Intubação oral de Zebrafish adulto: um modelo para avaliar a absorção Intestinal de compostos bioativos

Resumo

O protocolo descreve intubação zebrafish adulto com um biológico; em seguida, dissecando e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e qPCR. Este método permite a administração de compostos bioativos para monitorar a absorção intestinal e o estímulo imune local evocado. É relevante para a dinâmica intestinal da profilaxia oral de teste.

Resumo

A maioria dos patógenos invadem organismos por meio de sua mucosa. Isto é particularmente verdadeiro em peixe como eles estão continuamente expostos a um ambiente de água rica em microbiana. Desenvolver métodos eficazes para entrega oral de Imunoestimuladores ou vacinas, que ativam o sistema imunológico contra doenças infecciosas, é altamente desejável. Na concepção de ferramentas profiláticas, bons modelos experimentais são necessários para testar seu desempenho. Aqui, nós mostramos um método para intubação oral de zebrafish adulto e um conjunto de procedimentos para dissecar e preparar o intestino para citometria, microscopia confocal e análise (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativa. Com este protocolo, estamos precisamente pode administrar volumes até 50 µ l de pescar pesando cerca de 1 g simplesmente e rapidamente, sem prejudicar os animais. Este método nos permite explorar a absorção direta na vivo de compostos fluorescente rotulados pela mucosa intestinal e a capacidade de imunomoduladores de tais produtos biológicos no local após a intubação. Combinando métodos a jusante como citometria de fluxo, histologia, qPCR e microscopia confocal do tecido intestinal, podemos entender como Imunoestimuladores ou vacinas são capazes de atravessar as barreiras da mucosa intestinais, passar a lâmina própria, e atingir o músculo, exercendo um efeito sobre o sistema imunológico da mucosa intestinal. O modelo pode ser usado para testar a profilaxia oral candidato e sistemas de entrega ou o efeito local de qualquer composto Bioativo administrado por via oral.

Introdução

O objetivo deste artigo é descrever em profundidade um método simples para intubação oral de zebrafish, juntamente com procedimentos de jusante associados útil. Intubação oral usando zebrafish tornou-se um modelo prático no estudo da dinâmica de doenças infecciosas, vacina oral/imuno-estimulantes, drogas/nanopartículas absorção e eficácia e imunidade da mucosa intestinal. Por exemplo, zebrafish intubação oral tem sido usada no estudo de Mycobacterium marinum e Mycobacterium peregrinum infecção¹. Lovmo et al . também utilizado com sucesso este modelo para entregar o trato gastro-intestinal de adultos do zebrafish²-nanopartículas e M. marinum . Além disso, Chen et al costumava intubação oral zebrafish para mostrar que drogas encapsuladas por nanopartículas, quando administrada através do trato gastro-intestinal, foram transportados através do sangue cérebro barreira³. Estes autores realizaram intubação baseada no método descrito por Collymore et al gauvage ⁴ , com algumas modificações. No entanto, eles não forneceu um protocolo altamente detalhado, descrevendo o procedimento de intubação oral. Aqui, apresentamos um método para intubação oral de adultos do zebrafish baseando Collymore et al ⁴ outras incluem a preparação do intestino para análise pertinente a jusante por citometria, microscopia confocal e qPCR.

O intestino e particularmente sua mucosa é a primeira linha de defesa contra a infecção e o local principal de absorção de nutrientes⁵. Quando as células epiteliais e células apresentadoras de antígeno dentro da mucosa barreiras percebem sinais de perigo, uma imediata resposta imune inata é acionada. Em seguida, a resposta imune adaptativa altamente específica é estabelecida por de^6,de linfócitos T e B⁷. Desenvolvimento de vacinas orais é uma área de foco atual em Vacinologia. Essas vacinas seria uma ferramenta eficaz para proteger o organismo em locais expostos devido à resposta específica de células do sistema imunológico em tecidos linfoides associados a mucosa (MALT)^8,9. Na aquicultura, vacinas da mucosa tem vantagens óbvias em comparação com as vacinas injetáveis. Eles são práticos para vacinação em massa, menos trabalhosa, são menos estressantes para os peixes e podem ser administrados para peixes jovens. No entanto, candidatos vacinais da mucosa devem chegar o segundo segmento de intestino sem ser desnaturada no meio oral. Eles também devem transpor as barreiras da mucosa para obter acesso a apresentadoras de antígenos (APCs) para induzir respostas locais e/ou sistêmica¹⁰de células. Portanto, testes de captação da mucosa alcançada pelo candidato oral antígenos e seus sistemas de entrega, bem como a resposta imune evocada, é essencial no desenvolvimento de vacinas orais.

Em um contexto biomédico, desenvolvendo um modelo para testar os efeitos biológicos de compostos após intubação oral é de interesse crescente. Muitas das características anatômicas e fisiológicas do intestino são conservadas entre linhagens é formado por, com mamíferos e peixes ósseos¹¹. Este modelo de entubação oral ligado à análise a jusante pode ser uma ferramenta para fornecer insights sobre a biologia humana, bem como um campo de testes para produtos biológicos ou outros compostos na vivo.

O protocolo de intubação oral pode ser realizado por um operador, por exemplo, administrar com sucesso até 50 µ l de suspensão de nanopartículas de proteína para peixes pesando 1 g, com uma taxa de sobrevivência de alta. O procedimento é simples de configurar e rápido; 30 peixes podem ser intubados em 1h. O protocolo para a preparação do intestino é a chave para fornecer amostras de células e tecidos de qualidade para posterior análise. Exemplos de resultados a jusante são dados que mostram a utilidade do protocolo na obtenção de dados relacionados à absorção intestinal e no isolamento do RNA de qualidade para qPCR. O protocolo seria de grande utilidade para aqueles que necessitam de um modelo adequado para testar a dinâmica da profilaxia oral ou outros compostos no intestino.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo peixe-zebra (Danio rerio) foram autorizados pelo Comitê de ética da Universitat Autònoma de Barcelona (número CEEH 1582) de acordo com os princípios orientadores do Internacional para pesquisa envolvendo animais ( EU 2010/63). Todos os experimentos com zebrafish ao vivo foram realizados em 26 e 28 ° C.

1. preparar o equipamento para intubação Oral

1. Coloque aproximadamente 1 cm de um tubo de silicone fino sobre uma agulha de bloqueio de Luer de 31 mil para cobrir a ponta da agulha.
2. Corte uma pipeta de filtro estéril 10 µ l de ponta (cerca de 2 cm), pegue a ponta mais fina e coloque-o sobre o tubo de silicone como uma bainha. Certifique-se que a pipeta se estende para além da ponta da agulha para evitar ferir o animal.
3. Conecte a agulha de uma seringa de fecho Luer µ l 100.
   Nota: Lave sempre com etanol, e em seguida tampão fosfato salino (PBS, ver materiais) completamente entre os tratamentos.

2. soluções necessárias

1. Prepare a 150 mg/L (anestesia) ou 300 mg/L (eutanásia) da solução de Metanossulfonato (MS-222) etil 3-aminobenzoato com água do aquário onde o peixe-zebra são mantidas. Encher um tanque pequeno com 1 L de solução anestésica e mantê-lo arejado.
2. Preencher outro tanque pequeno com 1 L de água do aquário sem MS-222 para recuperação do peixe e mantê-lo arejado.
3. Fazer 50 mL de 1X PBS de uma solução estéril de 10x.
4. Para o isolamento de célula intestinal/análise cytometry, prepare bastante fresco colagenase 0,15% solução tipo IV para 1ml por peixes de uma solução de reserva ou de pó num meio de águia modificados de Dulbecco (DMEM) com 1% v/v penicilina e estreptomicina (ver materiais). Faça (1 por peixe) de alíquotas de 1 mL em tubos de centrífuga de 2 mL. Manter a 4 ° C até 30 min antes da etapa de dissecação.
5. Para fixação de microscopia confocal/amostra, preparar 50 mL de solução de paraformaldeído (PFA) fresca de 4% em PBS ou descongelar uma solução stock de congelador-20 ° C em uma coifa.
   Atenção: O PFA é tóxico. Por favor, leia a folha de dados material de segurança antes de trabalhar com ele. Luvas e óculos de segurança devem ser usados e deixar sempre soluções dentro de uma coifa.

3. preparar a suspensão de nanopartículas fluorescentes

1. Rotular as nanopartículas de proteína com éster Atto-488 NHS (ver Tabela de materiais) ou uma tintura fluorescente apropriada de acordo com as instruções do fabricante.
2. Resuspenda as nanopartículas em tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M na concentração de 2 mg/mL.
3. Dissolva o éster Atto 488 NHS em amina livre dimetilsulfóxido (DMSO) 2 mg/ml. Manter uma alíquota de 10 µ l para verificar a eficiência de rotulagem (etapa 3.7 – 3.8).
4. Misture as nanopartículas e o éster Atto 488 NHS em uma relação molar de 1:2 (proteína: tintura) por agitação no escuro.
5. Spin para baixo as nanopartículas rotuladas por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e mantê-lo para verificar a eficiência de rotulagem (etapa 3.7 – 3.8).
6. Lave as nanopartículas rotuladas por resuspending em 1 mL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M num Vortex e pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, descarte o sobrenadante por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Repita a etapa 3.6 por 5 vezes.
7. Resuspenda o pellet em 5 mL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M em um tubo de centrífuga de 15 mL e faça alíquotas das nanopartículas fluorescentes em tubos de centrífuga de 1,5 mL (30 alíquotas). Spin para baixo a 8.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente, desprezar o sobrenadante e armazenar a-80 ° C, protegido da luz.
8. Medir a eficiência de rotulagem usando um spectrophotometer microvolume.
   1. Tomar 1 µ l da solução de Atto 488 original mantida da etapa 3.3 e diluí-lo ainda mais em DMSO (por exemplo, 01:20 de acordo com a relação de volume). Este é o volume usado para obter a relação molar de nanopartículas de proteína e Atto 488 misture no passo 3.4.
   2. Tome 1 µ l do sobrenadante da reação da rotulagem salvo na etapa 3.5. Medir a absorção (abs) no = 501 nm. É a porcentagem de rotulagem:
      (
9. Antes do experimento, prepare a suspensão de nanopartículas na concentração desejada usando 1 x solução de PBS.

4. Zebrafish Anesthetization e intubação Oral

1. Rápido o peixe (> 0,5 g) pelo menos 48 h antes do experimento para esvaziar o intestino.
2. Mova o peixe (12 peixe) para os tanques experimentais (6L) uma noite antes do experimento para permitir que a aclimatação¹².
3. Vórtice a solução de nanopartículas bem (por exemplo, 2.500 rpm e 30 s) e elaborar o volume desejado de nanopartículas suspensão (por exemplo, 20 – 50 µ l) para a seringa anexada para a agulha protegida.
4. Coloque o peixe no aerado 150mg/L MS-222 solução (ver secção 2) até que eles descem para o fundo do tanque e não respondem a uma pitada de barbatana de cauda; Este processo leva menos de 5 min.
5. Rapidamente o peixe anestesiado com uma rede de transferência para uma bandeja de plástico molhada, orientar o animal horizontalmente para enfrentar a agulha e começar imediatamente a intubação oral.
6. Cuidadosamente, apoiar o peixe com uma mão e abrir a boca com a outra mão usando a agulha protegida. Insira cuidadosamente a agulha até ao esófago para cerca de 1 cm da boca abrindo.
   Nota: O operador pode sentir uma ligeira resistência ao final da ponta da pipeta passou o gill. Tome cuidado para não o ângulo da entrada de agulha demais que possam perfurar o gill.
7. Injete lentamente a suspensão de nanopartículas para os peixes. Certifique-se que a suspensão não flui para fora através de brânquias ou da boca.
8. Delicadamente, retire a agulha e coloque o peixe no tanque de recuperação (ver secção 2). Recuperação leva geralmente dentro de 1 min.
9. Verifique o peixe cuidadosamente para qualquer anormalidade (por exemplo, sangramento em brânquias é um sinal de perfuração).
10. Uma vez que os peixes se recuperaram, devolvê-los para os tanques experimentais.

5. Zebrafish intestino dissecação

1. Após um período especificado de tempo pós intubação (por exemplo, 5 h e/ou 24 h), coloque o peixe usando uma rede em 300 mg/L de MS-222 solução para eutanásia (ver secção 2). Certifique-se o opérculo para de se mover e não há nenhum reflexo de pitada de cauda. Cinco minutos é normalmente suficiente.
2. Pegar o animal euthanized com uma rede e colocá-lo em um papel de filtro.
   Nota: O papel de filtro é muito útil para remover o tecido adesivo ao longo do intestino.
3. Usando uma tesoura afiada dissecação, fazer uma incisão semicircular do ânus para o opérculo e incisão aberta, usando uma pinça fina. Corte as duas extremidades do intestino, tirar todos os órgãos internos e coloque-os sobre o papel de filtro.
   Cuidado: Trabalho rapidamente para reduzir a morte e o metabolismo celular.
   Nota: Como alternativa, remova o tecido adesivo em PBS e no gelo.
4. Separe o intestino dos órgãos internos, certificando-se de manter sua orientação (anterior posterior segmento intestinal) e esticá-la. Geralmente, o segmento anterior do intestino é mais largo do que o segmento posterior. Tome cuidado para obter todos do intestino quando dissecando.
   Nota: A extremidade posterior é muito fina e frágil em peixes pequenos e podem romper, particularmente em animais < 0,7 g.
5. Role o intestino no filtro de papel com uma pinça para desanexar o tecido adesivo no intestino.
6. Proceda para preparar o intestino para várias análises a jusante (seções 6, 7 e 8).

6. preparar células intestinais por citometria

1. Prepare com antecedência alíquotas da solução de colagenase de 0,15% (ver secção 2.4).
   Nota: Alíquotas devem estar à temperatura ambiente antes de prosseguir.
2. Opcional: Continuação da etapa 5.5, cortar aberto o intestino longitudinalmente e lave com PBS 1x.
3. Usando uma pinça, coloca o intestino no tubo de centrífuga de 2ml, preenchido com solução de colagenase de 0,15%.
4. Coloque os tubos em rotacao laboratório vertical por 1h à temperatura ambiente no escuro.
5. Coloque o intestino em um coador de célula de 100 µm apoiado sobre um tubo de centrífuga de 50 mL. Romper o intestino com um êmbolo da seringa de 5 mL, lavar 3 vezes com PBS 1x, coletando o fluxo através da amostra no tubo de centrífuga de 50 mL.
6. Centrifugar o tubo de centrífuga de 50 mL a 400 x g durante 10 minutos, a 4 ° C.
7. Pipete cuidadosamente durante a maior parte do líquido sobrenadante enquanto não perder as células, alguns dos quais podem ser associados com o muco.
8. Ressuspender as células intestinais na parte inferior do tubo de centrífuga com 500 µ l de PBS 1x e manter no gelo até análise cytometry
9. Amostras de filtro através de um filtro de célula 30 µm em 5 mL redonda tubos para citometria.
10. Definir os parâmetros (por exemplo, o número de células para análise, a região de interesse, a tensão e a compensação, seleção de detectores) em um equipamento de citômetro (ver materiais).
11. Imediatamente analise as células em um citômetro, seguindo as instruções de uso¹³.

7. preparação de Cryosections intestino para microscopia Confocal

1. Encher o molde de plástico (ver Tabela de materiais) para metade do volume com a temperatura de corte ideal (O.C.T.) composta.
2. Continuando da etapa 5.5 e imediatamente após a dissecação, coloque cuidadosamente o intestino no molde plástico. Certifique-se que o intestino é totalmente incorporado no composto O.C.T.. Se necessário, adicione mais O.C.T. composto para o molde plástico.
   Nota: É recomendável colocar o intestino com uma forma de "Z" no O.C.T. compostos facilmente seguir sua orientação natural.
3. Coloque o molde de plástico em gelo seco até ficar opaco (menos de um minuto).
4. Armazene o molde plástico a-80 ° C para uso a longo prazo ou processo imediatamente usando o procedimento a seguir.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Fatie o intestino congelado em 10 seções µm ou espessura apropriada usando um criostato a-20 ° C.
6. Recolha a seção de intestino com um pincel fino para um slide.
7. Mergulhe o slide em 4% PFA durante 15 minutos à temperatura ambiente para fixar a amostra.
   Atenção: O PFA é tóxico. Por favor, leia a folha de dados material de segurança antes de trabalhar com ele. Luvas e óculos de segurança devem ser usados e deixar sempre soluções dentro de uma coifa.
8. Lave o slide 3 vezes com 1X PBS, 10 min cada.
9. Adicionar uma gota de meio de montagem e coloque uma lamela sobre o espécime.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
10. Observe a amostra sob um microscópio confocal na ampliação adequada.

8. preparar o intestino para qPCR em tempo Real (RT-qPCR)

1. Continuando da etapa 5.5, colocar o intestino em um frasco criogênico e congelar rapidamente o intestino em nitrogênio líquido e loja a-80 ° C até o uso.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Para homogeneização, adicionar solução de 1-Thioglycerol/homogeneização 200 µ l de 2% (v/v) refrigerados (ver Tabela de materiais) ou solução alternativa de homogeneização para a amostra de intestino.
3. Trabalhar rapidamente, homogeneizar a amostra de intestino no gelo com um homogeneizador de laboratório em alta velocidade (fixado em 25-30.000 rpm) até nenhum tecido visível fragmentos permanecem. 3 vezes por 5 s é geralmente suficiente.
4. Isolar o RNA usando um comercial kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com instruções^{14 as indicações do fabricante} ou um método alternativo adequado. Conforme necessário, armazene o RNA a-80 ° C para uso a longo prazo.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Quantificar a concentração de RNA usando um espectrofotômetro¹⁵ e avaliar a qualidade usando um analisador de RNA¹⁶.
6. Prepare-se 1 µ g ou uma quantidade adequada de cDNA usando um kit de síntese do cDNA de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Para análise de qPCR, por favor, siga as orientações MIQE¹⁷.
7. Desenha pares de primer adequado para o gene/s de interesse.
8. Selecione um gene de referência adequada e analisar a expressão de cada gene por uma detecção de RT-qPCR kit de sistema usando um comercial (ver materiais).
   Nota: por exemplo, adicione 5 µ l de supermix SYBR green, as primeiras demão de 0,5 µM, 2,5 µ l de cDNA diluído e 1,5 µ l de água em um volume final de 10 µ l de cada poço da placa de qPCR.

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Resultados

Zebrafish (peso médio: 1.03 ± 0,16 g) de sexo misturado com êxito foram intubados com nanopartículas de diferentes proteínas recombinantes (corpos de inclusão bacterianas) usando nosso dispositivo de intubação oral caseiro (Figura 1). Nós temos com sucesso realizada a intubação oral e alcançado uma percentagem média baixa mortalidade (6,8%) (Tabela 1). Zebrafish foram também intubado com 30 µ l ou 50 µ l de suspensões de nano...

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Discussão

Este protocolo é um aperfeiçoamento da técnica descrita anteriormente para intubação oral por Collymore et al ⁴ nosso protocolo descreve em detalhes o método de intubação oral e inclui a preparação do intestino para análises a jusante. Nosso método melhora a velocidade de manipulação de peixes permitindo que uma pessoa para executar o protocolo rapidamente, sem muita variação entre os operadores. A principal diferença do nosso protocolo com a anterior é que avaliamos o s...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicone tube	Dow Corning	508-001	0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle	Hamilton	7750-22	31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe	Hamilton	81020/01	100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip	Nerbe Plus	07-613-8300	10 μL
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	powder
10x PBS	Sigma Aldrich	P5493
Filter paper	Filter-Lab	RM14034252
Collagenase	Gibco	17104019
DMEM	Gibco	31966	Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin	Gibco	15240
Cell strainer	Falcon	352360
CellTrics filters	Sysmex Partec	04-004-2326 (Wolflabs)	30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound	SAKURA	4583
Plastic molds for cryosections	SAKURA	4557	Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide	Thermo Scientific	10149870	SuperFrost Plus slide
Cover glasses	Labbox	COVN-024-200	24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Atto-488 NHS ester	Sigma-Aldrich	41698
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit	Promega	AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution	Promega	Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit	adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 mL homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator	Suministros Grupo Esper	10000-01062
Cryostat	Leica	CM3050S
Homogenizer	KINEMATICA	Polytron PT1600E
Flow cytometer	Becton Dickinson	FACS Canto
5 mL round bottom tube	Falcon	352058
Confocal microscope	Leica	SP5
Fume Hood	Kottermann	2-447 BST
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent	G2939A	RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument	Promega	AS4500
iScript cDNA synthesis kit	Bio-rad	1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit	Bio-rad	172-5120
Water	Sigma-Aldrich	W4502
Cryogenic vial	Thermo Fisher Scientific	375418	CryoTube vial
Mounting medium	Sigma-Aldrich	F6057	Fluoroshield with DAPI