צנרור שבעל-פה של דג זברה למבוגרים: מודל להערכת ספיגת מעיים של תרכובות ביו

Summary

הפרוטוקול מתאר נלוקסון דג זברה למבוגרים עם ביולוגי; לאחר מכן לנתח, הכנת המעי עבור cytometry, מיקרוסקופיה קונפוקלית ו- qPCR. שיטה זו מאפשרת ניהול של תרכובות ביו לעקוב אחר ספיגת מעיים ואת הגירוי המערכת החיסונית המקומית עורר. זה רלוונטי לבדיקה את הדינמיקה מעיים של אמצעי מניעה שבעל-פה.

Abstract

רוב פתוגנים פולשים אורגניזמים דרך רירית שלהם. זה נכון במיוחד בדגים כפי שהם נחשפים באופן רציף סביבה מים עתירי חיידקים. פיתוח שיטות יעילות עבור משלוח אוראלי של immunostimulants או חיסונים, אשר מפעיל את מערכת החיסון כנגד מחלות זיהומיות, רצוי מאוד. בהמצאת כלי מניעתי, ניסיוניות טוב יש צורך לבחון את הביצועים שלהם. כאן, אנו מראים שיטה לצנרור שבעל-פה של דג זברה בוגרת וערכה של ההליכים כדי לנתח ולהתכונן המעי cytometry, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תגובת שרשרת (qPCR) פולימראז כמותית. עם פרוטוקול זה, אנחנו יכולים בדיוק לנהל אמצעי אחסון עד 50 µL לדוג במשקל כ 1 g בפשטות ובמהירות, מבלי לפגוע החיות. שיטה זו מאפשרת לנו לבחון תפיסה ישירה ויוו של תרכובות fluorescently עם תוויות ברורות על ידי רירית המעי לבין יכולת immunomodulatory של תכשירים כאלה באתר המקומי לאחר צנרור. על ידי שילוב שיטות במורד הזרם כמו cytometry זרימה, היסטולוגיה, qPCR ומיקרוסקופיה קונפוקלית של רקמת המעי, נוכל להבין איך immunostimulants או חיסונים הם מסוגלים לחצות את המחסומים הרירית מעיים, עוברים פרופריה. מוסקולריס, ו להגיע לשריר, הפעלת השפעה על מערכת החיסון הרירית מעיים. המודל יכול לשמש כדי לבחון אמצעי מניעה אוראלי המועמד ו מערכות אספקה או אפקט מקומיים של כל המתחם ביואקטיביות אוראלית.

Introduction

מטרת מאמר זה היא לתאר עומק שיטה פשוטה לצנרור שבעל-פה של דג זברה, יחד עם שימושי משויך הליכים במורד הזרם. אוראלי צנרור באמצעות דג זברה הפך מודל מעשי במחקר של מחלות זיהומיות dynamics, חיסון אוראלי/immunostimulant, ספיגת התרופה/nanoparticle ואת היעילות וחסינות מעיים הרירית. לדוגמה, דג זברה צנרור אוראלי שימש במחקר של זיהום של התחממות עולמית , Mycobacterium peregrinum -¹. . Lovmo et al. גם משתמשים בהצלחה מודל זה למסור חלקיקים, התחממות עולמית מ . מערכת העיכול של דג זברה בוגרת². בנוסף, צ'ן. et al. משמש צנרור אוראלי דג זברה להראות כי סמים כמוס על ידי חלקיקים, כאשר מנוהל באמצעות מערכת העיכול, הוסעו על פני מחסום דם המוח³. מחברים אלה לבצע צנרור המבוסס על שיטת gauvage מתוארת על ידי. Collymore et al. ⁴ עם מספר שינויים. עם זאת, הם לא סיפקו פרוטוקול מאוד מפורט המתאר את ההליך צנרור אוראלי. כאן, אנו מציגים שיטה לצנרור שבעל-פה של דג זברה בוגרת בונים על. Collymore et al. ⁴ בהמשך נשלב את הכנת המעי לבדיקה במורד הזרם הרלוונטי על ידי cytometry, מיקרוסקופיה קונפוקלית qPCR.

המעי ורירית במיוחד שלה הוא את השורה הראשונה להגנה מפני זיהום האתר העיקרי של ספיגת התזונתי⁵. כאשר תאים אפיתל של אנטיגן תאים בתוך מחסומים הרירית תופסים אותות סכנה, תגובה חיסונית מולדת מיידי מופעלת. הבא, התגובה החיסונית מסתגלת ספציפי מאוד היא הוקמה על ידי T ו- B לימפוציטים^6,7. פיתוח חיסונים שבעל פה הוא אזור המיקוד הנוכחי ב- vaccinology. חיסונים כאלה יהיה כלי יעיל כדי להגן על האורגניזם באתרים חשופים בשל התגובה ספציפי של תאים חיסוניים ב^8,רירית הקשורים רקמות הלימפה (מאלט)⁹. עופות ומידגה, חיסונים הרירית יש יתרונות ברורים לעומת זריקות חיסונים. הם שימושיים לקבלת חיסון המוני, פחות עתירי עבודה, הן פחות מלחיץ לדג, יכול להיות מנוהל על מנת דגים צעירים. ובכל זאת, החיסון הרירית מועמדים חייבים להגיע על קטע בטן שני מבלי להיות שפגע בסימני בסביבת אוראלי. הם גם חייבים לחצות הרירית המחסומים על מנת לקבל גישה אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים) כדי לגרום תגובות מקומיות ו/או מערכתית¹⁰. לכן, בדיקה של תפיסה הרירית מושגת על ידי אנטיגנים אוראלי המועמד ומערכות אספקת שלהם, כמו גם התגובה החיסונית עורר, חיוני בפיתוח של חיסונים שבעל-פה.

בהקשר הביו-רפואי, פיתוח מודל לבחון השפעות ביולוגיות של תרכובות לאחר צנרור אוראלי הוא עניין הולך וגדל. רבות מהתכונות אנטומית, פיזיולוגית של המעי נשמרים בין שושלות bilaterian, עם יונקים ודגים כחוש¹¹. מודל זה צנרור אוראלי מחובר ניתוח במורד הזרם יכולה להיות כלי כדי לספק תובנות הביולוגיה האנושית, כמו גם בסיס ביולוגי או אחרים תרכובות ויוו.

פרוטוקול צנרור אוראלי יכול להתבצע על ידי מפעיל אחד, למשל, בהצלחה וניהול עד 50 µL של חלבון nanoparticle ההשעיה לדוג במשקל 1 g, עם שיעור הישרדות גבוהה. ההליך הוא פשוט להגדיר ומהירה; 30 דגים יכול לצנר ב 1 h. הפרוטוקול עבור הכנת המעי היא המפתח לספק דגימות תאים ורקמות איכות לצורך ניתוח מאוחר יותר. דוגמאות של הזרם תוצאות ניתנות אשר מראים את התועלת של הפרוטוקול בקבלת נתונים הקשורים ספיגת מעיים לבודד RNA איכות עבור qPCR. הפרוטוקול תהיה תועלת רבה לאלו הזקוקים מודל מתאים כדי לבדוק את הדינמיקה של אמצעי מניעה אוראלי או תרכובות אחרות במעי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני לערב דג זברה (רזבורה rerio) היו מורשה על ידי ועדת האתיקה של Universitat Autònoma דה ברצלונה (CEEH מספר 1582) מסכים עם העקרונות המנחים הבינלאומי עבור המחקר מעורבים חיות ( EU 2010/63). כל הניסויים עם דג זברה בשידור חי בוצעו ב 26 – 28 º C.

1. מכינים את הציוד לצנרור אוראלי

1. במקום כ- 1 ס מ של שפופרת סיליקון בסדר על מחט נעל זכוכית 31 G כדי לכסות את מחט.
2. גזור פיפטה מסנן סטרילי 10 µL עצה (בערך 2 ס מ), את הקצה עדינה יותר, מעל צינור סיליקון כמו נדן. ודא שפיפטה חורג קצה המחט כדי להימנע ופצעו את החיה.
3. לצרף את המחט מזרק נעל זכוכית 100 µL.
   הערה: תמיד לשטוף עם אתנול ולאחר מכן buffered פוספט תמיסת מלח (PBS, ראה חומרים) ביסודיות בין הטיפולים.

2. הפתרונות הנדרשים

1. להכין 150 מ ג/ליטר (עבור הרדמה) או 300 מ ג/ליטר (עבור המתת חסד) של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) פתרון עם מים מהאקווריום של איפה נשמרים על דג זברה. למלא טנק קטן עם 1 ליטר של פתרון הרדמה ולשמור אותו מוגזים.
2. למלא אחר טנק קטן עם 1 ליטר מים באקווריום ללא MS-222 להחלמה דגים ולשמור אותו מוגזים.
3. להפוך 50 מ של PBS x 1 מ 10 x פתרון סטרילי מניות.
4. לבידוד תא ניתוח/מעיים cytometry, להכין מספיק collagenase 0.15% טרי IV סוג פתרון 1 מ"ל לכל דג פתרון מניות או אבקת במדיום נשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם פניצילין v 1% / v, סטרפטומיצין (ראה חומרים). להפוך aliquots (1 לכל דג) של 1 מ"ל ב 2 mL צינורות צנטריפוגה. שמור ב 4 ° C עד 30 דקות לפני השלב לנתיחה.
5. עבור קיבעון מיקרוסקופ קונפוקלי/המדגם, להכין 50 מ של 4% טרי paraformaldehyde (PFA) פתרון PBS או להפשיר פתרון מניות מ-20 ° C מקפיא בשכונה fume.
   התראה: PFA רעיל. אנא קרא את גיליון בטיחות חומרים לפני עובד עם זה. כפפות בטיחות משקפיים לענידה ואני תמיד משאירים פתרונות בתוך ברדס fume.

3. הכנת ההשעיה Nanoparticle פלורסנט

1. תווית של ננו-חלקיק חלבון עם אסתר NHS אטו-488 (ראה טבלה של חומרים) או של הפלורסנט המתאים על פי הוראות היצרן.
2. Resuspend חלקיקים במאגר סודיום ביקרבונט 0.1 M-הריכוז של 2 מ"ג/מ"ל.
3. להמיס אסתר אטו 488 NHS ב ללא אמין דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ב 2 מ"ג/מ"ל. לשמור על aliquot של µL 10 כדי לבדוק את יעילות תיוג (שלב 3.7 – 3.8).
4. לערבב חלקיקים, אסתר אטו 488 NHS-טוחנת יחס של 1:2 (חלבון: צבען) על ידי ערבוב בחושך.
5. ספין למטה חלקיקים עם תוויות על ידי צנטריפוגה ב x 8000 g 10 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר את תגובת שיקוע ולשמור אותו כדי לבדוק את יעילות תיוג (שלב 3.7 – 3.8).
6. רחץ חלקיקים עם תוויות על ידי resuspending ב 1 מ"ל של 0.1 M סודיום ביקרבונט מאגר vortexing ו pipetting למעלה ולמטה. ואח כ לזרוק את תגובת שיקוע על ידי צנטריפוגה ב x 8000 g 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על צעד 3.6 5 פעמים.
7. Resuspend בגדר ב 5 מ של מאגר סודיום ביקרבונט 0.1 M בשפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל ולעשות aliquots של ננו-חלקיק פלורסנט צינורות צנטריפוגה 1.5 mL (30 aliquots). ספין למטה ב x 8000 g 10 דקות בטמפרטורת החדר, למחוק את תגובת שיקוע ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס מוגן מפני האור.
8. למדוד את היעילות תיוג באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume.
   1. 1 µL של הפתרון אטו 488 המקורי מנע שלב 3.3 ואין עוד למהול אותו ב דימתיל סולפוקסיד (למשל, 1:20 על פי היחס בין נפח). זהו אמצעי האחסון המשמש כדי לקבל את היחס טוחנת של חלבון ננו-חלקיק, אטו 488 מיקס בשלב 3.4.
   2. קח 1 µL של תגובת שיקוע שנשמרו פי התגובות labelling בשלב 3.5. למדוד את הספיגה (abs) ב = 501 ננומטר. אחוז labelling הוא:
      (
9. לפני הניסוי, להכין את המתלים ננו-חלקיק-הריכוז הרצויה באמצעות פתרון PBS x 1.

4. דג זברה ההרדמה ו אוראלי צנרור

1. מהר הדג (> 0.5 ג'י) לפחות 48 שעות לפני הניסוי כדי לרוקן את המעי.
2. להעביר את הדגים (12 דגים) הטנקים ניסיוני (6 L) לילה אחד לפני הניסוי כדי לאפשר הסתגלות¹².
3. מערבולת הפתרון nanoparticle היטב (למשל, 2,500 סל"ד ו- 30 s) וצייר את עוצמת הקול הרצוי של ננו-חלקיק השעיה (למשל 20 – 50 µL) לתוך המזרק מחובר המחט מוגן.
4. מניחים את הדגים קצף 150 מ ג/ליטר MS-222 פתרון (ראה סעיף 2) עד שהם שוקעים לתחתית המיכל מגיב קמצוץ סנפיר הזנב; תהליך זה לוקח פחות מ 5 דקות.
5. במהירות להעביר את הדגים anesthetized עם רשת מגש פלסטיק רטוב, להתמצא החיה אופקית כדי להתמודד עם המחט ולהתחיל מיד את צנרור אוראלי.
6. בזהירות את הדג עם יד אחת ותמיכה פתח את הפה עם היד השנייה בעזרת המחט מוגן. הכנס בעדינות את המחט במורד הוושט כ-1 ס מ מן הפה פתיחה.
   הערה: האופרטור עשוי לחוש בהתנגדות קלה כאשר הקצה של הקצה פיפטה עבר את גיל. הקפידו לא זווית הכניסה המחט מדי אשר עלולה לנקב את גיל.
7. לאט לאט להחדיר ההשעיה nanoparticle דגים. ודא כי ההשעיה אינה זורמת כלפי חוץ דרך זימים או הפה.
8. הסר את המחט ובעדינות מניחים את הדג לתוך המיכל השחזור (ראה סעיף 2). התאוששות בדרך כלל לוקח בתוך 1 דקות.
9. בדוק את הדגים היטב על אי-תקינות (למשל, דימום על הזימים הוא סימן ניקוב).
10. לאחר הדג התאוששו, לחזור עליהם הטנקים ניסיוני.

5. דג זברה המעי לנתיחה

1. לאחר תקופת זמן שצוינה פוסט צנרור (למשל, 5 שעות או 24 שעות), מניחים את הדג באמצעות רשת לתוך 300 mg/L MS-222 לפתרון המתת חסד (ראה סעיף 2). ודא operculum יפסיק לזוז יש רפלקס קמצוץ אין זנב. חמש דקות מספיקה בדרך כלל.
2. לאסוף את החיה לאללה עם רשת ומניחים אותו על נייר הסינון.
   הערה: נייר הסינון הוא מאוד שימושי עבור הסרת הרקמה דבק לאורך המעי.
3. באמצעות מספריים חדות לנתיחה, עושים חתך חצי-עגולות מפי-הטבעת כדי operculum החתך פתוח באמצעות פינצטה משובחים. חותכים בשני קצוות המעי, להוציא את כל האיברים הפנימיים, ומניחים אותם על נייר הסינון.
   התראה: לפעול במהירות כדי להפחית את מטבוליזם התא ומוות.
   הערה: לחלופין, להסיר את הרקמה דבק ב- PBS, על קרח.
4. להפריד את המעי לאיברים פנימיים מקפיד לשמור את האוריינטציה שלו (והשתרשה עמוק בלבה קטע מעי אחורי) ומתח אותו. בדרך כלל, החלק הקדמי של המעי הוא רחב יותר קטע האחורי. לטפל כדי להשיג את כל המעי כאשר לנתח.
   הערה: לסוף האחורי די בסדר, שביר בדגים קטנים, עלולה לשבור, במיוחד אצל בעלי חיים < 0.7 g.
5. לגלגל את המעי על נייר הסינון עם פינצטה על מנת לנתק את הרקמה דבק מהמעי.
6. להמשיך להתכונן המעי ניתוחים שונים במורד הזרם (סעיפים 6, 7 ו- 8).

6. הכנת את תאי המעי עבור Cytometry

1. להכין מראש aliquots של 0.15% collagenase פתרון (ראו סעיף 2.4).
   הערה: Aliquots צריך להיות בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך.
2. אופציונלי: המשך מ שלב 5.5, לחתוך פתח המעי longitudinally, לשטוף עם 1 x PBS.
3. באמצעות פינצטה, מקם את המעי בצינור צנטריפוגה 2 mL מלא 0.15% collagenase פתרון.
4. במקום הצינורות על מסובב מעבדה אנכי לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
5. מניחים את המעי על מסננת תא 100 מיקרומטר נתמך על שפופרת צנטרפוגה 50 מ. תפסיקו עם המעי עם פומפה מזרק 5 מ ל, כביסה 3 פעמים עם PBS 1 x, אוסף את הזרימה מדגם בצינור צנטריפוגה 50 מ
6. Centrifuge הצינור צנטריפוגה 50 מ ב x 400 g למשך 10 דקות, ב 4 º C.
7. פיפטה בקפידה את מרבית תגובת שיקוע תוך כדי לא לאבד את התאים, אשר עשוי להיות קשור עם הליחה.
8. Resuspend תאי המעי בתחתית הצינורית צנטריפוגה עם µL 500 ל- PBS 1 x ולשמור בקירור עד cytometry ניתוח
9. דוגמאות מסנן דרך מסנן תא 30 מיקרומטר לתוך מ ל עגול התחתון צינורות עבור cytometry.
10. קבע את הפרמטרים (למשל, מספר התאים לניתוח, האזור של מתח ועניין, פיצויים, מבחר של גלאי) ציוד cytometer (ראה חומרים).
11. מיד לנתח את התאים על cytometer, ביצוע ההוראות של שימוש¹³.

7. הכנת המעי Cryosections קונפוקלית

1. מילוי כייר פלסטיק (ראה טבלה של חומרים) לנפח חצי עם חיתוך אופטימום טמפרטורה (O.C.T.) מורכב.
2. המשך מהשלב 5.5, ומיד לאחר הקרע, מקם בזהירות המעי כייר פלסטיק. ודא המעי לגמרי מוטבעות במתחם O.C.T.. אם יש צורך, להוסיף מורכבות יותר O.C.T. כייר פלסטיק.
   הערה: מומלץ למקם המעי בצורת "Z" ב- O.C.T. מתחם לעקוב בקלות אחר הכיוון הטבעי שלה.
3. במקום כייר פלסטיק על קרח יבש עד שהוא מגיע אטום (פחות מדקה).
4. חנות כייר פלסטיק ב-80 מעלות צלזיוס עבור שימוש ארוך טווח או תהליך באופן מיידי באמצעות ההליך הבא.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
5. פורסים המעי קפוא 10 מיקרומטר מקטעים או עובי המתאים באמצעות cryostat ב-20 ° C.
6. לאסוף את המקטע במעי עם מברשת בסדר לשקופית.
7. לטבול את השקופית ב 4% PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את הדגימה.
   התראה: PFA רעיל. אנא קרא את גיליון בטיחות חומרים לפני עובד עם זה. כפפות בטיחות משקפיים לענידה ואני תמיד משאירים פתרונות בתוך ברדס fume.
8. לשטוף את השקופית 3 פעמים עם 1 x PBS, 10 דקות כל אחד.
9. להוסיף טיפה של הרכבה בינונית ומניחים על coverslip על הדגימה.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
10. לבחון את הדגימה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה המתאים.

8. הכנת המעי בזמן אמת qPCR (RT-qPCR)

1. המשך מהשלב 5.5, להכניס את המעי בקבוקון קריוגני ומקפיאים במהירות המעי חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
2. עבור המגון, הוסף 200 פתרון 1-Thioglycerol/המגון µL של 2% (v/v) מקורר (ראה טבלה של חומרים) או פתרון חלופי המגון המדגם במעי.
3. לעבוד מהר, homogenize את הדגימה המעי על הקרח עם מהמגן מעבדה במהירות גבוהה (נקבע על 25 – 30,000 סל"ד) עד אין רקמות גלוי קטעים נשארים. 3 פעמים עבור 5 s מספיקה בדרך כלל.
4. לבודד RNA באמצעות פרסומת קיט (ראה טבלה של חומרים) לפי הוראות היצרן¹⁴ או שיטה חלופית מתאימה. לפי הצורך, לאחסן את הרנ א ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
5. לכמת את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים¹⁵ ולהעריך את איכות באמצעות מנתח רנ א¹⁶.
6. להכין 1 µg או כמות מספקת של cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. לניתוח qPCR, אנא עקוב אחר ההנחיות MIQE¹⁷.
7. עיצוב זוגות פריימר מתאים עבור הגן/s של ריבית.
8. בחר גנים התייחסות מתאימה ולנתח את הביטוי של כל גן על ידי זיהוי RT-qPCR מערכת באמצעות פרסומת קיט (ראה חומרים).
   הערה: לדוגמה, הוסף 5 µL של supermix SYBR ירוק, 0.5 מיקרומטר תחל, µL 2.5 של cDNA מדולל, µL 1.5 מים באמצעי אחסון הסופי של µL 10 במשך כל צלחת qPCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דג זברה (ממוצע משקל: 1.03 ± 0.16 g) מין מעורבים היו בהצלחה לצינורות עם חלקיקים שונים חלבון רקומביננטי (גופים הכללה חיידקי) באמצעות המכשיר תוצרת בית צנרור אוראלי שלנו (איור 1). יש לבצע צנרור אוראלי ואנו מושגת התמותה נמוכה האחוז הממוצע (6.8%) בהצלחה (טבלה 1). ד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה הוא שיפור של הטכניקה שתואר לעיל לצנרור אוראלי על-ידי. Collymore et al. ⁴ פרוטוקול שלנו מתאר בפירוט את השיטה צנרור אוראלי, כולל הכנת המעי עבור ניתוחים במורד הזרם. השיטה שלנו משפר את מהירות מניפולציה דגים המאפשר אחד לבצע את כל הפרוטוקול במהירות, ללא הרבה שינויים בין מפע?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone tube	Dow Corning	508-001	0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle	Hamilton	7750-22	31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe	Hamilton	81020/01	100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip	Nerbe Plus	07-613-8300	10 μL
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	powder
10x PBS	Sigma Aldrich	P5493
Filter paper	Filter-Lab	RM14034252
Collagenase	Gibco	17104019
DMEM	Gibco	31966	Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin	Gibco	15240
Cell strainer	Falcon	352360
CellTrics filters	Sysmex Partec	04-004-2326 (Wolflabs)	30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound	SAKURA	4583
Plastic molds for cryosections	SAKURA	4557	Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide	Thermo Scientific	10149870	SuperFrost Plus slide
Cover glasses	Labbox	COVN-024-200	24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Atto-488 NHS ester	Sigma-Aldrich	41698
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit	Promega	AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution	Promega	Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit	adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 mL homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator	Suministros Grupo Esper	10000-01062
Cryostat	Leica	CM3050S
Homogenizer	KINEMATICA	Polytron PT1600E
Flow cytometer	Becton Dickinson	FACS Canto
5 mL round bottom tube	Falcon	352058
Confocal microscope	Leica	SP5
Fume Hood	Kottermann	2-447 BST
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent	G2939A	RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument	Promega	AS4500
iScript cDNA synthesis kit	Bio-rad	1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit	Bio-rad	172-5120
Water	Sigma-Aldrich	W4502
Cryogenic vial	Thermo Fisher Scientific	375418	CryoTube vial
Mounting medium	Sigma-Aldrich	F6057	Fluoroshield with DAPI