פפטיד40 MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות הנוכחות של נויטרופילים בסעיפים היסטולוגיה קבוע/permeabilized ולהעריך את מצב ההפעלה נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. בפרט, פפטיד₄₀ MUB מאגד לקטופרין נוכח בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. חשיפה של התכנים גרגר דרך permeabilization או הפעלה נויטרופילים מאפשר הסימון של נויטרופילים.

Abstract

כאן, אנו מספקים פרוטוקול הכרוכות של MUB₄₀, פפטיד מסונתזת את היכולת לאגד לקטופרין glycosylated המאוחסן בריכוזים גבוהים בגרגרים שלישוני וספציפית של נויטרופילים. זה פרטי פרוטוקול איך MUB₄₀ מצומדת ישירות אל fluorophore יכול לשמש כתם נויטרופילים ברקמות קבוע/permeabilized וכן איך ניתן להשתמש ב- live-תא הדמיה כדי assay הפעלה נויטרופילים, פרור ולהשתחרר. שיטות איתור נויטרופילים מוגבלות תלויי מין נוגדנים חד-שבטיים, אשר אינם תמיד מתאים עבור יישומים מסוימים. MUB₄₀ אינו לחדור את קרום התא, ולכן נכללו לקטופרין המאוחסן בשאינם-מופעל/הלא-permeabilized נויטרופילים. MUB₄₀ יש ערך מוסף של הכרה לקטופרין ממגוון המארחת רחב, שימושי במיוחד עבור השוואת תוצאות מחקרים שכללו מספר מודלים מחקר, צמצום מספר ריאגנטים כפולים, ופישוט פרוטוקולים דרך מכתים צעד אחר צעד.

Introduction

נויטרופילים באחת הזרועות העיקרית של מערכת החיסון המולדת, מגויסים באופן שגרתי לאתרים של דלקת סביב הגוף. המחקר של נויטרופילים נפגע במידה רבה על ידי שלהם אורך קצר במבחנה (פחות מ- 8 שעות) על ידי כלי איתור מוגבלת בתנאים הבזליים או לאחר ההפעלה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נבדק היטב עבור גילוי רחב וספציפי של נויטרופילים בתרבית של דגימות קבוע/permeabilized. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט עבור צביעת נויטרופילים לחיות עם MUB₄₀. באמצעות פרוטוקול מכתימים נויטרופילים בשידור חי, העיתוי והמיקום של הפעלת נויטרופילים יכול ניתן למצוא. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור חוקרים המבקשים ללמוד שחרור הפעלה או גרגר נויטרופילים. מעבר שלהם פונקציות מיקרוביאלית, נויטרופילים יתקבלו בברכה עכשיו כתאים immunomodulatory מעורב במגוון רחב של מחלות תגובות מערכת החיסון (מולדת ולא אדפטיבית)^1,2. הנויטרופילים הם נוכח רקמות דלקתיות ביותר, במספרים גבוהים ברקמות נגוע, גידולים דלקתיות³, במהלך IBS, קרוהן התלקחויות⁴, ו באזורים של דלקת שאינן זיהומיות כגון synovia של דלקת מפרקים שגרונית ( חולי RA)⁵. נויטרופילים להכיל ארבע כיתות של גרגרי הקבועים מראש בשם azurophil (α), ספציפי (β1), גרגרי השלישון (β2) והפרשה שלפוחית (γ)⁶. על ההעברה לאתר דלקתיות, נויטרופילים מגויס להיות מופעל, ברצף להפריש גרגר תוכן (מורכבת אדהזיה, תרכובות מיקרוביאלית ומולקולות immunomodulatory), אשר מקדם נוסף גיוס ותורמת זיהום רזולוציה (אלא גם כדי נזק לרקמות מארח)⁷. בעוד נויטרופילים נחשבים היבט חשוב של מולדת חסינות, לצאת לשם עם ריאגנטים זיהוי כמה זמין ללמוד אותן, אפילו פחות כי ניתן להשתמש כדי להעריך את מצב ההפעלה של נויטרופילים לחיות.

שיטות הנוכחי של גילוי נויטרופילים להסתמך על נוגדנים חד-שבטיים שנוצר כנגד אנטיגנים חשוף תא-השטח, כגון Ly - 6 G² או חלבונים ספציפי המאוחסן בגרגרים נויטרופילים בתנאים הבזליים (למשל, myeloperoxidase לקטופרין). היתרונות של נוגדנים חד-שבטיים כוללים שלהם הנחשב חזק, רגישות, רב-תכליתיות בתנאים assay שונים. עם זאת, ישנם מספר חסרונות באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ו- anti-Ly - 6G בפרט. חסרונות אלה כוללים יחודיות, כמו Ly - 6G הוא נוכח במרבית התאים מיאלואידית במח העצם ועל כל גרנולוציטים כולל אאוזינופילים; לפיכך, פיענוח נויטרופילים של אאוזינופילים עם סמן זה דורש יותר מתחמי מתקרב⁸. עוד חליפין תכופים עם נוגדנים חד-שבטיים הוא בהיקף ירידה לפרטים מארח לעיתים קרובות מוגבל, מקשה על מחקרים השוואה עם מיני בעלי חיים אחד או יותר. החיסרון השלישי של שיטות זיהוי נוגדנים, במיוחד כאשר באמצעות תאים חיים או ויוו, הוא הפוטנציאל שלהם כדי לשבש את תפקוד התא או להוביל ההפעלה התא. לדוגמה, הממשל של אנטי-Ly - 6G לעכברים בדרך כלל חלה על דלדול נויטרופילים, נויטרופניה ארעי⁹. זה בנוסף הוכח כי הזרקת נוגדנים עשוי לעורר פונקציה antitumor נויטרופילים¹⁰. לבסוף, זיהוי נוגדנים של נויטרופילים אינו חושף את מצב ההפעלה של התא.

זיהינו פפטיד חומצה אמינו 40 בשם MUB₄₀, אשר יכול לשמש במספר מבחני תווית נויטרופילים בתנאים במבחנה או ויוו , כמו גם assay את מצב ההפעלה של נויטרופילים בשידור חי¹¹. MUB₄₀ נגזרת₇₀MUB¹², תחום של לקטובצילוס reuteri פני השטח מחייב ריר החלבון במקור תיאר את יכולתו לקשור ריר^13,14. MUB₄₀ אינטראקציה עם לקטופרין glycosylated הקיים בריכוזים גבוהים בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. יכול להיות חשופים MUB₄₀ גרגירים אלה הצעדים permeabilization סטנדרטי, נוכח histopathology או תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) פרוטוקולים עבור צביעת חזקים של נויטרופילים קבוע. כאשר נויטרופילים לחיות נשמרים במצב מוחלש, פפטיד₄₀ MUB הוא נשלל מן התכנים גרגר, התאים אינו מכתים חיובית עם הסמן. בעת ההפעלה, MUB₄₀ ניתן לאגד לקטופרין חשוף, להוביל מכתים חזקים עם פפטיד. לפיכך, MUB₄₀ יכול לשמש כדי לקבוע את מצב ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים, שהופך אותו סמן אטרקטיבי כדי לעקוב אחר תהליך זיהומיות. היכולת לאגד לחיות נויטרופילים הופעל גם מאפשר MUB₄₀ לשמש ככלי, לזהות אזורים דלקתיים נויטרופילים במודלים חיים של בעלי חיים (למשל, מודל דלקת פרקים¹⁵העכבר). הפרוטוקולים בפירוט כתב היד הזה איך fluorescently הנקרא MUB₄₀ יכול לשמש כדי לחשוף נויטרופילים ב היסטולוגיה רקמות וכיצד assay את ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים חיים במבחנה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן נבדקו ואושרו על ידי ארגוני הצרפתי CoRC (Comité de Recherche קליניק) CPP (des Comité דה הגנה Personnes), CNIL (הועדה הלאומית ואח ליברטה).

1. צביעת נויטרופילים ברקמת Histopathology עם Fluorescently מתויג MUB₄₀

1. כדי להשיג את הרקמה עבור histopathology, לתקן מקטעים ביופסיה רקמות/נפח מתאים של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 30 דקות עד 4 h תלוי בעובי של המדגם. מקם את הדגימות במקרר 4 ° C במהלך קיבעון.
   הערה: שיטות קיבוע חלופי/תזמונים. הרבה בהתבסס על הצרכים הייחודיים של המשתמש.
   1. להסיר את כדורגלן, להוסיף 16% סוכרוז פתרון עם נפח מספיק כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, ולמקם את הדגימה ב 4 ° C ל-4 שעות עד לילה.
   2. הסרת 16% סוכרוז פתרון להוסיף 30% סוכרוז פתרון בכל נפח גדול מספיק כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, ומקם אותו ב 4 ° C ל-4 שעות עד לילה.
   3. הסר את הפתרון 30% סוכרוז, למחוק את הפתרון עודף מרקמות עם מגבת נייר. במקום סעיף הרקמה בתקשורת טמפרטורה (אוקטובר) חיתוך אופטימאליים, snap-הקפאת ב- 2-methylbutane מקורר באמבט קרח יבש-אתנול (-72 מעלות צלזיוס). ברגע קפואה (לאחר ~ 2 דקות), להסיר בלוקים מ- 2-methylbutane ומניחים אותם על קרח יבש עד אבני כרגע מוכן לאחסון לטווח ארוך. אחסן את רחובות קפוא ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
2. בלילה לפני אבני רקמה הן לחתוך, להסיר אותם מן המקפיא-80 ° C, למקם אותם ב-20 ° C בלילה כדי equilibrate.
   1. שימוש של cryostat, OCT-מוטבע רקמות לחתוך לפרוסות בעובי μm 10 - 30, לספוח על שקופיות זכוכית באיכות גבוהה.
      הערה: ניתן להשתמש פרוסות עבה או דק יותר בהתאם לדרישות ניסיוני.
   2. עם עט שעווה או שיטה אחרת הידרופוביות, צייר תיבה מסביב הפרוסה רקמות בשקופית זכוכית ותנו יבש.
   3. להכין את הפתרון צביעת על-ידי ביצוע לדילול 1:1,000 MUB₄₀-Cy5 (או גירסה₄₀אחרים MUB פלורסנט, פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל) ב- 0.1% סאפונין-PBS פתרון. ריכוז₄₀ MUB הסופי אופטימלית צריך להיות 1 μg/mL.
      הערה: ריכוז סופי נמוך יותר ניתן להשתמש (0.1-0.01 μg/mL) אבל עלול לגרום להורדת עוצמת האות.
      התראה: אבקת סאפונין יכול לגרום לגירוי של הנשימות. הקפד לשקול סאפונין באזור ארון או מוגן. ניתן להשתמש בשיטות חלופיות permeabilization כגון טריטון. להוסיף סמנים נוספים בריכוזים מומלץ יצרן (למשל., 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), phalloidin, פלורסנט נוגדנים).
   4. בעדינות לטבול את השקופית זכוכית לתוך פתרון של 0.1% סאפונין-PBS שלוש פעמים.
   5. בזהירות כתם נמצא עודף נוזל סביב סעיף הרקמה ומוסיפים מספיק פתרון מכתימים לכסות לגמרי את סעיף הרקמה. מקם את השקופית לתא לחות כדי למנוע אידוי דגירה זה לשעה בטמפרטורת החדר. . לשמור את זה מוגן מפני אור.
   6. בעדינות לטבול את השקופית בתוך תמיסת סאפונין-PBS 0.1% 3 x. ואז, בעדינות לטבול את השקופית לתוך PBS פתרון 3 x. לבסוף, בעדינות לטבול את השקופית לתוך מזוקקים H₂O 3 x. בזהירות יבש עודף נוזל מתוך השקופית.
   7. להוסיף כמות קטנה (~ 20 μL) של הרכבה בינונית (20 מ מ טריס pH 8.0, מספר N-propyl 0.5%, 90% גליצרול) ליד הפרוסה רקמות ולהניח בעדינות למטה coverslip זכוכית על גבי השקופית זכוכית. בעדינות ובצורה שווה הקש את coverslip אל סעיף הרקמה, בעזרת מגבת נייר, הסר בזהירות אמצעים כלשהם הרכבה extrudes מסביב לקצוות של coverslip.
   8. למקם את השקופית הנטען בארון חשוך במשך 24 שעות ביממה לאפשר את התקשורת הרכבה לגבש. לחלופין, במקום השקופית הנטען בגיל 37 מעלות לשעה.
3. תמונה הפרוסות רקמות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפי שיטת הרכישה הרצוי.

2. הדמיה של הפעלת נויטרופילים עם רטרו-Inverso-MUB₄₀-Cy5 פפטיד

1. להשיג נויטרופילים האנושי באמצעות פרוטוקול הבאים. להכין את הפתרונות הבאים, מקם אותם בתוך ארון ללון אנאוקסיים. חשיפה לחמצן יתחיל להפעיל נויטרופילים, עוד יותר לגרום לתא המוות^16,17.
   הערה: נויטרופילים יכול לחילופין להיטהר "על הספסל" MUB₄₀-תיוג ניסויים; עם זאת, להיות מודע כי חשיפה חמצן יתחיל להשפיע על הפעלת נויטרופילים.
   1. הכן את הפתרון הבא:
      פתרון 1 [נתרן כלורי (NaCl) 0.9%]: הוספת 4.5 גר' NaCl עד 500 מ"ל של H₂O. מסנן הפתרון.
      פתרון 2 (לתוספי 6%): להוסיף 6 גר' לתוספי בפתרון 0.9% NaCl 100 מ ל.
      פתרון 3 (מאגר כביסה): להמיס חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב- PBS pH 7.2 כדי ריכוז EDTA הסופי של 2 מ מ. מייד לפני שימוש, להתמוסס שור אלבומין (BSA) בפתרון PBS/EDTA כך הריכוז הסופי של BSA הוא 10% w/v.
   2. צנטריפוגה צינורות איסוף דם ב g x 650 במשך 20 דקות בלי הפסקות.
   3. מבלי לשבש את פעולת הדם מופרדים, העברת צינורות איסוף דם שברים אנאוקסיים בארון, לאסוף פלזמה (למעלה) צינור חרוטי 50 מ.
   4. הסר את הצינור המכיל פלזמה מן הארון אנאוקסיים צנטריפוגה ב 2,900 x g כעשרים דקות עם הפסקות כדי הצניפה טסיות הדם.
   5. מבלי לשבש את פעולת טסיות הדם pelleted, בעדינות העברת הצינור פלזמה בחזרה לתוך ארון אנאוקסיים ו pipet טסיות פלזמה המסכן לתוך צינור מ"ל (להלן נקרא"פלזמה").
2. הפרדת תאי דם אדומים של לויקוציטים
   1. באמצעות הצינורות המכילים כדוריות דם אדומות (RBCs) משלב 2.1.3., לשלב את RBCs לתוך צינור חרוטי 50 מ ל (5 דם אוסף שפופרת תוכן למחזור 50 מ ל).
   2. הוסף את NaCl 0.9% עד לנפח הכללי מגיע 44 מ. להוסיף 6 מ של לתוספי 6% (האחרונה).
   3. מערבבים בעדינות את תערובת דם/לתוספי על-ידי היפוך הצינור 10 - 20 פעמים. תן המשקע צינור במשך לפחות 30 דקות.
   4. בזמן שקיעת מתרחש, להכין מעבר צבע Percoll על-ידי הוספת 4.2 מ של Percoll פתרון 5.8 מ ל פלסמה צינור חרוטי 15 מ"ל ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית.
   5. לאסוף את השבר העליונים של לתוספי אמנם מנסה למנוע pipetting כדוריות דם אדומות.
   6. להדק את הבורג כובע, להסיר את הצינור לתוספי תא אנאוקסיים, centrifuge את הצינור ב- 300 גרם x 10 דקות עם הפסקות.
   7. בזהירות למקם את הצינור בחזרה אל החדר אנאוקסיים מבלי להפריע את התאים pelleted, ולהסיר את הנוזל דרך pipetting.
   8. בעדינות מחדש להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של פלסמה ולהוסיף לאט מאוד לחלק העליון של הפתרון Percoll. יש להיזהר לא לגרום ערבוב השכבות כאשר pipetting את התאים למעלה.
   9. הסר בזהירות את הצינור פתרון Percoll מן אנאוקסיים קאמרית (הימנעות ערבוב), והוא צנטריפוגה ב 800 x g במשך 20 דקות בלי הפסקות. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) יישאר על פני הפתרון Percoll, נויטרופילים גלולה עם RBCs.
3. הסרת מזהמים RBCs
   1. להכין 14 מ"ל לרחוץ את בופר על-ידי הוספת 700 μL PBS + 10% BSA 14 מ"ל לרחוץ את המאגר.
   2. מקם את הצינור פתרון Percoll בחזרה אל החדר אנאוקסיים. להסיר את Percoll ואת PBMCs ויה pipetting והשהה מחדש את התאים pelleted 1 מ"ל לרחוץ את בופר. בגדר להיות מושעה מחדש יהיה צבע אדום בשל RBCs משחיתה.
   3. להוסיף 200 μL של אנטי-CD235a (glycophorin) beads מגנטי על התאים מחדש על תנאי, מערבבים בעדינות, תקופת דגירה של מינימום של 15 דקות. שלב זה טוען את RBCs מזהמים עם חרוזים מגנטי כך שניתן להסירם.
   4. שטיפת העמודה ההפרדה עם 2 מ של כביסה מאגר 3 x.
   5. בעוד אתה מחזיק צינור חרוטי 15 מ"ל תחת העמודה ההפרדה, pipette לאט לאט את התערובת נויטרופילים/RBC לחלק העליון של העמודה. לאסוף את התאים בצינור חרוט 15 מ"ל כפי שהם זרימה דרך. הזרימה דרך צריך להיות מעונן ולאבד את הצבע האדום בשל RBCs שנותרו מאוגד לעמודה.
   6. להוסיף 2 מ"ל לרחוץ את מאגר לחלק העליון של העמודה ולאסוף בצינור חרוט באותה 15 מ"ל. בסוף לשטוף את 2 מ"ל, הזרימה דרך צריך להיות ברור, המסמלת את כל נויטרופילים שנאסף.
   7. מערבבים בעדינות את הצינור כדי להבטיח הפצה אפילו של נויטרופילים ולאסוף μL 10 לספירת תאים. שימו לב הכרך האחרון עבור תא ספירת למטרות. למנות את המספר הכולל של תאים עם תא סטנדרטי כלשהו לספור בשיטה.
   8. הסר את הצינור נויטרופילים תא אנאוקסיים, centrifuge נויטרופילים ב g x 300 כעשרים דקות עם הפסקות.
   9. במקום נויטרופילים sedimented בחזרה אל החדר אנאוקסיים ולהסיר את המאגר כביסה דרך pipetting. מחדש להשעות בגדר נויטרופילים בפלסמה עם צפיפות התאים המרבי של 10⁷ נויטרופיל/mL.
4. ספירת נויטרופילים מטוהרים והדמיה באמצעות MUB₄₀
   1. להוסיף 1 μL של רי-MUB₄₀-Cy5 (1 מ"ג/מ"ל) 1 מ ל Rosewell פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני ללא פנול אדום. מערבבים על-ידי pipetting טוב.
   2. למטרות של פרוטוקול זה, התוצאה יש כבר המתוארים כאילו נויטרופילים חזק הפעלת ריאגנט, N-formylmethionyl-leucyl-פנילאלנין (FMLP), הוא הוסיף. להוסיף 1 μm של FMLP RPMI/רי-MUB₄₀-Cy5 צינור מיקס ויה pipetting למעלה ולמטה.
      הערה: כל הליך ניסיוני יהיה שונה מנקודה זו ואילך, בהתאם לשאלות נותרים ללא מענה.
   3. העברה של 1 מ ל RPMI/רי-MUB₄₀-Cy5/FMLP תערובת על צלחת זכוכית מיקרוסקופ התחתון. את המאכל הזה, להוסיף נפח של מטוהרים תאים המתאימים 10⁶ סה כ נויטרופילים. מערבבים על ידי בעדינות pipetting.
   4. למקם את המנה במיקרוסקופ פלורסנט הפוכה ולהתחיל ייבוא תמונות. לדוגמה, מומלץ לרכוש תמונות בסיסית לפני התוספת של נויטרופילים-הפעלת ריאגנט כגון FMLP או חיידקים. בדוגמה זו, הפעל את רכישת RPMI/רי-MUB₄₀-Cy5/נויטרופילים, ו- timepoint מאוחר יותר, pipette הכימית נויטרופילים-הפעלת לתוך קערה מזכוכית ולהמשיך ייבוא תמונות.
      הערה: השינויים שביצעת את השלבים הבאים ניתן לבצע בהתבסס על צרכי מדעי.
   5. תהליך רכש תמונות/זמן-lapse סרטים כמו מתייחס המיקרוסקופ ספציפי משמש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תוצאות של MUB₄₀-רקמות מוכתם משקופיות histopathology בדרך כלל לחשוף תאים בודדים פזורים ברחבי הרקמה. MUB₄₀ כתמי לקטופרין, שהוא נוכח בגרגרים נויטרופילים ממודר. לכן, בדרך כלל ראיתי להכתים punctate או במספר תחומים נפרדים גדולים של האות מגיעים בודדים נויטרופילים (איור 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

. הנה, שני מבחני מתוארים שבו משמש של פפטיד₄₀ MUB ללמוד דלקת נויטרופילים והפעלה. אנו מראים איך MUB₄₀ יכול לחשוף נויטרופילים להציג בסעיפים histopathology או להציג מצב ההפעלה שלהם באמצעות נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. לשלבים הקריטיים עבור שימוש MUB₄₀ ריאגנט מוכתמים הם בדיוק כמו עם כל שיט...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixative for histology
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Used to section tissues
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	Hi precision coverslip
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Stains DNA
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope	Various	Various	Used to image IF slides
Anoxic Cabinet	Various	Various	Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Washing buffer component
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Washing buffer component
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Used to remove contaminating RBCs
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Used for neutrophil assays