Crescita anaerobica e la manutenzione di linee cellulari di mammifero

Riepilogo

Qui, descriviamo un nuovo metodo che consente la coltivazione anaerobica a lungo termine di linee cellulari stabilizzate. Il tempo di sopravvivenza massima che è stato testato è di 17 giorni. Questo metodo è adatto per la sperimentazione di agenti citotossici ed esplorare la fisiologia di replicare anoxically cellule.

Abstract

Più superfici mucose insieme i punti medi in tumori e nicchie staminali sono aree geografiche del corpo che sono anossiche. Gli studi precedenti indicano che l'incubazione in condizioni di normossia (5% CO₂ nell'aria) o hypoxic condizioni (bassi livelli di ossigeno) seguirono da un risultati di incubazione anossico (un'assenza di ossigeno libero) nell'attuabilità limitato (2 – 3 giorni). Una nuova metodologia è stata sviluppata che consente una coltura cellulare anossica (per almeno 17 giorni; il tempo massimo testato). L'aspetto più critico di questa metodologia è quello di garantire che nessun ossigeno è stato introdotto nel sistema. Ciò si ottiene il degassamento dei media e di lavaggio tubi, piatti, boccette e le pipette con una miscela di gas anaerobico (H₂, CO₂, N₂) seguita da permettendo i materiali per equilibrare l'ambiente anossico (non-ossigeno) prima dell'uso. Maggiore cura deve essere esercitato quando l'acquisizione di microfotografie per garantire che le micrografie ottenute non contengono artefatti. In assenza di ossigeno, la morfologia delle cellule è alterata significativamente. Due morfotipi distinti sono noti per tutte le cellule coltivate in condizioni aerobiche. La capacità di crescere e mantenere le cellule di mammiferi in assenza di ossigeno può essere applicata all'analisi della fisiologia cellulare, interazioni polimicrobica e la caratterizzazione delle vie biosintetiche per lo sviluppo di farmaci innovarici del cancro.

Introduzione

Le cellule dai tumori solidi, nicchie di cellule staminali e quelle rivestimento superfici mucose presenti in ambienti che sperimentano livelli di ossigeno ridotto, tra cui anossia^1,2,3,4. In condizioni fisiologiche normali, ossigenazione varia oltre quello di ipossia per anossia (la completa assenza di ossigeno)^5,6. La realizzazione che ossigeno atmosferico influisce negativamente sulla replica delle cellule dei mammiferi e tale crescita in vitro delle cellule può essere ottimizzata in condizioni impoverito di ossigeno è stata segnalata nei primi anni 1970. Richter et al. ⁷ ha mostrato che 1 – 3% dei livelli di ossigeno (ipossia) migliorare l'efficienza della placcatura rispetto ad ossigeno atmosferico (20%). La durata della vita umana cellula diploide è esteso anche in condizioni ipossiche cultura⁸.

In vivo, condizioni di ipossia si verificano quando i negozi di ossigeno sono impoverito (ad es., durante l'esercizio intenso), in cui la produzione di ATP è inserita nel muscolo scheletrico da respirazione aerobica alla fermentazione (respirazione anaerobica) con la prodotto finale di acido lattico⁹. Patologico, in tumori cancerosi, all'interno del tumore massa è ipossica a anossico a causa della scarsa vascolarizzazione¹⁰. L'effetto della perfusione limitata all'interno del tumore viene convalidato indipendentemente da interni di tumore colonizzati da anaerobi¹. Meccanicistico, sopravvivenza delle cellule del tumore nell'ipossia è pensata per essere dipendente unicamente sull'espressione del gene di 1 alfa fattore ipossia-inducibile (HIF1-alfa), che è la prima risposta spontanea alla ipossia^{4,11 , 12}. HIF1-alfa è indotta in condizioni di ipossia da proteine dello shock termico che legano il HIF1-alfa promotore e aumentano la trascrizione genica¹². Si ritiene che queste proteine di scossa di calore aiuto nell'induzione dei vari fenotipi visto nel microambiente tumorale ipossica. Questi fenotipi mostrano un incremento dell'espressione dei trasportatori del glucosio della membrana cellulare e il tasso di glicolisi (l'effetto Warburg)¹³. Il risultato è un interruttore da fosforilazione ossidativa mitocondriale di lattato fermentazione.

Anossico sopravvivenza possa anche utilizzare delle alternative a glucosio per sostenere la sopravvivenza fenomeno^14,15. Il miglior esempio di mammiferi studiato è il Ratto talpa, che possono sopravvivere per quasi 20 minuti senza ossigeno attraverso una fermentazione glicolitico fruttosio-driven via¹⁴. Un adattamento alternativo si verifica in alcuni pesci (ad es., carpa [Carassius SP.], che possa sopravvivere per significativamente più lungamente periodi utilizzando glicolisi con etanolo come il sottoprodotto terminale di tempo)¹⁵. In entrambi i casi, fermentazione unità il metabolismo consentendo la sopravvivenza in assenza di ossigeno. L'ipotesi corrente per la sopravvivenza anossico è che così a lungo come HIF1-alfa è attivato durante l'ipossia, la respirazione mitocondriale, senza la necessità di ossigeno, si verifica in condizioni anaerobiche¹⁶. Inoltre, è postulato che l'uso di una via fermentativa per sopravvivenza ipossico/anossico migliora la sopravvivenza del tumore dal momento che le cellule evitare stress ossidativo che potrebbe rivelarsi dannosa per la sopravvivenza delle cellule¹⁷. Questo postulato è supportato da uno studio recente che mostra che in cardiomiociti, ipossia riduce lo stress ossidativo collocato sul tumore cella¹⁷.

Fin qui, la natura essenziale di una via fermentativa per la sopravvivenza della cellula di mammiferi anossico è stata radicata nella letteratura, dovute, in gran parte, ad un'incapacità di cellule di mammifero di cultura in completa assenza di ossigeno per più di 3 giorni. Tuttavia, un'alternativa alla glicolisi per la sopravvivenza anaerobica si verifica nei batteri. In alcuni batteri, azoto o solfato (tra altri composti) può servire come accettori terminali per il sistema del citocromo ossidasi in assenza di ossigeno¹⁸. Sebbene l'evoluzione batterica ed eucariotica è avvenuta in parallelo dal divergenti dall'ultimo antenato comune universale, si stima che i mitocondri sono state fornendo energia alle cellule per 1,542 milioni anni prima l'ossigenazione degli oceani¹⁹ . Poiché i ricercatori hanno indicato che i mitocondri isolati possono produrre ATP in assenza di ossigeno, con nitrito come accettore terminale di elettroni, è ragionevole supporre che le cellule potrebbero funzionare per periodi di tempo più lungo di 3 giorni in assenza di ossigeno ^{20 , 21 , 22 , 23}. la metodologia descritta in questo studio è un programma di utilità per la crescita di cellule di mammifero anaerobica di numerose linee cellulari.

Protocollo

1. preparare supporti per coltura anaerobica di varie linee cellulari di mammifero

1. Rendere il completo supporto di PS-74656 per un cellulare anossica cultura²⁵.
   1. Rendere la soluzione madre di nitrito sterile (5m; 100 x) sciogliendo 17,25 g di nitrito in 50 mL di acqua distillata o deionizzata, quindi filtrare per sterilizzarlo.
   2. Aggiungere 0,5 mL della soluzione madre nitrito per 50 mL di glucosio basso DMEM (1 g/L di glucosio) con 110 mg/L di L-Glutammina, 584 mg/L di sodio piruvato e 10% siero bovino fetale (FBS; inattivati al calore).
      Nota: L'uso di FBS concentrazioni superiore a 10% sono tossici. Della nota, una linea cellulare di cancro testata aveva una bassa tolleranza per i media con il nitrito (MDA-MB-231, linea di cellule di cancro al seno) e, quindi, è stata coltivata in assenza di nitrito. Inoltre, anche se PS-74656 medio sostenuto la crescita di tutte le linee cellulari che sono stati testati (n = 9), alcune linee cellulari (ad es., cellule Vero) hanno esibito le più alte concentrazioni di cellule e una redditività superiore in PS-74656 con alto glucosio (4,5 g/L) DMEM ²⁵.
   3. Posto 20 mL di terreno in una provetta conica sterile 50 mL. Non serrare il tappo; esso dovrebbe essere sciolto.
   4. De-gas medio inserendo il tubo in una campana di vetro vuoto a un angolo di circa 45 °, per massimizzare l'area di superficie media.
   5. Applicare un vuoto utilizzando una pompa a vuoto, o il suo equivalente, a temperatura ambiente. Mantenere il vuoto fino a quando le bolle non sono non più osservate (24-48 h).
   6. Rimuovere il tubo dalla vaschetta e chiudere immediatamente il tappo, il tubo per ridurre al minimo l'introduzione di aria nel mezzo di tenuta.
   7. Inserire il tubo nella camera anaerobica commerciale.
   8. Svitare il tappo del tubo e consentire l'atmosfera nel tubo da equilibrare con quello della miscela gas anaerobico nella camera per almeno 24 h.
      Nota: Il mezzo dovrebbe rimanere nella camera fino ad esaurimento. Per accelerare il processo, a filo il tubo almeno 3 volte con la miscela di gas anossico utilizzando una pipetta sterile riempita di gas anossico, che consiste di N, CO₂e H_22.
   9. Degassare tutte le provette (10 – 15 min) collocate nella camera anaerobica come descritto in precedenza prima di sigillare il tubo e immissione nella camera. Prima dell'uso, lavare con la miscela di gas anaerobica utilizzando pipette di trasferimento di 1,5 – 2 mL o puntali che sono state svuotate con anossico gas almeno 3 volte.
   10. Mentre nella camera anaerobica, rimuovere 100 µ l del mezzo in una provetta sterile da micro-centrifuga degassato e testarlo per l'ossigeno disciolto utilizzando una sonda di ossigeno all'interno della camera.
       Nota: L'elettrodo di ossigeno è calibrato per prima del protocollo del produttore utilizzare. Letture dei media miscela gas anaerobico correttamente degassato ed equilibrato sono 0.
       Attenzione: Se le letture sono superiori a 0,3 ppm di ossigeno, continua a incubare i media nella camera anaerobica poiché è necessario più tempo per equilibrare il medium.

2. anossico coltivazione di varie linee cellulari di mammifero

1. Area giorno -1
   1. Crescere le cellule (37 ° C, 5% CO₂) in un matraccio da T150 alla confluenza del 90% per il controllo di cultura anossico e normoxic fornire un numero sufficiente di cellule per tre piastre da 24 pozzetti (80% confluenza).
      Nota: Per questo studio, le cellule HeLa 229 e Vero sono state usate. Questo protocollo è stato anche testato e ha dimostrato riuscito per la crescita e la manutenzione di sette altre linee cellulari²⁵.
   2. Rimuovere il supporto dal pallone di aspirazione e lavarlo con 10 mL di HBSS.
   3. Sostituire il mezzo con 5 mL di tripsina. Agitare il pallone fino a quando le cellule visivamente staccano dalla plastica. Aspirare la maggior parte della tripsina, quindi tocca il pallone per sloggiare le celle aderenti. Aggiungere 10 – 15 mL di alto glucosio DMEM (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di L-Glutammina, 10% FBS, 50 µ g/mL di gentamicina) per inattivare la tripsina.
   4. Triturare le celle utilizzando una pipetta da 25 mL, fino a quando tutti i grumi di cellule sono interrotti.
   5. Contare le celle e determinare la fattibilità utilizzando l'emocitometro standard e il metodo di esclusione del colorante blu di trypan o l'equivalente automatizzato.
   6. Sospendere le cellule nell'alto glucosio DMEM come accennato in precedenza ad una densità di cella di 2,24 x 10⁵ cellule/mL.
   7. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti (2,24 x 10⁵ cellule/pozzetto; 80% confluenza). 1 piastra per la cultura anossica e un altro per una cultura di normoxic controllo del seme.
   8. Incubare le cellule a 37 ° C in condizioni di normossia (5% CO₂) per 24 h.
      Nota: Le celle possono essere placcate in varie piastre ben dimensionati. Tuttavia, semina le cellule per una crescita anossica in boccette corre il rischio dell'introduzione di ossigeno nel sistema, a meno che la cura è esercitata per scovare completamente gas atmosferici.
2. Giorno designato 0
   1. Dopo 24 h di incubazione normoxic, posizionare le piastre per la crescita anossica nella camera anaerobica (un alloggiamento anaerobico commerciale; Figura 1).
   2. Cambiare immediatamente il mezzo privo di antibiotico de-gasati PS-74656 medio che ha stati acclimatati per 24 h alla camera anaerobica. Posizionare la piastra in un contenitore con un panno umido e chiuderlo senza bloccare per mantenere l'umidità.
      Nota: Le piastre per la crescita in condizioni di normossia sono gestite in modo identico con l'eccezione che tutti i trattamenti avvengono in condizioni atmosferiche.
3. 1 ° giorno designato
   1. 1 ° giorno di incubazione anaerobica inizia dopo 24 h di incubazione nella camera anaerobica commerciale che contiene la miscela di gas anaerobico standard di 10% H₂, 10% CO₂e 80% N₂.
   2. Incubare le cellule per vari periodi di tempo.
   3. Monitorare il mezzo anaerobico per il cambiamento di colore nel tempo.
      Nota: Un cambiamento di colore da rosso-arancio al magenta segnala il momento di cambiare il mezzo. Questo può richiedere fino a 2 settimane per verificarsi. Un cambiamento di colore nel mezzo da rosso-arancio al giallo indica la presenza di una contaminazione batterica.
   4. Quando il mezzo cambia da rosso a magenta, rimuovere le cellule di runagate dall'aspirazione.
   5. Posizionare il supporto di speso aspirato con le cellule di runagate a gas degassato e anaerobica equilibrato microfuge tubi, chiudere i tubi mentre assicurandosi che la guarnizione è sicura e poi centrifugare li (326 x g; a temperatura ambiente per 10 min). Sostituire immediatamente i media aspirati nel pozzo con 1 mL di nuovo mezzo di PS-74656 degassato.
   6. Posizionare il tubo di microfuge con pellettate cellule nella camera anaerobica prima di aprirlo. Aspirare il mezzo esaurito e sostituirlo con mezzo PS-74656 degassato fresco per un volume totale di 1 ml nel tubo del microfuge.
   7. Restituire le cellule dal tubo ad un pozzo nella piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti.

3. valutazione di differenziazione fenotipica delle cellule mediante microscopia di cellule coltivate in condizioni aerobiche

1. Mentre nella camera anaerobica, posizionare la piastra in una scatola richiudibile lavata con la miscela di gas anaerobico e chiudere la finestra.
   Nota: La casella deve contenere un tovagliolo di carta umido per fornire umidità e prevenire la piastra dall'asciugarsi. Per microscopia, sacchetti per sandwich funzionano al meglio, dal momento che sono sottili.
   1. Per osservare le cellule al microscopio, completamente sigillare il sacchetto e rimuoverlo dalla camera.
   2. Con attenzione allungare il sacchetto di plastica sopra la piastra, esaminare cellule utilizzando un microscopio di contrasto di fase invertito con l'allegato di fotocamera e prendere microfotografie a vari ingrandimenti.
   3. Restituire la lastra nel sacchetto sigillato alla camera e continuare l'incubazione come descritto al punto 2.3.3.
   4. Per analizzare separatamente le cellule runagate che sono in sospensione, attenersi alla procedura descritta al punto 2.3.5.
      Nota: Queste cellule possono quindi essere utilizzate per il test aerobico o possono essere restituite alla camera anaerobica per la sperimentazione di questa specifica popolazione.

Risultati

La forza di questo protocollo sta nel suo sostegno la longevità e la crescita di linee cellulari multiple e nel riconoscimento che ci sono una profonda alterazione e la divergenza nella morfologia delle cellule²⁵. L'elemento più critico di questo studio è il trasferimento e la manutenzione delle cellule sotto rigorosa anaerobiosi. Ciò richiede una camera anaerobica organizzato per massimizzare il protocollo (Figura 1) e l'assicuraz...

Discussione

Questo metodo rappresenta la prima volta le cellule di mammiferi che sono state coltivate per lunghi periodi di tempo in assenza di ossigeno. Sulla base di osservazioni attuale la crescita anossico capacità tramite una via non-fermentativo sembra essere universale tra le cellule di mammiferi linee²⁸, dove la crescita anaerobica ha provocato la divergenza di fenotipo. Questo è stato osservato per tutte le linee cellulari testate. Con la coltura anaerobica, aumentando le proporzioni delle...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whitney A35 anaerobic chamber	Don Whitley Scientific	Microbiology International	The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals.
CO2 incubator	Fisher Scientific	3531
Tissue Culture Hood	Labconco	DO55735
pipet aid	Drummond	4-000-100
sterile transfer pipets	Santa Cruz	sc-358867
50 cc sterile conical centrifuge tubes	DOT	451-PG
vaccum jar	Nalgene 111410862889	BTA-Mall 5311-0250
DMEM high glucose (4.5 g/L)	CellGro	10-017-CM
DMEM low glucose (1 g/L)	CellGro	10-014-CV
FBS	VWR	1500-500
HBSS	VWR	20-021-CV
trypsin	VWR	25-052-CI
gentamicin	Gibco	15750-060
sterile pipets	CellTreat	229210B, 229205B
Tissue culture flask (T75 or T150)	Santa Cruz	sc-200263, sc-200264
24 well tissue culture treated dishes	DOT	667124
glad ziplock sandwich bags	Ziploc	Costco
inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont)	Nikon Eclipse	TS100
trypan blue	Invitrogen	T10282
hemocytometer	Invitrogen	C10283
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000
Rainin microtiter pipets	Mettler Toledo	Rainin Classic Pipette PR-100
microtiter tips	Santa Cruz Biotechnology	sc-213233 & sc-201717
test tube rack (50cc tubes)	The Lab Depot	HS29050A
sodium nitrite	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en&region=US
clear boxes with lids	Rosti Mepal	Rubber maid
paper towels	In House
cell scraper	CellTreat	229310
PBS	In house prepared
70% Ethanol	Fisher Scientific	64-17-5
microcentrifuge tubes sterile	Santa Cruz	sc-200273
biohazard bags with holder (desktop)	Heathrow Scientific	HS10320
Nitrile Gloves	VWR	89428
oxygen electrode	eDAQ	EPO354
pH meter	Jenway	3510
pH paper/ pHydrion	Sigma Aldich	Z111813