哺乳類セルラインの嫌気性成長と維持

要約

ここでは、確立されたセルラインの嫌気の長期培養を可能にする新しい手法について述べる。テストされた最大生存期間は 17 日です。このメソッドは、細胞毒性薬のテストと、anoxically 複製細胞の生理機能の探索に適しています。

要約

腫瘍と幹細胞ニッチにおける中点と共に最も粘膜表面が無酸素体の地理的な領域です。先行研究により平地 (空気 5% CO₂ ) で孵化が示す低酸素または限られた可能性 (2-3 日) で無酸素インキュベーション (遊離酸素の不在) 結果続く条件 (低酸素のレベル)。小説の方法論は、(少なくとも 17 日; 最大時間テスト) の無酸素の培養を可能にする開発されました。この手法の最も重要な側面は、システムに酸素が生じないことを確認することです。これは、脱ガス、メディア、フラッシュ チューブや料理、フラスコ、ピペット、嫌気性ガスの混合物 (H₂CO₂N₂) と無酸素 (無酸素) 環境に釣り合うために材料を許可することによって続いてによって得られる使用する前に。ときに得られる顕微鏡写真には、成果物が含まれていないことを確認するため顕微鏡写真を取得、追加のケアを行使しなければなりません。酸素のない場合は、細胞の形態を大幅に変更します。嫌気成長のすべてのセルの 2 つの異なる型が記載されています。成長し、酸素のない状態で哺乳類の細胞を維持する能力は、細胞生理学、モデルの相互作用、および小説がん新薬開発の生合成経路の特性の解析に適用できます。

概要

固形腫瘍、幹細胞ニッチと粘膜の表面を裏から細胞が低酸素レベル、無酸素^1,2,3、4を含む環境で存在します。通常の生理学的状態の酸素は低酸素血症低酸素 (酸素の完全な欠如)^5,6のそれを越える異なります。大気中の酸素に悪影響哺乳類細胞複製劣化酸素条件下での in vitro細胞成長を最適化できる実現は、1970 年代初頭に報告されました。リヒターら⁷は、酸素レベル (低酸素) の 1-3% が大気中の酸素 (20%) と比較してめっき効率を高めることを示した。ヒト二倍体細胞の寿命は、低酸素培養条件⁸にも拡張されます。

酸素店が劣化 (例えば、激しい運動中に)生体内で、低酸素の条件が発生する発酵 (嫌気呼吸) に好気性の呼吸からの骨格筋における ATP の生産をスイッチにより前記の乳酸⁹の最終製品。悪性腫瘍、内部の病理、腫瘍の質量は貧しい血管新生による無酸素に低酸素¹⁰。義務づける嫌気性菌¹によって植民地化腫瘍インテリアで腫瘍内部に限られた血流の影響は独立して検証します。機械論的に、低酸素の腫瘍細胞の生存は、低酸素誘導因子 1 α 遺伝子の発現に依存すると考えられる (HIF1-アルファ)、低酸素^4,11初期の自発的な応答であります。^,12. HIF1-アルファ、 HIF1をバインド熱ショックタンパク質に起因する低酸素の条件の下で-アルファ プロモーターと遺伝子転写¹²活性を上昇させる。これら熱ショック蛋白質は腫瘍低酸素環境で見られる様々 な表現型の誘導を支援するためと考えられています。これらの表現型は、細胞膜糖輸送担体の発現増加と解糖系 (Warburg 効果)¹³の率を表わします。その結果、乳酸発酵するミトコンドリアの酸化的リン酸化からスイッチです。

無酸素の生存はまた生存現象^14,15をサポートするグルコースに選択肢を利用できます。最高の学び哺乳類の例はほくろのラットは、果糖駆動糖発酵経路¹⁴を介して酸素なしにほぼ 20 分間生き残ることができます。特定の魚の代替の適応が発生します (例えば、大幅に長く生き残ることができる鯉 [フナsp] の期間にターミナルの副産物としてエタノールと解糖系を使用して)¹⁵。両方のケースで発酵は酸素のない状態での生存を可能に代謝を駆動します。無酸素の生存のための現在の仮説は、長い間HIF1として-¹⁶嫌気的条件下で発生する酸素の必要性なしに、低酸素症、ミトコンドリア呼吸時にアルファがアクティブします。さらに、細胞は細胞生存¹⁷に有害であることを証明できる酸化ストレスを避けるので発酵経路の低酸素・無酸素の生存のための使用が腫瘍の生存率を高めることを仮定します。この仮説は、心筋、低酸素血症が腫瘍細胞¹⁷は、酸化ストレスを減少させることを示す最近の研究によってサポートされます。

日には、無酸素の哺乳類細胞の生存のための発酵経路の本質染み付いている文献、ため、できないこと 3 日以上酸素の完全な欠如に哺乳類細胞には、大部分の。しかし、細菌の嫌気性の生存のためには、解糖系の代わりに発生します。ある特定の細菌の窒素または硫酸 (他の化合物) の間では、酸素¹⁸の不在のチトクロム酸化酵素システムのターミナル電子アクセプターとして使用できます。ミトコンドリアが細胞にエネルギーを提供する 154 万 2000 年^{19 海の酸素化前に、の最後の普遍的な共通の祖先から分岐後並行発生した細菌や真核生物の進化が推定されています。}.研究者は、分離ミトコンドリアがターミナル電子アクセプターとして亜硝酸の酸素の存在下で ATP を作り出すことができることを示しているので細胞が酸素のない状態で 3 日間よりも長い期間にわたって機能すると仮定するが妥当です。^20,21,22,23. 本研究の方法論は多数の細胞の嫌気性の哺乳類細胞の成長のためのユーティリティ。

プロトコル

1. 様々 な哺乳類細胞の嫌気性培養メディアを準備します。

1. 無酸素細胞文化²⁵の完全な PS 74656 培地を作る。
   1. 50 mL の脱イオン水の亜硝酸イオンの 17.25 g を溶解して滅菌亜硝酸原液 (100 x; 5 M) をし、それを殺菌するためにフィルターします。
   2. 110 mg/l L-グルタミン, ピルビン酸ナトリウムと 10% 牛胎児血清の 584 mg/L の低血糖 DMEM (ブドウ糖 1 g/L) の 50 mL あたり亜硝酸原液 0.5 mL を追加 (FBS; 熱不活化)。
      注: FBS 濃度の有毒である 10% より大きいを使用します。テスト 1 つの癌細胞株は、注意、亜硝酸 (MDA MB 231、乳房癌細胞株) メディアの低い耐性を持っていたおよび、したがって、亜硝酸の不在で育った。さらに、PS 74656 媒体が調べたすべての細胞の成長をサポートされています (n = 9)、特定の細胞 (例えば、Vero 細胞) 細胞濃度が高いと高グルコース (4.5 g/L) DMEM で PS 74656 で高い生存率を展示²⁵。
   3. 滅菌 50 mL の円錐形遠心チューブに培地 20 mL を配置します。キャップを締めていません。それは緩いはずです。
   4. 解消ガス媒体で真空ベルジャーのチューブを配置することによって、約 45 ° の角度、媒体の表面積を最大化します。
   5. 部屋の温度で真空ポンプまたは同等のものを使用して真空を適用します。泡はもはや観察されない (24-48 h) までの真空を維持します。
   6. 瓶からチューブを削除し、すぐに中への空気の導入を最小限に抑えるためにチューブをシール、キャップを閉じます。
   7. 商業の嫌気性チャンバーにチューブを置きます。
   8. チューブ キャップを緩めます、少なくとも 24 のチャンバーで嫌気性ガスの混合物の平衡にチューブの大気を許可します。
      注: それが尽きるまで媒体を商工会議所でなければなりません。チューブ フラッシュ プロセスをスピードアップするため無菌転送ピペットを使用して無酸素ガスの混合物で、少なくとも 3 倍は N、CO₂H₂から成っている無酸素ガスでいっぱい_2.
   9. ドガのすべてのチューブ (10-15 分) チューブをシールし、商工会議所に配置する前に上記のように嫌気性チャンバーに配置されます。使用前に 1.5-2 mL 転送ピペットを使用して嫌気性ガス混合物でそれをフラッシュまたは無酸素とフラッシュされているピペット チップ ガスの少なくとも 3 倍。
   10. 嫌気性チャンバー中に無菌脱マイクロ遠心チューブに媒体の 100 μ L を取り外してチャンバ内酸素プローブを使用して溶存酸素のそれをテストします。
       注: 使用する前に製造元のプロトコルあたり酸素電極を校正します。正しく脱と釣合い嫌気性ガス混合メディアの測定値は、0 です。
       注意: 測定値は 0.3 ppm の酸素を超えている場合、は、媒体を平衡により多くの時間が必要なので、嫌気性チャンバー内のメディアをインキュベートに進みます。

2. 無酸素栽培様々 な哺乳類細胞株の

1. 指定日-1
   1. 3 24 ウェル プレート (80% 合流) の細胞の十分な数を提供するために、無酸素と比較文化コントロールの 90% 合流 T150 フラスコ細胞 (37 ° C、5% CO₂) に拡張します。
      注: この研究では、hela 細胞 229 および Vero 細胞が使用されました。このプロトコルはまたテストされ、成長と 7 他のセル行の²⁵の維持の成功した証明しました。
   2. 吸引フラスコからメディアを取り出して、HBSS の 10 mL で洗います。
   3. 5 ml のトリプシンのメディアを交換してください。セルを視覚的にプラスチックからデタッチするまでフラスコを揺り動かしなさい。、トリプシンのほとんどを吸引し、付着性のセルを除去するフラスコをタップします。高グルコース DMEM の 10-15 mL を追加 (グルコースの 4.5 g/L、110 mg/L L-グルタミン、10% の FBS、ゲンタマイシンの 50 μ g/mL)、トリプシンを不活化します。
   4. すべての細胞塊が中断されるまでに 25 mL のピペットを使用してセルをカップ刻んだ。
   5. セルをカウントし、標準検定とトリパン ブルー色素排除法または自動化された同等を使用しての生存率を決定します。
   6. 10⁵セル/mL x 2.24 の細胞密度に前述高グルコース DMEM でセルを中断します。
   7. 24 ウェル培養プレートの井戸に細胞懸濁液の 1 mL を追加 (2.24 10⁵細胞/ウェル x; 80% 合流)。無酸素の文化とコントロールによる文化の種子 1 プレート。
   8. 37 ° c 24 時間の培養条件 (5% CO₂) で細胞を孵化させなさい。
      注: セルは様々 な広い板にめっきすることが。ただし、フラスコで無酸素成長細胞を播種酸素導入のリスク システムにしない限り実行されます注意を払っても大気中のガスを完全に洗い流す。
2. 指定日 0
   1. 平地培養 24 時間後嫌気性チャンバー (商業嫌気性チャンバー; に無酸素の成長のためプレートを配置します。図 1)。
   2. 嫌気性チャンバーに 24 h の順応されて抗生物質無料デ熟れた PS 74656 媒体媒体をすぐに変更します。湿ったタオルでコンテナーにプレートを置き、疎の水分を維持するためにそれを閉じます。
      注: 平地成長板は、すべての治療法は、大気条件下で行われる例外と同じ処理されます。
3. 指定日 1
   1. 嫌気培養の日 1 は 80% N₂10% の CO₂10% H₂の標準的な嫌気性ガスの混合物が含まれている商業嫌気性チャンバー内培養 24 時間後に開始します。
   2. さまざまな期間のセルを孵化させなさい。
   3. 時間の経過とともに色の変化のための嫌気性媒体を監視します。
      注: 赤オレンジからマゼンタの色シフト信号媒体を変更する時間です。発生するまで 2 週間かかるでしょう。赤オレンジ黄色に培地の色ずれは、細菌汚染の存在を示します。
   4. 中は赤からマゼンタに変化したときは、吸引して無宿者セルを削除します。
   5. 脱、嫌気性ガスの無宿者のセルと吸気の使用済みメディアの場所平衡 microfuge の管、シールが、安全性し、遠心分離 (326 gx; 10 分室温で) それらを確認しながらチューブを閉じます。すぐに井戸に吸気のメディアを新しい脱 PS 74656 培地 1 mL に置き換えます。
   6. それを開く前に嫌気性チャンバーに播種細胞および microfuge の管を配置します。使用済み培地を吸引し、新鮮な脱 PS 74656 媒体および microfuge の管に 1 ml の容量にそれを置き換えます。
   7. 24 ウェル培養プレートのウェルにチューブからセルを返します。

3. 嫌気培養細胞の顕微鏡観察による形質細胞分化の評価

1. 嫌気性チャンバー中に嫌気性ガス混合物でフラッシュ ジッパーのついた箱にプレートを置き、ボックスを閉じます。
   注: ボックスは、水分を提供し乾燥からプレートを防ぐため少し湿らせたペーパー タオルを含める必要があります。顕微鏡、サンドイッチ袋は薄いのでベストを働かせます。
   1. 顕微鏡下で細胞を観察するには、完全に袋を密封、商工会議所から取り外します。
   2. 慎重に板の上にビニール袋を伸ばす、カメラの添付ファイルと逆の位相差顕微鏡を使用してセルを調べて、様々 な倍率での顕微鏡写真を取る。
   3. 室に密封された袋のプレートを戻り、2.3.3 の手順で説明するように孵化を続けます。
   4. 懸濁液にある無宿者セルを別々 に分析するには、手順 2.3.5 に示した手順に従います。
      注: これらの細胞は好気性をテストするため使用できます。 または嫌気性チャンバーこの人口の特定のテストのために返すことができます。

結果

このプロトコルの強さには、長寿と複数の細胞の成長のサポートと深遠な変化と細胞形態²⁵の発散があることの認識があります。この研究の最も重要な要素は、転送と厳密な嫌気下で細胞の維持です。これは、嫌気性チャンバー構成プロトコル (図 1) を最大化する顕微鏡または他のテストのいずれかのセルが削除される保証は?...

ディスカッション

このメソッドは、酸素のない状態で長期間培養初めて哺乳類セルを表します。現在の観測に基づいて、無酸素成長機能を介して非発酵的経路嫌気性成長が表現型の相違で起因した哺乳類細胞ラインの²⁸日間で普遍的なようであります。これはテストしたすべての細胞の観察されました。嫌気培養細胞の比率を増やす丸くなった、懸濁液のような人口を開発し、レプリ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whitney A35 anaerobic chamber	Don Whitley Scientific	Microbiology International	The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator	Fisher Scientific	3531
Tissue Culture Hood	Labconco	DO55735
pipet aid	Drummond	4-000-100
sterile transfer pipets	Santa Cruz	sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes	DOT	451-PG
vaccum jar	Nalgene 111410862889	BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L)	CellGro	10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L)	CellGro	10-014-CV
FBS	VWR	1500-500
HBSS	VWR	20-021-CV
trypsin	VWR	25-052-CI
gentamicin	Gibco	15750-060
sterile pipets	CellTreat	229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150)	Santa Cruz	sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes	DOT	667124
glad ziplock sandwich bags	Ziploc	Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)	Nikon Eclipse	TS100
trypan blue	Invitrogen	T10282
hemocytometer	Invitrogen	C10283
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000
Rainin microtiter pipets	Mettler Toledo	Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips	Santa Cruz Biotechnology	sc-213233 & sc-201717
test tube rack (50cc tubes)	The Lab Depot	HS29050A
sodium nitrite	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids	Rosti Mepal	Rubber maid
paper towels	In House
cell scraper	CellTreat	229310
PBS	In house prepared
70% Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5
microcentrifuge tubes sterile	Santa Cruz	sc-200273
biohazard bags with holder (desktop)	Heathrow Scientific	HS10320
Nitrile Gloves	VWR	89428
oxygen electrode	eDAQ	EPO354
pH meter	Jenway	3510
pH paper/ pHydrion	Sigma Aldich	Z111813