La croissance anaérobie et l’entretien de lignées cellulaires de mammifères

Résumé

Nous décrivons ici une nouvelle méthode qui permet la culture anaérobie à long terme de lignées cellulaires établies. Le temps de survie maximale qui a été testé est de 17 jours. Cette méthode convient pour les essais des agents cytotoxiques et explorer la physiologie de réplication des cellules anoxically.

Résumé

Plus les surfaces muqueuses ainsi que les milieux dans les tumeurs et les cellules souches niches sont des régions géographiques du corps qui sont anoxiques. Les études précédentes montrent que l’incubation dans normoxique (5 % CO₂ dans l’air) ou hypoxique conditions (faibles teneurs en oxygène) suivies par une incubation anoxiques (l’absence d’oxygène libre) des résultats en viabilité limitée (2 à 3 jours). Une nouvelle méthodologie a été développée qui permet une culture de cellules anoxiques (au moins 17 jours ; durée maximale testée). L’aspect le plus important de cette méthodologie est de s’assurer qu’aucun oxygène n’est introduit dans le système. Ceci est obtenu par le dégazage des médias et de tubes de chasse d’eau, vaisselle, flacons et pipettes avec un mélange de gaz anaérobie (H₂, CO₂, N₂) suivie en autorisant les matériaux s’équilibrer à l’environnement anoxique de la (non-oxygène) avant son utilisation. Soins supplémentaires doivent être exercé lorsque les photomicrographies acquérir pour s’assurer que les micrographies obtenus ne contiennent pas d’artefacts. En l’absence d’oxygène, la morphologie des cellules est significativement altérée. Deux types morphologiques distincts sont remarquables pour toutes les cellules cultivées en anaérobiose. La capacité de développer et maintenir des cellules de mammifères en l’absence d’oxygène peut être appliquée à l’analyse de la physiologie cellulaire, les interactions polymicrobienne et la caractérisation des voies biosynthétiques pour le développement de médicaments nouveaux de cancer.

Introduction

Il existe des cellules de tumeurs solides, les niches de cellules souches et les revêtement des surfaces muqueuses dans les environnements qui connaissent les teneurs en oxygène réduite, y compris l’anoxie^1,2,3,4. Dans les États physiologiques normales, oxygénation varie en outre de l’hypoxie d’anoxie (l’absence totale d’oxygène)^5,6. La réalisation que l’oxygène atmosphérique affecte négativement la réplication des cellules de mammifères et que la croissance cellulaire in vitro peut être optimisée sous conditions appauvri en oxygène a été signalée dans les années 1970. Richter et al. ⁷ a montré que 1 à 3 % du taux d’oxygène (hypoxie) amélioré placage à l’efficacité par rapport à l’oxygène atmosphérique (20 %). La durée de vie de cellules diploïdes humaines est également prolongée dans les conditions de culture hypoxique⁸.

In vivo, des conditions hypoxiques surviennent lorsque les réserves d’oxygène sont épuisés (par exemple, pendant l’exercice intense), dans laquelle la production d’ATP est activée dans le muscle squelettique de la respiration aérobie de fermentation (respiration anaérobie) avec la produit de l’acide lactique,⁹. Pathologiquement, dans les tumeurs cancéreuses, l’intérieur de la tumeur, la masse est hypoxique à anoxiques en raison de la mauvaise vascularisation¹⁰. L’effet de la perfusion limitée sur les intérieurs de la tumeur est indépendamment validé par des intérieurs de tumeur colonisées par des bactéries anaérobies obligatoires¹. Mécaniquement, la survie des cellules tumorales en hypoxie est considérée comme dépendant uniquement de l’expression du gène alpha-1 facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF1-alpha), qui est la première réponse spontanée à une hypoxie^{4,11 , 12}. HIF1-alpha est induite dans des conditions hypoxiques par des protéines de choc thermique qui lient la HIF1-promoteur alpha et réguler positivement la transcription de gène¹². Ces protéines de choc thermique sont soupçonnés d’aide dans l’induction des phénotypes différents dans le microenvironnement hypoxique de la tumeur. Ces phénotypes présentent une expression accrue des membrane cellulaire des transporteurs de glucose et le taux de glycolyse (l’effet Warburg)¹³. Il en résulte une commutation de la phosphorylation oxydative mitochondriale de lactate fermentation.

Survie anoxique peut utiliser également des solutions de rechange au glucose pour soutenir la survie phénomène^14,15. Le meilleur exemple de mammifères étudié est le rat-taupe, qui peuvent survivre pendant presque 20 minutes sans oxygène par une voie de fermentation glycolytique pilotée par le fructose¹⁴. Une autre adaptation se produit dans certains poissons (p. ex., carpe [Carassius SP.], qui peut survivre pendant nettement plus longtemps périodes à l’aide de glycolyse avec de l’éthanol comme le sous-produit terminal)¹⁵. Dans les deux cas, la fermentation lecteurs le métabolisme qui permet la survie en l’absence d’oxygène. L’hypothèse actuelle pour la survie anoxique est que si longtemps HIF1-alpha est activé pendant l’hypoxie, la respiration mitochondriale, sans le besoin d’oxygène, se produit dans des conditions anaérobies,¹⁶. En outre, il est postulé que l’utilisation d’une voie fermentaire pour la survie hypoxique/anoxique améliore la survie de la tumeur puisque les cellules éviter le stress oxydatif qui pourrait s’avérer préjudiciable à la survie de cellule¹⁷. Ce postulat est supporté par une étude récente qui montre que dans les cardiomyocytes, hypoxie réduit le stress oxydatif, placé sur la cellule de tumeur¹⁷.

A ce jour, la nature essentielle d’une voie fermentaire pour la survie des cellules de mammifères anoxique a été enracinée dans la littérature, sont dus, en grande partie, à une incapacité de cellules de mammifères en culture en l’absence totale d’oxygène pendant plus de 3 jours. Toutefois, une alternative à la glycolyse pour la survie anaérobie se produit chez les bactéries. Dans certaines bactéries, l’azote ou sulfate (parmi d’autres composés) peut servir comme accepteurs d’électrons pour le système cytochrome oxydase en l’absence de l’oxygène¹⁸. Bien que l’évolution des bactéries et des eucaryote ont eu lieu en parallèle depuis divergeant du dernier ancêtre commun universel, on estime que les mitochondries ont été fournir l’énergie aux cellules 1,542 millions d’années avant l’oxygénation des Océans¹⁹ . Étant donné que les chercheurs ont montré que les mitochondries isolées peuvent produire de l’ATP en l’absence d’oxygène, avec nitrite comme accepteur terminal d’électron, il est raisonnable de supposer que les cellules pouvaient fonctionner pendant une période supérieure à 3 jours en l’absence d’oxygène ^{20 , 21 , 22 , 23}. la méthodologie décrite dans la présente étude a une utilité pour la croissance des cellules de mammifères anaérobie de nombreuses lignées cellulaires.

Protocole

1. préparer les milieux pour Culture anaérobie de diverses lignées cellulaires de mammifères

1. Rendre le milieu PS-74656 complet pour une culture de cellules anoxiques²⁵.
   1. Faire la solution stérile de nitrite (5 M ; x 100) en dissolvant 17,25 g de nitrite dans 50 mL d’eau distillée désionisée, puis filtrer pour stériliser.
   2. Ajouter 0,5 mL de la solution mère de nitrite par 50 mL de faible concentration de glucose DMEM (1 g/L de glucose) avec 110 mg/L de L-glutamine, 584 mg/L de pyruvate de sodium et 10 % sérum de veau fœtal (SVF ; inactivés par la chaleur).
      Remarque : L’utilisation de FBS concentrations supérieures à 10 % sont toxiques. À noter, une lignée de cellules cancéreuses testée avait une faible tolérance pour les médias avec nitrite (MDA-MB-231, lignée cellulaire de cancer du sein) et, ainsi, a été cultivée en l’absence de nitrite. En outre, bien que le PS-74656 milieu a permis la croissance de toutes les lignées cellulaires qui ont été testées (n = 9), certaines lignées de cellules (par exemple, les cellules Vero) présentaient des concentrations plus élevées de cellule et une viabilité supérieure en PS-74656 avec hyperglycémie (4,5 g/L) DMEM ²⁵.
   3. Dans un tube à centrifuger conique stérile de 50 mL, placer 20 mL de milieu. Ne pas serrer le bouchon ; Il devrait être lâche.
   4. Dé-gaz le milieu en plaçant le tube dans une cloche de verre sous vide à un angle d’environ 45 °, pour maximiser la surface moyenne.
   5. Appliquer le vide à l’aide d’une pompe à vide, ou son équivalent, à température ambiante. Maintenir le vide jusqu'à ce que les bulles sont observées n’est plus (24 à 48 h).
   6. Enlever le tube du pot et fermer immédiatement le bouchon, étanchéité du tube afin de minimiser l’introduction d’air dans le milieu.
   7. Placer le tube dans la chambre de commerce anaérobie.
   8. Desserrer le bouchon du tube et laisser l’atmosphère dans le tube s’équilibrer avec celle du mélange gaz anaérobie dans la chambre pendant au moins 24 h.
      NOTE : Le support doit rester dans la chambre jusqu'à ce qu’il est épuisé. Pour accélérer le processus, ras du tube au moins 3 x avec le mélange de gaz anoxiques à l’aide d’une pipette stérile rempli de gaz anoxique, qui consiste H₂, CO₂et N_2.
   9. Une solution contenant tous les tubes (10 à 15 min) placés dans la chambre anaérobie comme décrit ci-dessus avant de sceller le tube et en introduisant dans la chambre. Avant utilisation, rincer avec le mélange de gaz anaérobie à l’aide de pipettes de transfert de 1,5 à 2 mL ou pointes de pipette qui ont été rincées avec anoxique de gaz au moins 3 x.
   10. Alors que dans la chambre anaérobie, enlever 100 µL de milieu dans un tube stérile de micro-centrifugeuse dégazé et testez-le pour l’oxygène dissous à l’aide d’une sonde d’oxygène dans la chambre.
       Remarque : La sonde à oxygène est calibrée par protocole avant toute du fabricant utilisation. Lectures des médias mélange gaz anaérobie correctement dégazée et équilibré sont des 0.
       ATTENTION : Si les lectures sont supérieure à 0,3 ppm d’oxygène, continuer à incuber les médias dans la chambre anaérobie car il faut plus de temps pour équilibrer le milieu.

2. anoxique culture de diverses lignées cellulaires de mammifères

1. Jour désigné -1
   1. La croissance de cellules (37 ° C, 5 % de CO₂) dans une fiole de T150 au confluent de 90 % pour le contrôle de la culture anoxique et normoxique fournir un nombre suffisant de cellules pour trois plaques 24 puits (confluence de 80 %).
      Remarque : Pour cette étude, les cellules HeLa 229 et Vero ont été utilisés. Ce protocole a été aussi testé et s’est révélé fructueux pour la croissance et le maintien de sept autres lignées cellulaires²⁵.
   2. Retirer le support de la fiole par aspiration et lavez-le avec 10 mL de HBSS.
   3. Remplacez le support par 5 mL de trypsine. Agiter le ballon jusqu'à ce que les cellules se détachent visuellement de la matière plastique. Aspirer la majeure partie de la trypsine, puis appuyez sur le flacon pour déloger les cellules adhérentes. Ajouter 10 à 15 mL d’hyperglycémie DMEM (4,5 g/L de glucose, de 110 mg/L de L-glutamine, 10 % FBS, 50 µg/mL de gentamicine) pour inactiver la trypsine.
   4. Triturer les cellules à l’aide d’une pipette 25 mL jusqu'à ce que tous les amas de cellules sont perturbées.
   5. Compter les cellules et déterminer la viabilité à l’aide de l’hémocytomètre standard et la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan ou l’équivalent automatisé.
   6. Suspendre les cellules dans l’hyperglycémie DMEM comme mentionné ci-dessus, à une densité de 2,24 x 10⁵ cellules/mL.
   7. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de culture de tissus de 24 puits (2,24 x 10⁵ cellules/puits ; confluence de 80 %). 1 assiette pour la culture anoxique et l’autre pour une culture de normoxique contrôle les semences.
   8. Incuber les cellules à 37 ° C dans des conditions normoxiques (5 % CO₂) pendant 24 h.
      Remarque : Les cellules peuvent être plaqués dans diverses plaques de bonne tailles. Cependant, les cellules anoxiques croissance dans des flacons de l’ensemencement risque de l’introduction d’oxygène dans le système, sauf si les précautions nécessaires sont prises pour éliminer complètement les gaz atmosphérique.
2. Désigné jour 0
   1. Après 24h de l’incubation normoxique, placer les plaques de croissance anoxique dans la chambre anaérobie (une chambre anaérobie commerciale ; La figure 1).
   2. Remplacez immédiatement le milieu antibiotique hors gazés PS-74656 milieu libre qui a été acclimaté pendant 24 h à la chambre anaérobie. Placer la plaque dans un récipient avec un linge humide et fermer vaguement pour maintenir l’humidité.
      Remarque : Les plaques de croissance normoxique sont gérées identique sauf que tous les traitements sont réalisés dans des conditions atmosphériques.
3. Désigné jour 1
   1. 1 jour de l’incubation anaérobie commence après 24 h de l’incubation dans la chambre de commerce anaérobie qui contient le mélange de gaz anaérobie standard de 10 % H₂, 10 % CO₂et 80 % N₂.
   2. Incuber les cellules pendant diverses périodes de temps.
   3. Surveiller le milieu anaérobie pour le changement de couleur au fil du temps.
      Notez : Un changement de couleur de rouge-orange à magenta indique le temps de changer le support. Cela peut prendre jusqu'à 2 semaines à se produire. Un changement de couleur dans le milieu du rouge-orangé au jaune indique la présence d’une contamination bactérienne.
   4. Lorsque le milieu passe du rouge au magenta, supprimer les cellules fléau par aspiration.
   5. Place les médias usés aspirés avec les cellules de fléau en gaz dégazé et anaérobie équilibrés de microtubes, fermer les tubes tout en s’assurant que le joint est sécurisé et puis centrifuger eux (326 x g; à température ambiante pendant 10 min). Remplacez immédiatement les médias aspirés dans le puits avec 1 mL de milieu de PS-74656 dégazé nouvelle.
   6. Placer le tube à centrifuger avec cellules de granulés dans la chambre anaérobie avant de l’ouvrir. Aspirer le milieu usé et le remplacer par un milieu PS-74656 dégazé frais pour un volume total de 1 ml dans le tube à centrifuger.
   7. Retourner les cellules du tube dans un puits de la plaque de culture de tissus de 24 puits.

3. évaluation de la différenciation phénotypique cellulaire au microscope des cellules cultivées en anaérobiose

1. Alors que dans la chambre anaérobie, placer la plaque dans une boîte refermable rincée avec le mélange de gaz anaérobie et fermer la boîte.
   Remarque : La boîte doit contenir une serviette de papier humide pour fournir l’humidité et empêcher le plat ne se dessèchent pas. Pour la microscopie, les sacs à sandwich fonctionnent le mieux car ils sont minces.
   1. Pour observer les cellules au microscope, complètement sceller le sac et retirez-la de la chambre.
   2. Étirer le sac en plastique sur la plaque, examiner soigneusement les cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé avec l’accessoire pour appareil photo et prendre photomicrographies à différents grossissements.
   3. Retourner la plaque dans le sac scellé à la chambre et poursuivre l’incubation comme indiqué au point 2.3.3.
   4. Pour analyser séparément les cellules fléau qui sont en suspension, suivez la procédure décrite à l’étape 2.3.5.
      Remarque : Ces cellules peuvent ensuite être utilisés pour le test aérobie ou peuvent être retournés à la chambre anaérobie pour les essais de cette population spécifique.

Résultats

La force du présent protocole réside dans sa prise en charge de la longévité et la croissance de plusieurs lignées cellulaires et dans la reconnaissance qu’il y a une altération profonde et la divergence dans la morphologie de cellules²⁵. L’élément le plus critique de cette étude est le transfert et l’entretien des cellules dans des conditions anaérobies strictes. Cela exige une chambre anaérobie organisés pour maximiser le protocole (

Discussion

Cette méthode représente la première fois des cellules de mammifères qui ont été cultivés pendant une période prolongée de temps en l’absence d’oxygène. Se fondant sur les observations actuelles, la croissance anoxique capacité via une voie non fermentatif semble être universelle parmi les cellules de mammifères lignes²⁸, où la croissance anaérobie entraîné divergence de phénotype. Cela a été observée pour toutes les lignées cellulaires testées. Avec la culture ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whitney A35 anaerobic chamber	Don Whitley Scientific	Microbiology International	The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator	Fisher Scientific	3531
Tissue Culture Hood	Labconco	DO55735
pipet aid	Drummond	4-000-100
sterile transfer pipets	Santa Cruz	sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes	DOT	451-PG
vaccum jar	Nalgene 111410862889	BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L)	CellGro	10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L)	CellGro	10-014-CV
FBS	VWR	1500-500
HBSS	VWR	20-021-CV
trypsin	VWR	25-052-CI
gentamicin	Gibco	15750-060
sterile pipets	CellTreat	229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150)	Santa Cruz	sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes	DOT	667124
glad ziplock sandwich bags	Ziploc	Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)	Nikon Eclipse	TS100
trypan blue	Invitrogen	T10282
hemocytometer	Invitrogen	C10283
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000
Rainin microtiter pipets	Mettler Toledo	Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips	Santa Cruz Biotechnology	sc-213233 & sc-201717
test tube rack (50cc tubes)	The Lab Depot	HS29050A
sodium nitrite	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids	Rosti Mepal	Rubber maid
paper towels	In House
cell scraper	CellTreat	229310
PBS	In house prepared
70% Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5
microcentrifuge tubes sterile	Santa Cruz	sc-200273
biohazard bags with holder (desktop)	Heathrow Scientific	HS10320
Nitrile Gloves	VWR	89428
oxygen electrode	eDAQ	EPO354
pH meter	Jenway	3510
pH paper/ pHydrion	Sigma Aldich	Z111813