקה של שבעה אחרים תא שורות²⁵.
   2. להסיר את המדיום של הבקבוק על ידי השאיפה, לשטוף אותו עם 10 מ"ל של HBSS.
   3. החלף את המדיום עם 5 מ של טריפסין. להתסיס את הבקבוק עד התאים נובע באופן חזותי הפלסטיק. תשאף רוב טריפסין, ולאחר מכן הקש את הבקבוקון מכך התאים חסיד. להוסיף 10 – 15 מ של גלוקוז גבוהה DMEM (4.5 g/L של גלוקוז, 110 מ ג/ליטר של L-גלוטמין, 10% FBS, 50 µg/mL של גנטמיצין) כדי להשבית את טריפסין.
   4. Triturate התאים באמצעות פיפטה 25 מ ל עד כל תא גושים הם שיבשו.
   5. לספור את התאים ולקבוע את הכדאיות באמצעות את hemocytometer הרגיל, שיטת הדרה trypan צבע כחול או המקבילה אוטומטית.
   6. להשעות התאים גלוקוזה גבוהה DMEM כאמור לעיל את צפיפות התאים של 2.24 x 10⁵ תאים למ"ל.
   7. להוסיף 1 מ"ל של התליה תא הבארות של צלחת 24-ובכן תרביות רקמה (2.24 x 10⁵ תאים/טוב; 80% זרימה). צלחת זרע 1 עבור התרבות אנאוקסיים ואחר עבור פקד normoxic תרבות.
   8. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים normoxic (5% CO₂) במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: יכול להיות מצופה התאים בתוך צלחות היטב בגדלים שונים. עם זאת, זריעת תאי לצמיחה אנאוקסיים ב מבחנות מסתכנת המבוא של חמצן למערכת, אלא אם כן טיפול וננקט לחשוף לחלוטין גז באטמוספירה.
2. יום המיועד 0
   1. לאחר 24 שעות של normoxic הדגירה, למקם את הצלחות לצמיחה אנאוקסיים תא אנארובי (תא אנארובי מסחרי; איור 1).
   2. מיד לשנות את המדיום לבינונית תרופתיים נודף דה-גז PS-74656 אשר יש כבר שאמבטיה במשך 24 שעות ביממה אל התא אנאירובית. מקם את הצלחת במיכל עם מגבת, באופן רופף לסגור אותו כדי לשמור על הלחות.
      הערה: הלוחות לצמיחה normoxic מטופלים באופן זהה עם היוצא מן הכלל אשר כל הטיפולים נעשים תחת תנאים אטמוספיריים.
3. ביום המיועד 1
   1. יום 1 של הדגירה אנאירובית מתחיל לאחר 24 שעות של הדגירה בבית הבליעה אנאירובית מסחרי אשר מכיל תערובת גז אנאירובית סטנדרטי של 10% H₂, 10% CO₂ו- 80% N₂.
   2. תקופת דגירה התאים בפרקי זמן שונים.
   3. נטר אמצעי אנאירובית עבור שינוי הצבע לאורך זמן.
      הערה: שינוי צבע של אדום כתום מגנטה אותות הזמן לשנות את המדיום. זה יכול לקחת עד שבועיים להתרחש. שינוי צבע במדיום של אדום כתום לצהוב מעיד על קיומם של זיהום חיידקי.
   4. כאשר המדיום משתנה מאדום מגנטה, להסיר את התאים runagate על ידי השאיפה.
   5. המקום התקשורת בילה aspirated עם תאי runagate degassed ואנאירוביים גז equilibrated microfuge צינורות, קרוב הצינורות תוך הקפדה כי החותם הוא מאובטח, ואז centrifuge אותם (326 x g; בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות). מיד להחליף את המדיה aspirated בבאר 1 מ"ל של מדיום חדש PS-74656 degassed.
   6. מקם את הצינור microfuge עם תאים מגורען בבית הבליעה אנאירובית לפני פתיחתה. האחות המדיום בילה ולהחליפו טריים בינוניים PS-74656 degassed הנפח הכולל של 1 מ"ל בצינור microfuge.
   7. להחזיר את התאים מהצינור באר בצלחת תרביות רקמה 24-. טוב.

3. הערכה של התא פנוטיפי בידול באמצעות מיקרוסקופ של תאים בתרבית Anaerobically

1. בעוד בבית הבליעה אנאירובית, למקם את הצלחת בקופסה לסגירה חוזרת סמוקות עם תערובת גז אנאירובית ולסגור את תיבת.
   הערה: תיבת להכיל במגבת נייר לחה כדי לספק לחות ולמנוע את הצלחת ממנו להתייבש. מיקרוסקופ, בשקיות סנדוויץ עובד הכי טוב מאז שהם דקים.
   1. כדי לבחון את התאים במיקרוסקופ, לחלוטין לסגור את התיק, להסיר אותו מן החדר.
   2. בזהירות למתוח את שקית הניילון יניף, בוחנים תאים באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב הפוך עם הקובץ המצורף מצלמה ולקחת photomicrographs-הגדלה שונות.
   3. להחזיר את הצלחת בשקית אטומה לתא ולהמשיך הדגירה כפי שמתואר בשלב 2.3.3.
   4. כדי לנתח בנפרד התאים runagate הם ההשעיה, בצע את השלבים המתוארים שלב 2.3.5.
      הערה: תאים אלה יכולים לשמש לאחר מכן לבדיקה אירובי או שאפשר יהיה להחזיר את תא אנארובי לבדיקה של אוכלוסייה מסוימת זו.

תוצאות

הכוח של פרוטוקול זה שקרים תמיכתה תוחלת החיים וגידול של שורות תאים מרובים, ההכרה כי יש שינוי מעמיק עם סטייה מורפולוגיה תא²⁵. האלמנט הקריטי ביותר של מחקר זה היא העברת תחזוקת התאים תחת anaerobiosis קפדנית. פעולה זו דורשת תא אנארובי מאורגנת על מנת למקסם את הפרוטוקול (

Discussion

שיטה זו מייצגת בפעם הראשונה בתרבית של תאים היו תרבותי לתקופות ממושכות של זמן בהעדר חמצן. על סמך תצפיות הנוכחי, הצמיחה אנאוקסיים יכולת דרך שביל fermentative נראה אוניברסלי בין תאים בתרבית של שורות²⁸, שבו הגידול אנאירובית, גרמו פנוטיפ גאוס. זה נצפתה עבור כל השורות תא נבדק. עם טיפוח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whitney A35 anaerobic chamber	Don Whitley Scientific	Microbiology International	The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator	Fisher Scientific	3531
Tissue Culture Hood	Labconco	DO55735
pipet aid	Drummond	4-000-100
sterile transfer pipets	Santa Cruz	sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes	DOT	451-PG
vaccum jar	Nalgene 111410862889	BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L)	CellGro	10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L)	CellGro	10-014-CV
FBS	VWR	1500-500
HBSS	VWR	20-021-CV
trypsin	VWR	25-052-CI
gentamicin	Gibco	15750-060
sterile pipets	CellTreat	229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150)	Santa Cruz	sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes	DOT	667124
glad ziplock sandwich bags	Ziploc	Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)	Nikon Eclipse	TS100
trypan blue	Invitrogen	T10282
hemocytometer	Invitrogen	C10283
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000
Rainin microtiter pipets	Mettler Toledo	Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips	Santa Cruz Biotechnology	sc-213233 & sc-201717
test tube rack (50cc tubes)	The Lab Depot	HS29050A
sodium nitrite	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids	Rosti Mepal	Rubber maid
paper towels	In House
cell scraper	CellTreat	229310
PBS	In house prepared
70% Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5
microcentrifuge tubes sterile	Santa Cruz	sc-200273
biohazard bags with holder (desktop)	Heathrow Scientific	HS10320
Nitrile Gloves	VWR	89428
oxygen electrode	eDAQ	EPO354
pH meter	Jenway	3510
pH paper/ pHydrion	Sigma Aldich	Z111813