Anaerobe Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine neue Methode, die den anaeroben langfristige Anbau von etablierten Zelllinien ermöglicht. Die maximale Überlebenszeit, die getestet wurde ist 17 Tage. Diese Methode eignet sich für die Prüfung von Zytostatika und Erforschung der Physiologie der anoxically Zellen repliziert.

Zusammenfassung

Die meisten Schleimhaut-Oberflächen zusammen mit den Mittelpunkten in Tumoren und Stammzell-Nischen sind geographische Bereiche des Körpers, die anoxischen sind. Bisherige Studien zeigen, dass die Inkubation in Inklusieve (5 % CO₂ in Luft) oder hypoxischen Bedingungen (niedrige Sauerstoffniveaus) gefolgt von einer anoxischen Inkubation (fehlender freier Sauerstoff) Ergebnisse in begrenzte Lebensfähigkeit (2 – 3 Tage). Eine neuartige Methode wurde entwickelt, eine anoxische Zellkultivierung (für mindestens 17 Tage, die maximale Zeit getestet). Der wichtigste Aspekt dieser Methodik soll sicherstellen, dass kein Sauerstoff in das System eingeführt wird. Dies ergibt sich durch das Ausgasen von Medien und durch Spülung Röhren, Gerichte, Fläschchen und Pipetten mit einem anaeroben Gasgemisch (H₂, CO₂, N₂) gefolgt von schönem zu equilibrate der anoxischen (Sauerstoff) Umwelt Materialien vor dem Gebrauch. Zusätzliche Sorgfalt muss beim Erwerb von Mikrofotos um sicherzustellen, dass die Aufnahmen erhalten keine Artefakte enthalten. In Abwesenheit von Sauerstoff ist Zellmorphologie erheblich verändert. Zwei unterschiedliche morphotypen sind für alle anaerob wachsen Zellen festgestellt. Die Fähigkeit zu wachsen und zu pflegen Säugerzellen in Abwesenheit von Sauerstoff kann zur Analyse der Zellphysiologie, Biofilm-Interaktionen und die Charakterisierung von biosynthetischen Bahnen für neuartige Wirkstoffforschung angewendet werden.

Einleitung

Zellen von soliden Tumoren, Stammzell-Nischen und die Auskleidung der Schleimhaut-Oberflächen gibt es in Umgebungen, in denen geringere Sauerstoffgehalt, darunter Anoxie^1,2,3,4erleben. In normalen physiologischen Staaten variiert Sauerstoffversorgung jenseits der Hypoxie, Sauerstoffmangel (das völlige Fehlen von Sauerstoff)^5,6. Die Erkenntnis, dass Luftsauerstoff säugerzelle Replikation beeinträchtigt und das Zellwachstum in-vitro- Bedingungen abgereichertem Sauerstoff optimiert werden kann wurde in den frühen 1970er Jahren berichtet. Richter Et al. ⁷ zeigten, dass 1 – 3 % der Sauerstoffsättigung (Hypoxie) Beschichtung gegenüber Luftsauerstoff (20 %) gesteigert. Die menschliche diploide Zelle Lebensdauer ist auch in der Kultur hypoxischen Bedingungen⁸verlängert.

In Vivo, hypoxische Bedingungen auftreten, wenn Sauerstoff speichert abgereichertem (z. B.bei intensivem Training), wobei die ATP-Produktion in der Skelettmuskulatur von Atmung auf Gärung (anaerobe Atmung) mit ausgeschaltetem der Endprodukt Milchsäure-⁹. Pathologisch, in Krebstumoren, das Innere des Tumors Masse ist, aufgrund der schlechten Vaskularisation anoxischen hypoxischen¹⁰. Die Wirkung der begrenzten Durchblutung auf Tumor Innenräume wird unabhängig vom Tumor Innenräume kolonisiert durch obligat Anaerobier¹überprüft. Mechanistisch, Tumor Zelle Überleben in Hypoxie wird angenommen, dass die Expression des Gens Hypoxie-induzierbare Faktor 1-Alpha allein abhängig (HIF1-Alpha), das ist die erste spontane Reaktion auf Hypoxie^{4,11 , 12}. HIF1-Alpha wird durch HITZESCHOCKPROTEINE, die HIF1binden unter hypoxischen Bedingungen induziert-alpha Promoter und Upregulate gen Transkription¹². Diese HITZESCHOCKPROTEINE werden geglaubt, um die Induktion der verschiedenen Phänotypen gesehen in den Tumor hypoxischen Mikroumgebung zu unterstützen. Diese Phänotypen weisen einen erhöhten Ausdruck der Zellmembran Glukose-Transporter und die Rate der Glykolyse (Warburg-Effekt)¹³. Das Ergebnis ist ein Wechsel von Mitochondrien Oxidative Phosphorylierung zu Laktat-Gärung.

Anoxischen überleben kann auch Alternativen zu Glukose zu überleben Phänomen^14,15Unterstützung nutzen. Die untersuchte Säugetiere Beispiel ist der Maulwurf Ratte, die für fast 20 Minuten ohne Sauerstoff durch eine Fruktose-driven glykolytischen Gärung Weg¹⁴überleben können. Eine alternative Anpassung tritt in bestimmten Fisch (z.B.Karpfen [Carassius SP.], die deutlich länger überleben können Zeiträume mit Glykolyse mit Ethanol als das terminal Nebenprodukt)¹⁵. In beiden Fällen treibt die Gärung den Stoffwechsel, so dass das Überleben in der Abwesenheit von Sauerstoff. Die aktuelle Hypothese anoxischen überlebenswichtig ist, dass so lange als HIF1-Alpha ist bei Hypoxie, mitochondriale Atmung aktiviert, ohne die Notwendigkeit für Sauerstoff, tritt unter anaeroben Bedingungen¹⁶. Darüber hinaus wird postuliert, dass die Verwendung von fermentative Weg für hypoxische/anoxischen überleben Tumor überleben verbessert, da die Zellen oxidativen Stress, die könnte vermeiden sich nachteilig auf die Zelle überleben¹⁷. Dieses Postulat wird unterstützt durch eine kürzlich durchgeführte Studie zeigt, dass in Kardiomyozyten, Hypoxie den oxidativen Stress auf den Tumor Zelle¹⁷platziert senkt.

Bis heute hat die essentielle Natur eines fermentative Signalwegs für anoxischen Säugetier-Zelle Überleben in der Literatur, im großen Teil auf die Unfähigkeit, Kultur Säugerzellen in das völlige Fehlen von Sauerstoff für mehr als 3 Tage schon tief verwurzelt. Allerdings tritt eine Alternative zum Überlebenskampf der anaeroben Glykolyse in Bakterien. In bestimmten Bakterien dient Stickstoff oder Sulfat (unter anderen Verbindungen) als terminal Elektronen Akzeptoren für das Cytochrom-Oxidase-System in der Abwesenheit von Sauerstoff-¹⁸. Obwohl die bakterielle und Eukaryotische Evolution parallel seit der letzte universelle gemeinsame Vorfahr abweichende aufgetreten, wird geschätzt, dass Mitochondrien Energie Zellen 1,542 Millionen Jahre bevor die Sauerstoffversorgung der Ozeane^{19 bereitstellten} . Da Forscher haben gezeigt, dass die isolierte Mitochondrien ATP in der Abwesenheit von Sauerstoff zu Nitrit als das terminal Elektron Akzeptor produzieren können, ist es vernünftig anzunehmen, dass Zellen über einen Zeitraum länger als 3 Tage in der Abwesenheit von Sauerstoff funktionieren könnte ^{20 , 21 , 22 , 23}. in dieser Studie beschriebene Methode hat ein Dienstprogramm für die anaerobe Säugetier-Zelle Wachstum von zahlreichen Zelllinien.

Protokoll

1. bereiten Sie Medien für anaerobe Kultur von verschiedenen Säugetieren Zelllinien

1. Das komplette PS-74656 Medium für eine anoxische Zelle Kultur²⁵zu machen.
   1. Die sterile Nitrit-Stammlösung (5 M; 100 X) durch 17,25 g Nitrit in 50 mL destilliertem, entionisiertem Wasser auflösen und dann Filtern Sie, um sie zu sterilisieren.
   2. 0,5 mL der Nitrit-Stammlösung pro 50 mL niedrige Glukose DMEM (1 g/L Glukose) mit 110 mg/L von L-Glutamin, 584 mg/L Natrium Pyruvat und 10 % fötalen Rinderserum hinzufügen (FBS; Hitze-inaktivierten).
      Hinweis: Die Verwendung von FBS-Konzentrationen größer als 10 % giftig sind. Der Hinweis ein Krebs-Zell-Linie getestet hatte eine geringe Toleranz für Medien mit Nitrit (MDA-MB-231, Brust-Krebs-Zell-Linie) und wurde somit in das Fehlen von Nitrit angebaut. Darüber hinaus obwohl PS-74656 Medium unterstützt das Wachstum von allen Zelllinien, die getestet wurden (n = 9), bestimmte Zelllinien (z.B. Vero-Zellen) ausgestellt, höhere Konzentrationen der Zelle und eine höhere Rentabilität im PS-74656 mit hoher Glucose (4,5 g/L) DMEM ²⁵.
   3. Platz 20 mL des Mediums in einem sterilen 50 mL konische Zentrifugenröhrchen. Ziehen Sie die Kappe nicht; Es sollte locker sein.
   4. De-Gas das Medium indem man den Schlauch in ein Vakuum Glasglocke auf einem ca. 45° Winkel, um die mittlere Fläche zu maximieren.
   5. Wenden Sie ein Vakuum, das mit einer Vakuum-Pumpe oder eines gleichwertigen Dokuments bei Raumtemperatur. Behalten Sie das Vakuum bis Bläschen (24 – 48 h) nicht mehr eingehalten werden.
   6. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Glas und sofort schließen Sie die Kappe Abdichtung der Röhre um das Eindringen von Luft in das Medium zu minimieren.
   7. Legen Sie das Rohr in der anaeroben Handelskammer.
   8. Lösen Sie die Rohr-Kappe und ermöglichen Sie die Atmosphäre in der Röhre, mit der der anaeroben Gasgemisch in die Kammer für mindestens 24 h equilibrate.
      Hinweis: Das Medium sollte in der Kammer verbleiben, bis es aufgebraucht ist. Für die Beschleunigung des Prozesses, bündig des Rohrs mindestens 3 X mit der anoxischen Gasgemisch mit einer sterilen transferpipette gefüllt mit anoxischen Gas, bestehend aus H₂, CO₂und N_2.
   9. Entgasen Sie alle Rohre (10-15 min) in den anaeroben Raum gelegt, wie oben beschrieben, bevor das Rohr Abdichten und Platzierung in der Kammer. Vor dem Gebrauch spülen Sie es mit der anaeroben Gasgemisch mit 1,5-2 mL Transfer Pipetten oder Pipettenspitzen, die mit anoxischen geleert wurden gas-mindestens 3 X.
   10. Während in der anaeroben Kammer entfernen Sie 100 µL des Mediums in ein steriles Röhrchen für entgastes Mikro-Zentrifuge und testen Sie es für den gelösten Sauerstoff mit einer Sauerstoff-Sonde innerhalb der Kammer.
       Hinweis: Die Sauerstoff-Elektrode ist pro des Herstellers Protokoll vor dem Gebrauch kalibriert. Lesungen der richtig entgast und ausgewogenen anaeroben Gas Mischung Medien sind 0.
       Achtung: Wenn die Messwerte über 0,3 ppm Sauerstoff sind, weiterhin die Medien in der anaeroben Kammer inkubieren, da mehr Zeit für das Medium equilibrate erforderlich ist.

(2) anoxischen Anbau von verschiedenen Säugetieren Zelllinien

1. Bestimmten Tag-1
   1. Zellen (37 ° C, 5 % CO₂) in einem T150 Kolben bis 90 % Zusammenfluss zur anoxischen und Inklusieve Kultur Steuerung für drei 24-Well-Platten (80 % Zusammenfluss) eine ausreichende Anzahl von Zellen zu wachsen.
      Hinweis: Für diese Studie wurden HeLa 229 und Vero-Zellen verwendet. Dieses Protokoll wurde auch getestet und erwies sich als erfolgreich für das Wachstum und die Aufrechterhaltung der sieben anderen Zelle Linien²⁵.
   2. Entfernen Sie das Medium aus der Flasche durch Absaugen und waschen Sie es mit 10 mL HBSS.
   3. Ersetzen Sie das Medium mit 5 mL Trypsin. Schütteln Sie die Flasche bis die Zellen aus dem Kunststoff optisch trennen. Aspirieren Sie die meisten der Trypsin, tippen Sie auf die Flasche um adhärenten Zellen verdrängen. Fügen Sie 10 – 15 mL hohe Glukose DMEM (4,5 g/L Glukose, 110 mg/L von L-Glutamin, 10 % FBS, 50 µg/mL von Gentamicin), die Trypsin zu inaktivieren.
   4. Genannte die Zellen mit einen 25-mL-Pipette, bis alle Klumpen der Zelle gestört werden.
   5. Zählen der Zellen und die Lebensfähigkeit der standard Hemocytometer und die Trypan blauen Farbstoff Ausgrenzung Methode oder das automatisierte Äquivalent zu bestimmen.
   6. Aussetzen Sie die Zellen in der hohen Glukose DMEM, wie bereits erwähnt, eine Zelldichte von 2,24 x 10⁵ Zellen/mL.
   7. Fügen Sie 1 mL Zellsuspension in die Vertiefungen einer Gewebekultur 24-Well-Platte (2,24 x 10⁵ Zellen/Well; 80 % Zusammenfluss). Samen 1 Platte für die anoxischen Kultur und eine andere für eine Kontrollkultur Inklusieve.
   8. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in Inklusieve Bedingungen (5 % CO₂) für 24 h.
      Hinweis: Die Zellen können in verschiedenen gut dimensionierte Platten beschichtet. Jedoch läuft die Zellen für anoxischen Wachstum in Korbflaschen Aussaat das Risiko einer Einschleppung von Sauerstoff in das System, es sei denn Vorsicht geboten ist, um atmosphärische Gas komplett ausspülen.
2. Bestimmten Tag 0
   1. Legen Sie nach 24 h Inkubation Inklusieve die Platten für den anoxischen Wachstum in der anaeroben Kammer (eine anaerobe Handelskammer; ( Abbildung 1).
   2. Sofort ändern Sie das Medium in antibiotikafreien de vergast PS-74656 Medium, welches für 24 h zur anaeroben Kammer gewöhnt worden. Legen Sie die Platte in einen Behälter mit einem feuchten Tuch und schließen Sie locker zu, um die Feuchtigkeit zu halten.
      Hinweis: Die Platten für Inklusieve Wachstum sind identisch mit der Ausnahme behandelt, die alle Behandlungen unter atmosphärischen Bedingungen durchgeführt werden.
3. Bestimmten Tag 1
   1. Tag1 der anaerobe Bebrütung beginnt nach 24 h Inkubation in der kommerziellen anaeroben Kammer enthält die standard anaeroben Gasgemisch von 10 % H₂, 10 % CO₂und 80 % N₂.
   2. Inkubieren Sie die Zellen für verschiedene Zeiträume.
   3. Überwachung der anaeroben Mediums für die farbliche Veränderung im Laufe der Zeit.
      Hinweis: Eine Farbverschiebung von rot-Orange, Magenta signalisiert die Zeit, um das Medium zu ändern. Dies kann auftreten, bis zu 2 Wochen dauern. Eine Farbverschiebung im Medium von rot-Orange bis gelb zeigt das Vorhandensein der bakteriellen Kontamination.
   4. Wenn das Medium von rot, Magenta wechselt, entfernen Sie Runagate Zellen durch Aspiration.
   5. Ort der angesaugten abgebrannten Medien mit den Runagate Zellen in entgast und anaerobe Gas equilibriert Microfuge Röhren, in der Nähe der Rohre gleichzeitig sicherstellen, dass die Dichtung sicher ist, und anschließend sie (326 x g; bei Raumtemperatur für 10 min zentrifugieren). Sofort ersetzen Sie die angesaugten Medien im Brunnen mit 1 mL des neuen entgast PS-74656 Medium.
   6. Legen Sie das Microfuge Rohr mit gebeizte Zellen in der anaeroben Kammer vor dem Öffnen. Aspirieren der abgebrannten Mediums und ersetzen Sie es mit frischen entgast PS-74656 Medium auf ein Gesamtvolumen von 1 ml in der Tube Microfuge.
   7. Die Zellen aus der Tube zu einem Brunnen in der Gewebekultur 24-Well-Platte zurück.

3. Bewertung der phänotypischen Zelldifferenzierung Mikroskopie von anaerob kultivierten Zellen

1. Während in der anaeroben Kammer, die Platte in einer wiederverschließbaren Box mit der anaeroben Gasgemisch gespült und schließen Sie die Box.
   Hinweis: Das Feld muss einem feuchten Papiertuch um Spenden Feuchtigkeit und verhindern das Austrocknen der Plattenrandes enthalten. Für die Mikroskopie Arbeit brötchentüten die beste, da sie dünn sind.
   1. Um die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten, komplett verschließen der Tasche und aus der Kammer zu entfernen.
   2. Sorgfältig die Plastiktüte über die Platte zu dehnen, Zellen mit einem inversen Phase-Kontrast-Mikroskop mit Kamera-Anlage und trifft Vergößerung bei verschiedenen Vergrößerungen.
   3. Die Platte in den versiegelten Beutel an die Kammer zurück, und weiter die Inkubation, wie in Schritt 2.3.3 beschrieben.
   4. Separat die Runagate Zellen zu analysieren, die in der Schwebe sind, führen Sie die Schritte in Schritt 2.3.5.
      Hinweis: Diese Zellen können dann aerobic zu Testzwecken verwendet werden oder zur anaeroben Kammer für die Prüfung dieser spezifischen Bevölkerung zurückgegeben werden können.

Ergebnisse

Die Stärke dieses Protokolls unterstützt die Langlebigkeit und das Wachstum von mehreren Zelllinien und in der Erkenntnis, dass es eine tiefgreifende Veränderung und Divergenz in der Zelle Morphologie²⁵. Das wichtigste Element dieser Studie ist die Übertragung und die Pflege der Zellen unter strenger anaerobiose. Dies erfordert eine anaerobe Kammer organisiert, um das Protokoll (Abbildung 1) zu maximieren und die Gewissheit, dass d...

Diskussion

Diese Methode stellt erstmals Säugetier-Zellen, die für längere Zeit in Abwesenheit von Sauerstoff gezüchtet wurden. Basierend auf aktuellen Beobachtungen, scheint der anoxischen Wachstum Fähigkeit über einen nicht fermentative Weg universal unter Säugerzellen Linien²⁸, wo führte die anaerobe Wachstum Phänotyp Divergenz. Dies war für alle Zelllinien getestet beobachtet. Mit dem anaeroben Anbau wachsenden Ausmaßes der Zellen wurde abgerundet, entwickelt eine Aussetzung-wie Bevö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whitney A35 anaerobic chamber	Don Whitley Scientific	Microbiology International	The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator	Fisher Scientific	3531
Tissue Culture Hood	Labconco	DO55735
pipet aid	Drummond	4-000-100
sterile transfer pipets	Santa Cruz	sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes	DOT	451-PG
vaccum jar	Nalgene 111410862889	BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L)	CellGro	10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L)	CellGro	10-014-CV
FBS	VWR	1500-500
HBSS	VWR	20-021-CV
trypsin	VWR	25-052-CI
gentamicin	Gibco	15750-060
sterile pipets	CellTreat	229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150)	Santa Cruz	sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes	DOT	667124
glad ziplock sandwich bags	Ziploc	Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)	Nikon Eclipse	TS100
trypan blue	Invitrogen	T10282
hemocytometer	Invitrogen	C10283
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000
Rainin microtiter pipets	Mettler Toledo	Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips	Santa Cruz Biotechnology	sc-213233 & sc-201717
test tube rack (50cc tubes)	The Lab Depot	HS29050A
sodium nitrite	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids	Rosti Mepal	Rubber maid
paper towels	In House
cell scraper	CellTreat	229310
PBS	In house prepared
70% Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5
microcentrifuge tubes sterile	Santa Cruz	sc-200273
biohazard bags with holder (desktop)	Heathrow Scientific	HS10320
Nitrile Gloves	VWR	89428
oxygen electrode	eDAQ	EPO354
pH meter	Jenway	3510
pH paper/ pHydrion	Sigma Aldich	Z111813