성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

요약

생물 학적;와 intubating 성인 zebrafish를 프로토콜에 설명 합니다. 그리고 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량에 대 한 소장을 준비 합니다. 이 메서드는 관리를 장의 글귀와 로컬 면역 자극을 갖는 생리 활성 화합물의 수 있습니다. 그것은 구두 prophylactics의 장 역학 테스트 관련이 있습니다.

초록

대부분 병원 체 유기 체 그들의 점 막을 통해 침입 한다. 이것은 생선에 특히 사실 그들은 지속적으로 미생물이 풍부한 물 환경에 노출 되는. Immunostimulants 또는 백신, 전염 성 질병에 대 한 면역 시스템을 활성화 하는 구두 납품을 위한 효과적인 방법을 개발 하는 것이 매우 바람직하다입니다. 예방 도구를 고안, 좋은 실험 모델의 성능을 테스트 필요 합니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 방법 및 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 분석에 대 한 소장을 준비 하는 절차의 집합을 보여줍니다. 이 프로토콜, 우리가 정확 하 게 동물을 해치지 않고 약 1 g을 간단 하 고 신속 하 게, 무게 물고기 50 µ L까지 볼륨을 관리할 수 있습니다. 이 방법은 삽 관 법 후 장 점 막 및 로컬 사이트에 같은 생물 의약품의 immunomodulatory 용량 붙일 이라는 화합물의 직접 vivo에서 이해를 탐험 수 있습니다. 장 조직의 confocal 현미경 검사 법, 정량, 조직학, cytometry 등 다운스트림 메서드를 결합해 서, 우리는 immunostimulants 또는 예방 접종 수 있는 방법을 장 점 막 방 벽을 교차, 통과 lamina propria 이해할 수 있다 고 장내 점 막 면역 시스템에 효과 발휘 하는 근육에 도달 합니다. 모델 후보 구두 prophylactics 및 전달 시스템 또는 로컬 효과 있는 구두 관리 생리 활성 화합물의 테스트 사용 될 수 있습니다.

서문

이 문서의 목표는 깊이에 유용한 연결 된 다운스트림 절차 함께 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 간단한 방법 설명. 제 브라를 사용 하 여 구강 삽 관 법의 전염병 역학, 구강 백신/immunostimulant, 마약/나노 통풍 관 및 효능, 장내 점 막 면역 연구에 실용적인 모델 되고있다. 예를 들어 zebrafish 구강 삽 관 법 진 균 marinum 고 진 균 peregrinum 감염¹의 연구에 사용 되었습니다. Lovmo 외. 또한 나노 입자 및 M. marinum 는 위장 지역 성인 zebrafish²를 제공을 성공적으로이 모델을 사용. 첸 외. 마약, 나노 입자에 의해 캡슐화 보여 zebrafish 구강 삽 관 법을 사용 하는 또한 때 관리를 통해 위장 관의 혈액 두뇌 방 벽³에서 수송 되었다. 이 저자 수행 Collymore 그 외 여러분 에 의해 설명 하는 gauvage 방법에 따라 삽 관 법 몇 가지 수정 ⁴ . 그러나, 그들은 구두 삽 관 법 절차를 설명 하는 매우 상세한 프로토콜을 제공 하지 않았다. 여기, 우리 Collymore 외 에 성인 zebrafish의 구강 삽 관 법에 대 한 방법 제시 ⁴ 우리는 더 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량 소장 관련 다운스트림 분석에 대 한 준비 포함.

소장 및 특히 그것의 점 막 감염에 대 한 방어의 첫 번째 라인 및 양분 통풍 관⁵의 주 사이트입니다. 상피 세포와 점 막 장벽 내에서 항 원 제시 세포 위험 신호 인식 때 즉시 타고 난 면역 반응은 트리거됩니다. 다음으로, 매우 구체적인 적합 한 면역 반응 T와 B 림프 톨^6,7으로 설정 됩니다. 구강 백신의 개발 백신에 현재 초점 지역 이다. 이러한 백신 노출된 사이트 점 막 관련 림프 조직 (맥 아)^8,9에 면역 세포의 특정 응답 때문에 유기 체를 보호 하기 위해 효과적인 도구 것입니다. 양식, 점 막 백신 주사 백신에 비해 분명 장점이 있다. 그들은 보다 적게 노동 집약 대량 예방 접종에 대 한 실용적, 물고기, 보다 적게 스트레스가 많은 있으며 젊은 물고기를 관리할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 점 막 백신 후보자 없이 구강 환경에서 변성 되 고 두 번째 직감 세그먼트를 도달 해야 한다. 그들은 또한 항 원 제시 세포 (Apc) 로컬 및/또는 조직의 응답¹⁰유도 하에 액세스 점 막 방 벽을 교차 해야 합니다. 따라서, 후보 구두 항 원 및 그들의 배달 시스템을 함으로써 점 막 통풍 관의 테스트, 갖는, 면역 반응 뿐만 아니라에 필수적입니다 구강 백신의 개발.

생물 의학 맥락에서 후 구강 삽 관 법은 성장 관심사의 이다 화합물의 생물 학적 효과 테스트 하는 모델을 개발. 내장의 해 부 및 생리 기능의 많은 포유류와 나폴레옹 물고기¹¹bilaterian 계보 사이 보존 됩니다. 다운스트림 분석에 연결 하는이 구두 삽 관 법 모델 생물 의약품에 대 한 테스트 땅 뿐 아니라 인간의 생물학으로 통찰력을 제공 하는 도구 일 수 있다 또는 다른 비보에화합물.

구강 삽 관 법 프로토콜 성공적으로 물고기는 높은 생존 율과 무게 1 g, 단백질 나노 입자 현 탁 액의 최대 50 µ L를 관리 예를 들어, 하나의 연산자에 의해 수행할 수 있습니다. 절차는 간단 설정 하 고 빠른; 1 시간에 30 물고기를 intubated 수 있습니다. 내장 준비를 위한 프로토콜은 후속 분석을 위한 질 세포 및 조직 샘플을 제공 하는 열쇠입니다. 다운스트림 결과의 예는 장 통풍 관에 관련 된 데이터를 취득 및 정량에 대 한 품질 RNA 격리 프로토콜의 유용성을 표시 하는 주어진 다. 프로토콜 내장에서 구두 prophylactics의 역학 또는 다른 화합물을 테스트 하는 적합 한 모델을 필요 들을 잘 사용 될 것 이다.

프로토콜

Zebrafish (Danio rerio)를 포함 하는 모든 실험 절차 연구와 관련 된 동물 (국제 원칙와 Universitat Autònoma de 바르셀로나 (CEEH 수 1582)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 EU 2010/63). 라이브 zebrafish 모든 실험 26-28 ° c.에 수행 되었다

1. 구강 삽 관 법에 대 한 장비 준비

1. 31 G Luer 잠금 바늘 바늘 팁을 커버 하기에 좋은 실리콘 튜브의 대략 1 cm를 놓습니다.
2. 컷 10 µ L 살 균 필터 피 펫 팁 (약 2cm), 미세한 끝과 칼 집으로 실리콘 튜브 위에 그것을 배치. 피펫으로 확장 부상 동물을 피하기 위해 바늘의 끝 다는 것을 확인 하십시오.
3. 100 µ L Luer 잠금 주사기 바늘을 연결 합니다.
   참고: 항상 에탄올으로 씻어 고 다음 인산 염 버퍼 (PBS, 자료를 참조) 치료 사이의 철저 하 게.

2입니다. 솔루션 필요

1. 150 mg/L (마 취) 또는 300 mg/L (안락사)는 zebrafish 유지는 수족관에서 물과 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) 솔루션의 준비. 마 취 솔루션의 1 리터와 작은 탱크를 화난 그것을 유지.
2. 물고기 복구에 대 한 MS-222 없이 수족관 물 1 리터와 함께 또 다른 작은 탱크를 화난 그것을 유지.
3. 살 균 재고 솔루션 x 10에서 1 x PBS의 50 mL를 확인 합니다.
4. Cytometry 분석/장내 세포 격리에 대 한 1 %v / v 페니실린과 스 (자료 참조)와 함께 물고기 재고 솔루션 또는 Dulbecco의 수정된이 글 매체 (DMEM) 분말 당 1 ml 충분 한 신선한 0.15% 콜라 유형 IV 솔루션을 준비 합니다. 2 mL 원심 분리기 튜브에 aliquots (물고기 당 1) 1 ml를 확인 합니다. 해 부 단계 전에 30 분까지 4 ° C에서 유지.
5. Confocal 현미경 검사 법/샘플 고정, 50 mL PBS에 신선한 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션의 준비 또는 재고 솔루션 증기 두건에서-20 ° C 냉장고에서 해 동.
   주의: PFA 독성이 있다. 그것으로 작업 하기 전에 물질 안전 데이터 시트를 읽어 보시기 바랍니다. 장갑, 안전 안경 착용 해야 하 고 항상 증기 두건 내부 솔루션을 떠나.

3. 준비 형광 나노 서 스 펜 션

1. Atto 488 NHS 에스테 르 단백질 나노 레이블 ( 테이블의 자료를 참조) 또는 제조업체의 지침에 따라 적절 한 형광 성 염료.
2. 2 mg/mL의 농도에서 0.1 M 탄산 버퍼에는 나노 입자를 resuspend.
3. 2 mg/mL에 디 메 틸 아민 무료 sulfoxide (DMSO)에 거 488 NHS 에스테 르 분해. 라벨 효율 (3.7-3.8 단계)을 확인 하는 10 µ L의 약 수를 유지 합니다.
4. 어둠 속에서 감동으로는 나노 입자와 1:2 (단백질: 염료)의 어 금 니 비율에서 Atto 488 NHS 에스테 르를 혼합.
5. 실 온에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여 레이블이 지정 된 나노 입자를 회전 시키십시오, 제거는 상쾌한 고 라벨 효율 (3.7-3.8 단계)을 확인 하.
6. Vortexing 및 아래로 pipetting으로 1 mL의 0.1 M 탄산 버퍼에 resuspending에 의해 레이블이 지정 된 나노 입자를 씻어. 다음 실 온에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다. 5 회 3.6 단계를 반복 합니다.
7. 15 mL 원심 분리기 튜브에 0.1 M 탄산 버퍼의 5 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 aliquots 형광 나노 입자의 1.5 mL 원심 분리기 튜브 (30 aliquots). 실 온에서 10 분 동안 8000 x g 에 아래로 회전, 삭제는 상쾌한 고 빛 으로부터 보호-80 ° C에 저장 합니다.
8. Microvolume 분 광 광도 계를 사용 하 여 라벨 효율성을 측정 합니다.
   1. 원래 거 488 솔루션 단계 3.3에서에서 유지의 1 µ L을 추가 (예를 들어, 볼륨 비율에 따라 1시 20분) DMSO에 희석. 이것은 단계 3.4에서 단백질 나노 입자와 거 488 믹스의 어 금 니 비율을 얻을 하는 데 사용 하는 볼륨입니다.
   2. 3.5 단계에서 라벨 반응에서 저장 된 상쾌한의 1 µ L를 가져가 라. 흡수 (abs) 측정 = 501 nm. 라벨의 백분율은:
      (
9. 실험 전에 나노 서 스 펜 션 1 x PBS 솔루션을 사용 하 여 원하는 농도에서 준비 합니다.

4. 제 브라 Anesthetization 및 구강 삽 관 법

1. 빠른 물고기 (> 0.5 g) 이상 48 h 소장을 실험 하기 전에.
2. 하룻밤 순응¹²수 있도록 실험 전에 실험 탱크 (6 패) 물고기 (12 생선)을 이동 합니다.
3. 회오리 잘 나노 솔루션 (예: 2500 rpm 및 30 s) 보호 바늘에 연결 된 주사기에 원하는 양의 나노 서 스 펜 션 (예를 들어, 20-50 µ L)를 그립니다.
4. 화난된 150 mg/L MS에서에서 장소 물고기-222 솔루션 (섹션 2 참조) 그들은 탱크의 바닥에 가라앉을 때까지 꼬리 핀치;에 응답 하지 않는 이 과정에는 5 분 미만 걸립니다.
5. 신속 하 게 젖은 플라스틱 쟁반에 그물과 마 취 물고기를 전송, 바늘 얼굴과 구강 삽 관 법을 즉시 시작 하 가로 동물을 찾으시는.
6. 조심 스럽게 한 손으로 물고기를 지원 하 고 보호 된 바늘을 사용 하 여 다른 손으로 입을 열어. 부드럽게 열고 입에서 약 1 cm 식도 아래로 바늘을 삽입 합니다.
   참고: 연산자는 피 펫 팁의 끝은 길 통과 하는 때 약간의 저항을 느낄 수 있습니다. 알아서 하지 각도 아가미 구멍 수 있습니다 너무 많은 바늘 항목.
7. 천천히 물고기를 나노 입자 현 탁 액을 주입. 정지 아가미 또는 입을 통해 밖으로 흐름 하지 않습니다 다는 것을 확인 하십시오.
8. 부드럽게 바늘을 제거 하 고 복구 탱크 (섹션 2 참조)에 물고기를 놓습니다. 복구는 일반적으로 1 분 이내 소요 됩니다.
9. 신중 하 게 어떤 이상에 대 한 물고기를 확인 하십시오 (예를 들어, 아가미에 출혈 구멍 뚫 기의 표시 이다).
10. 일단 물고기, 회복 실험 탱크에 그들을 반환 합니다.

5. 제 브라 내장 해 부

1. 지정 된 기간 후 게시 삽 관 법 (예를 들어, 5 h / 24 h), 장소 300 mg/L MS에 그물을 사용 하 여 물고기-안락사 (섹션 2 참조)에 대 한 222 솔루션. operculum 이동 중지 하 고 아무 꼬리 핀치 반사는 다는 것을 확인 하십시오. 5 분은 일반적으로 충분 합니다.
2. 그물을 가진 안락사 동물을 선택 하 고 필터 종이에 그것을 배치.
   참고: 필터 종이 소장을 따라 접착제 조직을 제거에 대 한 매우 유용 합니다.
3. 날카로운 해 부가 위를 사용 하는 operculum에 항문에서 세미 원형 절 개 및 오픈 절 개 괜 찮 핀셋을 사용 하 여 확인 합니다. 내장의 양쪽 끝을 잘라, 모든 내부 장기를 꺼내와 필터 종이에 그들을 배치.
   주의: 세포 대사와 죽음을 줄이기 위해 신속 하 게 작동 합니다.
   참고: 또는, PBS에 얼음에 접착제 조직을 제거 합니다.
4. (앞쪽 후부 장 세그먼트) 방향을 유지 하 고 그것을 밖으로 기지개 하는 내부 장기에서 내장을 분리 합니다. 일반적으로, 내장의 앞쪽 세그먼트는 후부 세그먼트 보다 넓은. 내장의 모든 해 부 할 때를 돌 봐.
   참고: 후부 끝은 아주 작은 물고기에 연약한 고 끊다 수 있습니다, 특히 동물에서에서 < 0.7 g.
5. 소장에서 접착제 조직 분리 하기 위해 핀셋으로 필터 종이에 소장 롤.
6. 다양 한 다운스트림 분석 (섹션 6, 7, 8)에 대 한 소장을 준비를 진행 합니다.

6. Cytometry 장 세포 준비

1. 0.15% 콜라 솔루션 (섹션 2.4 참조)의 aliquots 사전에 준비 합니다.
   참고: 계속 하기 전에 실내 온도에 Aliquots 이어야 한다.
2. 옵션: 단계 5.5에서에서 계속, 슬릿 오픈 소장 경도 하 고 1x PBS로 세척.
3. 핀셋을 사용 하 여, 0.15% 콜라 솔루션으로 가득 2 mL 원심 분리기 튜브에 내장을 놓습니다.
4. 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 수직 실험실 회전자에 튜브를 놓습니다.
5. 100 µ m 셀 거르는 50 mL 원심 분리기 튜브 지원에 소장을 놓습니다. 50 mL 원심 분리기 튜브에 샘플을 통해 흐름을 수집 1 x PBS로 3 번 세척 5 mL 주사기 플런저와 소장을 휴식.
6. 4 ° c.에서 10 분, 400 x g 에서 50 mL 원심 분리기 튜브 원심
7. 신중 하 게 일부는 점액에 연결 될 수 있습니다, 셀을 잃지 않는 하는 동안 상쾌한의 대부분에서 피 펫.
8. Resuspend 1 x PBS의 500 µ L 원심 분리기 튜브의 하단에 장 세포와 cytometry 분석까지 얼음에 계속
9. 5 mL로 30 µ m 셀 필터를 통해 필터 샘플 하단 튜브 cytometry에 대 한 라운드.
10. 매개 변수 (예를 들어, 분석에 대 한 셀의 수, 관심 지역, 전압 보상, 검출기의 선택) cytometer 장비에 설정 (자료 참조).
11. 즉시 분석에 사용¹³의 지침에 따라는 cytometer 세포.

7. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 내장 Cryosections 준비

1. 플라스틱 몰드 채우기 ( 재료의 표참조) 절반 볼륨 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물.
2. 신중 하 게 장소 단계 5.5에서에서 해 부 후에 즉시 계속, 플라스틱 형 소장. 내장은 완전히 O.C.T. 화합물에서 포함 된 다는 것을 확인 하십시오. 필요한 경우, 플라스틱 형에 더 O.C.T. 화합물을 추가 합니다.
   참고: 그것은 쉽게 자연 방향을 따라 복합 O.C.T.에 "Z" 모양으로 소장을 배치 하 고 좋습니다.
3. (1 분 미만) 불투명가 될 때까지 드라이 아이스에 플라스틱 금형을 놓습니다.
4. 장기간 사용 하거나 즉시 다음 절차를 사용 하 여 프로세스에 대 한-80 ° C에서 플라스틱 금형을 저장 합니다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
5. 10 µ m 섹션 또는-20 ° c.에 있는 cryostat를 사용 하 여 적절 한 간격으로 냉동된 내장 슬라이스
6. 슬라이드에 좋은 브러쉬 내장 섹션을 수집 합니다.
7. 4%에서 슬라이드를 담가 PFA 실 온에서 15 분에 대 한 예제를 해결 하기 위해.
   주의: PFA 독성이 있다. 그것으로 작업 하기 전에 물질 안전 데이터 시트를 읽어 보시기 바랍니다. 장갑, 안전 안경 착용 해야 하 고 항상 증기 두건 내부 솔루션을 떠나.
8. 슬라이드 1 x PBS, 10 분으로 3 회 씻는 다.
9. 설치 매체의 한 방울을 추가 하 고 장소는 coverslip 표본.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
10. 적절 한 배율에 confocal 현미경 샘플을 관찰 합니다.

8. 실시간 정량 pcr (RT-정량) 소장 준비

1. 단계 5.5에서에서 계속, 극저온 유리병에 내장을 넣어 하 고 빠르게 사용까지 액체 질소와-80 ° C에 게 소장을 동결.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
2. 균질, 추가 200 µ L 2% (v/v)의 냉장 1-Thioglycerol/균질 솔루션 ( 재료의 표참조) 또는 대체 균질 솔루션 내장 샘플을.
3. 신속 하 게 작업, 얼음에 내장 샘플 균질 아니 보이는 조직까지 (25-30000 rpm 설정) 빠른 속도로 실험실 균질 화기 파편 남아 있다. 5를 3 번 s 일반적으로 충분 하다.
4. 상업을 사용 하 여 RNA를 분리 ( 재료의 표참조) 키트 제조 업체의 지침¹⁴ 또는 적당 한 다른 방법. 필요에 따라 장기간 사용-80 ° C에서 RNA를 저장 합니다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
5. ¹⁵ 분 광 광도 계 사용 하 여 RNA 농도 계량 하 고 RNA 분석기¹⁶를 사용 하 여 품질을 평가 합니다.
6. 1 µ g 또는 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용 하 여 cDNA의 적절 한 금액을 준비 합니다.
   참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 정량 분석을 위한 MIQE 지침¹⁷을 따르시기 바랍니다.
7. 관심사의 유전자/s에 대 한 적절 한 뇌관 쌍을 디자인 합니다.
8. 적합 한 참조 유전자를 선택 하 고 실시간 정량 검출에 의해 각 유전자의 표현 분석 상업을 사용 하 여 시스템 키트 (자료 참조).
   참고: 예를 들어 정량 플레이트의 각 잘 10 µ L의 최종 볼륨에서 SYBR 녹색 supermix의 5 µ L, 0.5 µ M 뇌관, 희석된 cDNA의 2.5 µ L 및 1.5 µ L의 물 추가 합니다.

결과

제 브라 (중량 평균: 1.03 ± 0.16 g) 혼합 섹스 했다 성공적으로 intubated 다른 재조합 단백질 나노 입자 (세균 포함 시체)가 우리 집에서 만든 구강 삽 관 법 장치 (그림 1)를 사용 하 여 함께. 우리는 성공 구강 삽 관 법을 수행 하 고 낮은 평균 비율 사망률 (6.8%) (표 1)입니다. Zebrafish 되었고 중 intubated 30 µ L 또는 나노 입자 현 탁 액의 50 µ L 사망...

토론

이 프로토콜은 Collymore 그 외 여러분 에 의해 구강 삽 관 법에 대 한 앞에서 설명한 방법의 개선 ⁴ 우리의 프로토콜 구강 삽 관 법 방법 자세히 설명 하 고 다운스트림 분석에 대 한 내장의 준비를 포함 한다. 우리의 방법은 사업자 사이 많은 변화 없이 빠르게, 전체 프로토콜을 수행 하는 한 사람을 허용 하는 물고기 조작 속도를 향상 시킵니다. 우리의 이전 프로토콜의 주요 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon tube	Dow Corning	508-001	0.30 mm inner diameter and 0.64 mm outer diameter
Luer lock needle	Hamilton	7750-22	31 G, Kel-F Hub
Luer lock syringe	Hamilton	81020/01	100 μL, Kel-F Hub
Filtered pipette tip	Nerbe Plus	07-613-8300	10 μL
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	powder
10x PBS	Sigma Aldrich	P5493
Filter paper	Filter-Lab	RM14034252
Collagenase	Gibco	17104019
DMEM	Gibco	31966	Dulbecco's modified eagle medium
Penicillin and streptomycin	Gibco	15240
Cell strainer	Falcon	352360
CellTrics filters	Sysmex Partec	04-004-2326 (Wolflabs)	30 µm mesh size filters with 2 mL reservoir
Tissue-Tek O.C.T. compound	SAKURA	4583
Plastic molds for cryosections	SAKURA	4557	Disposable Vinyl molds. 25 mm x 20 mm x 5 mm
Slide	Thermo Scientific	10149870	SuperFrost Plus slide
Cover glasses	Labbox	COVN-024-200	24´24 mm
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Atto-488 NHS ester	Sigma-Aldrich	41698
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit	Promega	AS1340
1-Thioglycerol/Homogenization solution	Promega	Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit	adding 20 μl 1-Thioglycerol to 1 ml homogenization solution (2%)
vertical laboratory rotator	Suministros Grupo Esper	10000-01062
Cryostat	Leica	CM3050S
Homogenizer	KINEMATICA	Polytron PT1600E
Flow cytometer	Becton Dickinson	FACS Canto
5 mL round bottom tube	Falcon	352058
Confocal microscope	Leica	SP5
Fume Hood	Kottermann	2-447 BST
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	Spectrophotometer
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent	G2939A	RNA bioanalyzer
Maxwell Instrument	Promega	AS4500
iScript cDNA synthesis kit	Bio-rad	1708891
CFX384 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855485
iTaq universal SYBR Green Supermix kit	Bio-rad	172-5120
Water	Sigma-Aldrich	W4502
Cryogenic vial	Thermo Fisher Scientific	375418	CryoTube vial
Mounting medium	Sigma-Aldrich	F6057	Fluoroshield with DAPI