혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수

요약

여기, 우리는 설립된 셀 라인의 혐 기성 장기 재배를 가능 하 게 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 테스트는 최대의 생존 시간은 17 일 이다. 이 메서드는 세포 독성 대리인의 테스트 및 anoxically 세포 복제의 생리학 탐험에 적합 합니다.

초록

대부분 점 막 표면 종양에 줄기 세포 벽 중간점 함께 무산 소는 신체의 지리적 영역이 있습니다. 이전 연구 결과 부 화 normoxic (5% CO₂ 공기에서)에 또는 hypoxic (낮은 산소 수준) 조건 제한 가능성 (2-3 일)에 무산 소 인큐베이션 (자유로운 산소의 부재) 결과 옵니다. 새로운 방법론은 (적어도 17 일, 최대 시간 테스트)에 대 한 무산 소 세포 배양을 가능 하 게 개발 되었다. 이 방법론의 가장 중요 한 측면 산소 시스템에 도입 하는 것입니다. 이 기체 제거 미디어, 그리고 세 정 튜브, 요리, 플라스 크, 및 혐 기성 가스 혼합물 (H₂, CO₂, N₂)와 함께 펫 자료 무산 소 (산소) 환경에 equilibrate를 허용 하 여 뒤에 의해 얻어진 다 이전에 사용. 현미경 얻은 아티팩트를 포함 하지 않도록 하려면 photomicrographs 인수 하는 경우 추가 관리를 행사 해야 합니다. 산소의 부재에서 셀 형태학 크게 변경 됩니다. 두 가지 morphotypes anaerobically 성장 하는 모든 셀에 대 한 설명 되어 있습니다. 성장 하 고 산소의 부재에 포유류 세포를 유지 하는 능력의 세포 생리학, polymicrobial 상호 작용, 그리고 소설 암 약물 개발에 대 한 생 합성 통로의 특성 분석에 적용할 수 있습니다.

서문

고체 종양, 줄기 세포 벽 감, 안 감 점 막 표면 세포 anoxia^1,2,,34를 포함 하 여 감소 산소 수준, 경험 하는 환경에 존재 한다. 정상 생리 상태에서 산소 anoxia (산소의 완전 한 부재)^5,6산소 보다 다릅니다. 대기 산소는 포유류 세포 복제에 부정적인 영향을 미치는 그 체 외에서 세포 성장이 고갈된 산소 조건에서 최적화 될 수 있습니다 실현 1970 년대 초반에 보고 되었다. 리히터 외. ⁷ 1-3% 산소 수준 (hypoxia)의 대기 산소 (20%) 도금 효율 향상을 보여주었다. 인간 2 중 세포 수명 또한 hypoxic 문화 조건⁸에 확장 됩니다.

Vivo에서, hypoxic 조건이 발생할 때 산소 매장 고갈 (예를 들어를 강렬한 운동 동안)와 함께 발효 (혐 기성 호흡) 호 기성 호흡에서 골격 근육에 ATP 생산은 전환 하는 점에서 젖 산⁹의 최종 제품. 병 적, 암 종양, 내부에에서는 종양의 질량은 산소 가난한 vascularization 인해 무산 소를¹⁰. 종양 내부에 제한 된 관류의 효과 독립적으로 유효성을 검사 하지 종양 인테리어 의무 anaerobes¹에 의해 식민지에 의해. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 1 알파 유전자의 표현에 전적으로 종속 hypoxia에서 종양 세포 생존은 생각 하는 mechanistically, (HIF1-알파), 산소^4,11 초기 자발적인 응답은 ^{, 12}. HIF1-알파 hypoxic 조건 하에서 HIF1를 바인딩할 열 충격 단백질에 의해 유도 된다-알파 발기인 및 upregulate 유전자 전사¹². 이 열 충격 단백질 종양 hypoxic microenvironment에서 본 다양 한 고기의 유도에 도움으로 추정 된다. 이 고기 세포 막 포도 당 운송업의 증가 표현과 분해 (바르 부르 크 효과)¹³의 속도 전시 한다. 결과 발효 젖이 나올를 미토 콘 드 리아 산화 인 산화에서 스위치입니다.

무산 소 생존 또한 대안 생존 현상^14,15를 지원 하기 위해 포도 당을 활용할 수 있습니다. 최고의 공부 포유류입니다 두더지 쥐과 당 구동 glycolytic 발효 통로¹⁴통해 산소 없이 거의 20 분 동안 살아남을 수 있습니다. 특정 생선에 발생 하는 다른 적응 (예를 들어, 훨씬 더 이상 살아남을 수 있는 잉어 [떡 sp.], 기간 터미널 부산물로 에탄올 분해를 사용 하 여)¹⁵. 두 경우 모두, 발효 드라이브 활성화 산소의 부재에서 생존 하는 대사. 무산 소 생존에 대 한 현재 가설은 오랫동안으로 HIF1-알파¹⁶혐 기성 조건 발생 하는 산소에 대 한 필요 없이 hypoxia, 미토 콘 드리 아 호흡 하는 동안 활성화 됩니다. 또한, 그것은 가정 하는 hypoxic/무산 소 생존을 위한 발효 경로 사용 하 여 셀 셀 생존¹⁷에 해로운 증명할 수 있는 산화 스트레스 방지 이후 종양 생존을 향상. 이 공준 cardiomyocytes에서 hypoxia 종양 세포¹⁷에 배치 하는 산화 스트레스 감소를 보여주는 최근 연구에 의해 지원 됩니다.

날짜 하려면, 무산 소 포유류 세포 생존에 대 한 발효 통로의 본질은 되었습니다에 배어 든 문학, 인해, 3 일 이상 산소의 완전 한 부재에 문화 포유류 세포의 무 능력에 큰 부분에서. 그러나, 혐 기성 생존을 위한 분해 대신 박테리아에서 발생합니다. 특정 박테리아에 질소 또는 황산 (다른 화합물) 중 산소¹⁸시 토 크롬 산화 효소 시스템 부재에 대 한 터미널 전자 수락자로 사용할 수 있습니다. 세균과 진 핵 진화 마지막 보편적인 일반적인 조상에서 분기 이후 병렬로 발생, 비록 미토 콘 드리 아 1.542 백만 년 전에 바다^{19의 산소 세포에 에너지를 제공 했다 추정 된다} . 연구원은 고립 된 미토 콘 드리 아 터미널 전자 수락자로 아 질산염으로 산소의 부재에서 ATP를 생성할 수 있다 나타났습니다 그것 이므로 세포 산소의 부재에 3 일 이상 기간에 대 한 기능 수를 가정 하는 합리적 ^{20 , 21 , 22 , 23}.이 연구에서 설명 하는 방법론은 수많은 셀 라인의 혐 기성 포유류 세포 성장에 대 한 유틸리티.

프로토콜

1. 다양 한 포유류 세포 라인의 혐 기성 문화에 대 한 미디어 준비

1. 무산 소 셀 문화²⁵에 대 한 완전 한 PS 74656 매체를 확인 합니다.
   1. 아 질산염 이온 증류수 50 ml에서의 17.25 g을 용 해 하 여 살 균 아 질산염 재고 솔루션 (5 M; 100 배)를 확인 한 다음 그것을 소독 필터.
   2. 110 mg/l L-글루타민, 나트륨 pyruvate 그리고 10% 태아 둔감 한 혈 청의 584 mg/L의 낮은 포도 DMEM (1 g/L의 포도 당)의 50 mL 당 아 질산염 재고 솔루션의 0.5 mL을 추가 (FBS; 열 비활성화).
      참고: FBS 농도 10%는 독성 보다 큰 사용 합니다. 메모의 한 암 세포 라인 테스트 아 질산염 (MDA-MB-231, 유 방 암 세포 선)와 미디어에 대 한 낮은 내성을 했 그리고, 따라서, 아 질산염의 부재에서 성장 했다. 또한, PS 74656 매체 지원 테스트 모든 셀 라인의 성장 (n = 9), 특정 셀 라인 (예를 들어, Vero 세포) 전시 높은 세포 농도 높은 포도 당 (4.5 g/L) DMEM과 PS-74656에서 더 높은 생존 능력 ²⁵.
   3. 살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 매체의 20 mL를 배치 합니다. 모자; 강화 하지 마십시오 그것은 느슨하게 해야 합니다.
   4. 진공 벨 항아리에 튜브를 삽입 하 여 탈 가스 매체는 약 45 ° 각도, 중간 영역을 최대화 하기 위해.
   5. 실 온에서 진공 펌프 또는 해당을 사용 하 여 진공을 적용 합니다. 거품은 더 이상 (24-48 h) 관찰 때까지 진공을 유지 합니다.
   6. 항아리에서 튜브를 제거 하 고 즉시 매체에 공기의 도입을 최소화 하기 위해 튜브 씰링 뚜껑을 닫습니다.
   7. 상업적인 혐 기성 챔버에 튜브를 놓습니다.
   8. 튜브 캡을 풉니다 하 고 적어도 24 h에 대 한 챔버에 혐 기성 가스 혼합물의 equilibrate를 튜브에 분위기를 허용 합니다.
      참고: 매체 있어야 챔버에 때까지 그것 사용 합니다. 튜브 플러시 프로세스를 속도 대 한 살 균 전송 피 펫을 사용 하 여 무산 소 가스 혼합물과 적어도 3 배 H₂, CO₂, 그리고 N 구성 된 무산 소 가스로 가득 차_2.
   9. 모든 튜브 (10-15 분) 튜브 씰링과 챔버에 배치 하기 전에 위에서 설명한 대로 혐 기성 챔버에 배치 드 사용 하기 전에, 1.5-2 mL 전송 펫을 사용 하 여 혐 기성 가스 혼합물으로 그것을 플러시 또는 무산 소를 플러시는 피 펫 팁 가스 적어도 3 배.
   10. 혐 기성 챔버에 살 균 degassed 마이크로 원심 관에 매체의 100 µ L을 제거 하 고 산소 프로브를 사용 하 여 챔버 내에 용 존된 산소에 대 한 테스트.
       참고: 산소 전극은 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜 사전 당 보정 됩니다. 제대로 degassed equilibrated 혐 기성 가스 혼합 미디어의 수치는 0입니다.
       주의: 수치는 산소의 0.3 ppm 이상, 계속 equilibrate 매체에 더 많은 시간 필요 이므로 혐 기성 챔버에 미디어를 품 어.

2. 무산 소 재배 다양 한 포유류 세포 라인의

1. 지정 된 날-1
   1. T150 플라스 크에 세 24-잘 접시 (80% 합류)에 대 한 세포의 충분 한 번호를 제공 하는 무산 소 및 normoxic 문화 컨트롤에 대 한 90% 합류 (37 ° C, 5% CO₂) 세포를 성장.
      참고:이 연구를 위해 헬러 229과 Vero 세포 사용 되었다. 이 프로토콜은 또한 테스트 하 고 성장 및 7 다른 셀 라인²⁵의 유지 보수에 대 한 성공을 증명 했다.
   2. 포부에 의해 플라스 크에서 매체를 제거 하 고 HBSS의 10 mL와 함께 그것을 씻어.
   3. 5 mL의 트립 신 매체를 바꿉니다. 셀은 시각적으로 플라스틱에서 분리 될 때까지 플라스 크를 교 반 하십시오. 트립 신의 대부분 발음 다음 꺼내 부착 세포를 플라스 크를 누릅니다. 높은 포도 DMEM의 10-15 mL을 추가 (4.5 g/L의 포도 당, L-글루타민, 10%의 110 mg/L FBS, gentamicin의 50 µ g/mL) 비활성화는 트립 신을.
   4. 모든 세포 덩어리는 중단 될 때까지 25 mL 피 펫을 사용 하 여 셀 triturate
   5. 셀을 계산 하 고 표준 hemocytometer 고 trypan blue 염료 제외 방법 또는 자동된에 해당 하는 사용 하 여 생존을 결정 합니다.
   6. 10⁵ 셀/mL x 2.24의 셀 밀도를 위에서 언급 한 대로 높은 포도 당 DMEM 셀을 일시 중단 합니다.
   7. 24-잘 조직 배양 접시의 우물에 세포 현 탁 액 1 mL를 추가 (10⁵ 셀/잘 x 2.24; 80% 합류). 무산 소 문화와 다른 제어 normoxic 문화에 대 한 종자 1 접시.
   8. 24 h에 대 한 normoxic 조건 (5% CO₂) 37 ° C에서 세포를 품 어.
      참고: 셀 다양 한 잘 크기의 접시에 도금 될 수 있다. 그러나, 플라스 크에서 무산 소 성장에 대 한 셀을 시드 위험을 실행 산소의 소개의 시스템으로, 치료 대기 가스를 플러시 완전히 행사 하지 않는 한.
2. 지정된 일 0
   1. Normoxic 외피의 24 h 후 혐 기성 챔버 (상업 혐 기성 챔버;에 무산 소 성장에 대 한 번호판을 배치 그림 1)입니다.
   2. 즉시 항생제 무료 드 기름된 PS 74656 매체는 혐 기성 챔버를 24 h에 대 한 acclimated 되었습니다 매체를 변경 합니다. 젖은 수건으로 컨테이너에 접시를 놓고 느슨하게 수 분을 유지 하기 위해 그것을 닫습니다.
      참고: normoxic 성장 위한 접시는 동일 하 게 모든 치료 대기 조건 하에서 행해진다 예외 처리 됩니다.
3. 지정된 일 1
   1. 혐 기성 배양의 1 일 10% H₂, 10%의 CO₂, 그리고 80% N₂의 표준 혐 기성 가스 혼합물을 포함 하는 상업 혐 기성 챔버에 외피의 24 시간 후 시작 합니다.
   2. 다양 한 기간에 대 한 셀을 품 어.
   3. 시간이 지남에 따라 색 변경에 대 한 혐 기성 매체를 모니터링 합니다.
      참고: 마젠타 레드-오렌지에서 색상 변화 신호 매체를 변경 하는 시간. 이 발생 2 주까지 걸릴 수 있습니다. 노랑 빨강 주황색에서 매체에 색상 변화 세균 오염 물질의 존재를 나타냅니다.
   4. 매체 마젠타 레드에서 변경 때 포부에 의해 runagate 셀을 제거 합니다.
   5. 장소 degassed 혐 기성 가스에서 runagate 셀 aspirated 보냈다 미디어 equilibrated microfuge 관, 인감, 안전 하 고 그들 (326 gx; 10 분 동안 실내 온도에) 원심 튜브 닫습니다. 즉시 우물에 있는 발음된 미디어를 바꿉니다 새로운 degassed PS 74656 매체의 1 mL.
   6. 그것을 열기 전에 혐 기성 챔버에 수송과 셀 microfuge 관을 넣습니다. 보낸된 중간 발음 하 고 신선한 degassed PS 74656 매체 microfuge 관에 1 ml의 총 볼륨을 바꿉니다.
   7. 튜브에서 24-잘 조직 문화 접시에 잘 셀을 반환 합니다.

3. Anaerobically 배양된 세포의 현미경에 의해 Phenotypic 세포 분화의 평가

1. 혐 기성 챔버에 접시 혐 기성 가스 혼합물으로 플러시 resealable 상자에 놓고 상자를 닫습니다.
   참고: 상자 습기를 제공 하 고 밖으로 건조에서 접시를 방지 젖은 종이 타월을 포함 해야 합니다. 이후 그들은 얇은 현미경 검사 법, 샌드위치 가방 최고 작동.
   1. 현미경 세포 관찰, 완전히 가방을 봉인 하 고 상공에서 그것을 제거 합니다.
   2. 조심 스럽게 접시 위에 비닐 봉투를 스트레칭, 카메라 부착으로 거꾸로 단계 대조 현미경을 사용 하 여 셀을 검토 하 고 다양 한 배율에서 photomicrographs를 받아.
   3. 실로, 봉인된 봉투에 접시를 반환 하 고는 인큐베이션 단계 2.3.3에서에서 설명한 대로 계속.
   4. 별도로 runagate 세포 현 탁 액에 있는 분석, 2.3.5 단계에서 설명 하는 단계를 따릅니다.
      참고: 이러한 셀 에어로빅 테스트에 사용할 수 있습니다 또는이 특정 인구의 테스트에 대 한 혐 기성 챔버에 반환 될 수 있습니다.

결과

이 프로토콜의 강점 장 수 및 여러 셀 라인의 성장 지원 및 깊은 변경 및 셀 형태학²⁵에서 분기는 인식입니다. 이 연구의 가장 중요 한 요소는 전송 및 엄격한 anaerobiosis 아래 세포의 유지 보수입니다. 이 혐 기성 챔버를 프로토콜 (그림 1)을 극대화 하기 위해 조직과 셀 현미경 또는 다른 테스트에 대 한 제거 하는 보증 된 환경에서 보?...

토론

이 메서드는 산소의 부재에서 시간의 연장된 기간에 대 한 교양 했다 처음 포유류 세포를 나타냅니다. 현재 관측을 바탕으로는 무산 소 성장 기능을 통해 비 발효 통로 나타납니다 포유류 세포 라인²⁸, 사이 보편적인 혐 기성 성장 형 분기에서 결과. 이 테스트는 모든 셀 라인에 대 한 관찰 되었다. 혐 기성 경작 셀의 비율을 증가 되었다 둥근, 서 스 펜 션 같은 인구 개발과 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whitney A35 anaerobic chamber	Don Whitley Scientific	Microbiology International	The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator	Fisher Scientific	3531
Tissue Culture Hood	Labconco	DO55735
pipet aid	Drummond	4-000-100
sterile transfer pipets	Santa Cruz	sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes	DOT	451-PG
vaccum jar	Nalgene 111410862889	BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L)	CellGro	10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L)	CellGro	10-014-CV
FBS	VWR	1500-500
HBSS	VWR	20-021-CV
trypsin	VWR	25-052-CI
gentamicin	Gibco	15750-060
sterile pipets	CellTreat	229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150)	Santa Cruz	sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes	DOT	667124
glad ziplock sandwich bags	Ziploc	Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)	Nikon Eclipse	TS100
trypan blue	Invitrogen	T10282
hemocytometer	Invitrogen	C10283
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000
Rainin microtiter pipets	Mettler Toledo	Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips	Santa Cruz Biotechnology	sc-213233 & sc-201717
test tube rack (50cc tubes)	The Lab Depot	HS29050A
sodium nitrite	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids	Rosti Mepal	Rubber maid
paper towels	In House
cell scraper	CellTreat	229310
PBS	In house prepared
70% Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5
microcentrifuge tubes sterile	Santa Cruz	sc-200273
biohazard bags with holder (desktop)	Heathrow Scientific	HS10320
Nitrile Gloves	VWR	89428
oxygen electrode	eDAQ	EPO354
pH meter	Jenway	3510
pH paper/ pHydrion	Sigma Aldich	Z111813