Neutrophil 중재 염증 이벤트 감지에 사용 하기 위해 MUB40 펩 티 드

요약

여기, 선물이 조직학 고정/permeabilized 섹션에서 호 중구의 존재를 감지 하 고 라이브 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 평가 하는 프로토콜. 특히, MUB₄₀ 펩타이드 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 바인딩합니다. Permeabilization 또는 호 중구 활성화 통해과 립 내용의 노출 호 중구의 마킹 할 수 있습니다.

초록

여기, 우리 MUB₄₀, 호 중구의 특정 및 3 차과 립에 높은 농도에서 저장 하는 당화 lactoferrin 바인딩 수와 합성된 펩 티 드의 사용을 포함 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이 호 중구 활성화 및 탈과 립에 대 한 분석 결과를 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있는 방법 뿐만 아니라 고정/permeabilized 조직에 호 중구 얼룩 어떻게 MUB₄₀ 는 fluorophore에 직접 활용이 프로토콜 세부 정보를 사용할 수 있습니다. 호 중구 탐지 방법 항상 특정 응용 프로그램에 적합 하지 않은 종의 단일 클론 항 체로 제한 됩니다. MUB₄₀ 세포 막 침투 하지 않습니다 하 고 따라서 lactoferrin 비-활성화/비-permeabilized 호 중구에 저장에서 제외 됩니다. MUB₄₀ 는 그것을 여러 연구 모델을 포함 하는 연구에서 결과 비교 하는 데 특히 유용 하 게 만드는 광범위 한 호스트 범위에서 lactoferrin 인식의 추가 혜택 중복 시 약의 수를 줄이고 프로토콜을 단순화 통해 단일 단계 얼룩.

서문

호 중구는 타고 난 면역 시스템의 주 무기 중 하나 이며 정기적으로 시체 주위 염증의 사이트에 보충. 호 중구의 연구는 그들의 짧은 수명에은 생체 외에서 (8 h 미만) 및 제한 된 검색 도구 기저 조건 또는 활성화 후 크게 손상 되었습니다. 여기, 우리 고정/permeabilized 샘플에 포유류 호 중구의 광범위 하 고 구체적인 검색 잘 테스트 프로토콜을 제시. 우리는 또한 라이브 neutrophils MUB₄₀얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 라이브 호 중구 얼룩 프로토콜을 사용 하는 타이밍 및 호 중구 활성화의 위치 수 수 정확히 지적. 이 프로토콜은 호 중구 활성화 또는 립 출시를 공부 하고자 연구에 이상적입니다. 넘어 그들의 항균 기능, 호 중구 지금 immunomodulatory 셀 다양 한 질병 및 면역 반응 (타고 난 및 적응형)^1,2에 참여 감사 합니다. 호 중구는 가장 염증 성 조직, 감염 된 조직, 염증 성 종양³, IBS, Crohn의 플레어⁴, 그리고 류 마티스 관절염 (synovia 등 비 감염 성 염증의 지역에서 높은 숫자에 RA) 환자⁵. 호 중구 미리 형성 된과 립 명명 된 azurophil (α), 특정 (β1), 차 (β2)과 립 분 비 소포 (γ)⁶의 4 개의 클래스를 포함 합니다. 염증 성 사이트에 마이그레이션, 채용된 호 중구 활성화 되 고 순차적으로 분 비과 립 내용 (접착, 항균 성 화합물 및 immunomodulatory 분자 구성), 추가 모집을 추진 하 고 있으며에 기여 감염 확인 (뿐만 아니라 호스트 조직 손상)⁷. 호 중구는 간주 하는 동안 거기까지 타고 난 면제의 중요 한 측면은 공부, 사용할 수 있는 몇 가지 탐지 시 약 그리고 생활 호 중구의 활성화 상태를 평가 하기 위해 사용할 수 있는 적은.

Ly-6 G² 등 특히 기저 조건 (예: myeloperoxidase 호 중구과 립에 저장 된 단백질 세포 표면 노출 된 항 원에 대해 생성 하는 단일 클론 항 체에 의존 하는 중 성구 검색의 현재 방법 lactoferrin). 단일 클론 항 체의 장점에는 그들의 강한 바인딩, 감도, 및 다양 한 분석 결과 조건 다양성 포함 됩니다. 그러나, 특히 단일 클론 항 체 및 안티-Ly-6 G을 사용 하 여 여러 가지 단점이 있습니다. 이러한 단점은 포함 특이성, Ly-6 G은 골에 호 산 구는;를 포함 하 여 모든 granulocytes 골수성 세포의 대부분에 존재 따라서,이 표시와 함께 호 중구 호 산 구는에서 해독 더 많은 단지⁸에 접근 해야 합니다. 단일 클론 항 체와 다른 자주 있 네 개 이상의 동물 종 비교 연구를 어렵게 하 그들의 자주 제한 호스트 특이성 범위입니다. 항 체 탐지 방법, 라이브 셀 또는 vivo에서 사용 하는 경우에 특히의 세 번째 단점은 세포의 기능을 방해 하거나 세포 활성화로 이어질 그들의 잠재력 이다. 예를 들어 관리의 안티-Ly-6 G 마우스 호 중구 감소 및 일시적인 호 중구 감소 증⁹에 일반적으로 적용 됩니다. 그것은 또한 항 체 주입 호 중구 antitumor 기능¹⁰을 자극 수 있습니다 입증 되었습니다. 마지막으로, 호 중구의 항 체 탐지는 셀의 활성화 상태를 공개 하지 않습니다.

우리는 40-아미노 산 펩 티 드 라는 MUB₄₀, 생체 외에서 또는 vivo에서 조건 호 중구 라벨 라이브 neutrophils¹¹의 활성화 상태를 시험 하 수 분석 실험에서에서 사용 될 수 있는 확인 했습니다. MUB₄₀ MUB₇₀¹², 원래 점액^13,14바인딩할 능력에 대 한 설명 유산 균 reuteri 표면 점액-바인딩 단백질 도메인에서에서 파생 됩니다. MUB₄₀ 당화 lactoferrin neutrophil 및 3 차과 립에 높은 농도에서 존재 하는 상호 작용 합니다. MUB₄₀ histopathology 또는 형광 활성화 된 세포 (FACS) 프로토콜 고정된 호 중구의 강력한 얼룩에 대 한 정렬에 표준 permeabilization 단계를 통해이 립에 노출 될 수 있습니다. 라이브 neutrophils 비활성 상태로 유지 됩니다, MUB₄₀ 펩 티 드과 립 내용에서 제외 하 고 셀 할 하지는 표시와 함께 긍정적인 얼룩. 활성화, MUB₄₀ 노출된 lactoferrin 바인딩할 하 고 펩 티 드와 강력한 얼룩으로 이어질 수 있습니다. 따라서, MUB₄₀ 감염 과정을 따라 매력적인 마커 만들기 순화 된 호 중구의 활성화 상태를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 활성화 된 호 중구 살 바인딩할 수 또한 MUB₄₀ 라이브 동물 모델 (예를 들어, 마우스 관절염 모델¹⁵)에서 호 중구 염증의 영역을 감지 하는 도구로 사용할 수 있습니다. 이 원고 자세히 어떻게 놓여있는지 MUB₄₀ 라는 프로토콜 neutrophils 조직학 조직 및 시험의 시험관에라이브 순화 된 호 중구의 활성화 하는 방법에 공개 사용할 수 있습니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법을 검토 되었고 CoRC (위원회 회의 드 Recherche 크리니크), CPP (위원회 회의 드 보호 des Personnes), 및 CNIL 프랑스 조직에 의해 승인 (위원회 국립 사회 외 리).

1. 얼룩과 Histopathology 조직에 호 중구 붙일 MUB₄₀ 개

1. Histopathology 위한 조직을 얻기 위해 30 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA)의 적합 한 볼륨에 조직/생 섹션 최대 4 샘플의 두께 따라 h 수정. 고정 동안 4 ℃ 냉장고에서 샘플을 놓습니다.
   참고: 다른 고정 방법/타이밍 교체하실 수 있습니다 사용자의 고유한 요구에 따라.
   1. 제거는 PFA 16% 자당 솔루션 샘플, 표지에 충분 한 볼륨을 추가 하 고 하룻밤까지 h 4 4 ° C에서 샘플을 놓습니다.
   2. 16% 자당 해결책을 제거 하 고 완전히 커버 샘플, 충분히 큰 볼륨에서 30% 자당 해결책을 추가 4 하룻밤까지 h 4 ° C에서 그것을 배치.
   3. 30% 자당 해결책을 제거 하 고 종이 타월로 조직에서 솔루션을 초과 떨어져 되 리. 조직 섹션 최적의 절삭 온도 (10 월) 미디어에서 장소와 스냅-2-methylbutane 드라이 아이스-에탄올 목욕 (-72 ° C) 냉각에 동결. (~ 2 분) 후 꽁꽁 얼어, 일단 2 methylbutane에서 블록을 제거 하 고 모든 블록 완료 하 고 장기 보관을 위해 준비 될 때까지 드라이 아이스에 넣어. 장기 저장을 위한-80 ° C에서 냉동된 블록을 저장 합니다.
2. 밤 전에 조직 블록 컷,-80 ° C 냉장고에서 그들을 제거-20 ° C 하룻밤 equilibrate에서 그들을 배치 하는.
   1. cryostat 사용 하 여, 10 월 임베디드 조직 10 ~ 30 μ m 두꺼운 조각으로 잘라내어 높은-품질의 유리 슬라이드에 흡착.
      참고: 두꺼운 또는 얇은 조각 실험 요구 사항에 따라 사용할 수 있습니다.
   2. 왁 스 펜 또는 다른 소수 성 방법, 유리 슬라이드에 조직 조각 주위에 상자를 그려와 건조 하자.
   3. 얼룩 솔루션 MUB₄₀의 1:1,000 희석을 수행 하 여 준비-Cy5 (또는 다른 형광 MUB₄₀버전 1 mg/mL 재고 솔루션) 0.1% 사포닌 PBS 솔루션에서. 최적의 최종 MUB₄₀ 농도 1 μ g/mL 이어야 한다.
      참고: 낮은 최종 농도 사용할 수 있습니다 (0.1-0.01 μ g/mL) 하지만 낮은 신호 강도 발생할 수 있습니다.
      주의: 사포닌 분말 호흡 자극을 일으킬 수 있습니다. 캐비닛 또는 보호 지역에서 사포닌의 무게에 있는지 확인 합니다. 트리톤 등 대체 permeabilization 메서드를 사용할 수 있습니다. 제조업체 권장 농도에서 추가 마커를 추가 (예., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, 형광 항 체).
   4. 부드럽게 0.1% 사포닌-PBS의 솔루션으로 유리 슬라이드 3 번 찍어.
   5. 신중 하 게 조직 섹션 주위 멀리 초과 액체 얼룩을 완전히 조직 단면도 커버에 충분 한 얼룩 솔루션을 추가 합니다. 증발을 방지 하 여 실 온에서 1 h에 그것을 품 어 습도 챔버로 슬라이드를 놓습니다. 빛 으로부터 보호 유지.
   6. 부드럽게 0.1% 사포닌 PBS 솔루션 3으로 슬라이드를 찍어 x. 그런 다음, 부드럽게 찍어 PBS 솔루션 3으로 슬라이드 x. 마지막으로, 부드럽게 찍어 소 주 H₂O로 슬라이드 3 배. 신중 하 게 슬라이드에서 과잉 액체를 건조.
   7. 장착 매체 (20 mM Tris pH 8.0, 0.5 %N 틸 gallate 90% 글리세롤) 조직 슬라이스 옆의 작은 금액 (~ 20 μ)을 추가 하 고 부드럽게 유리 슬라이드 위에 유리 coverslip 내려 놓 아 라. 부드럽고 고르게는 coverslip 조직 섹션에 누르고는 coverslip의 가장자리 돌출 하는 설치 미디어를 제거 조심 스럽게 종이 타월을 사용 하 여.
   8. 공고히 장착 미디어 있도록 24 h에 대 한 어두운 캐비닛에 탑재 된 슬라이드를 배치 합니다. 또는 1 시간 동안 37 ° C에 탑재 된 슬라이드를 배치 합니다.
3. 원하는 인수 방법에 따라 형광 현미경에서 조직을 조각 이미지.

2. 복고풍 링크 MUB₄₀호 중구 활성화의 시각화-Cy5 펩 티 드

1. 인간의 호 중구는 다음 프로토콜을 사용 하 여 얻을. 다음 솔루션을 준비 하 고 무산 소 캐비닛 하룻밤에 그들을 배치. 산소에 노출 호 중구 활성화 하 고 더 유도 세포 죽음^16,17시작 됩니다.
   참고: 호 중구 수 있습니다 또는 정화 "벤치"에 MUB₄₀-라벨 실험; 그러나, 산소 노출 호 중구 활성화에 영향을 미칠 시작 됩니다 유의 하십시오.
   1. 다음과 같은 솔루션을 준비:
      해결 방법 1 [0.9% 염화 나트륨 (NaCl)]: NaCl의 4.5 g H₂o. 필터 솔루션의 500 mL를 추가.
      해결 방법 2 (dextran 6%): 100 ml 6 g dextran의 NaCl 0.9% 솔루션에 추가.
      해결 방법 3 (세척 버퍼): PBS pH 7.2 m m 2의 최종 EDTA 농도에 있는 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 분해. 사용 직전 마지막 BSA 농도 10 %w / v를 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS/EDTA 솔루션에서을 디졸브.
   2. 혈액 컬렉션 튜브 휴식 없이 20 분 650 x g에서 원심
   3. 분리 된 혈액을 방해 하지 않고 무산 소 캐비닛 및 수집 플라즈마 분수 (맨 위) 50 mL 원뿔 튜브에 혈액 컬렉션 튜브를 전송 합니다.
   4. 무산 소 캐비닛 및 작은 공의 혈소판을 휴식 20 분 2900 x g에서 원심 분리기에서 포함 하는 플라즈마 튜브를 제거 합니다.
   5. 수송과 혈소판을 방해 하지 않고 부드럽게 전송할 플라즈마 튜브 다시 무산 소 캐비닛 및 피펫으로 (이 하 "플라즈마"에 게 불리는) 신선한 50 mL 튜브에 혈소판 가난한 플라스마.
2. 백혈구에서 붉은 혈액 세포의 분리
   1. 적혈구 (Rbc) 단계 2.1.3에서에서 포함 된 튜브를 사용 하 여., 50 mL 원뿔 튜브 (5 혈액 컬렉션 튜브 내용 50 mL 튜브 당)으로 Rbc를 결합.
   2. 0.9 %NaCl 추가 총 볼륨 44 mL에 도달할 때까지. Dextran 6% (마지막)의 6 mL를 추가 합니다.
   3. 부드럽게 반전 튜브 시간 10-20 여 혈액/dextran 혼합물을 혼합. 적어도 30 분 동안 튜브 앙금을 하자.
   4. 침전을 수행 하는 동안 Percoll 솔루션의 4.2 mL 15 mL 원뿔 튜브에 플라즈마의 5.8 mL을 추가 하 여 Percoll 그라데이션을 준비 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합.
   5. Pipetting 붉은 혈액 세포를 방지 하는 동안는 dextran의 최고 분수를 수집 합니다.
   6. 나사 모자를 강화, 무산 소 상공에서 dextran 튜브를 제거 하 고 10 분 휴식 x 300g에 튜브 원심.
   7. 조심 스럽게 수송과 세포를 방해 하지 않고 무산 소 상공에 다시 튜브를 배치 하 고 pipetting 통해 액체를 제거.
   8. 부드럽게 플라즈마의 1 ml에서에 다시 셀 펠 릿을 일시 중단 하 고 매우 느리게 Percoll 솔루션의 상단에 추가 합니다. 수 위에 셀 pipetting 때 레이어의 혼합을 유도 하지 않도록 주의 하십시오.
   9. 무산 소 상공 (피하 혼합), 그리고 휴식 없이 20 분 800 x g에서 원심 분리기에서 Percoll 솔루션 튜브를 조심 스럽게 제거. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) Percoll 솔루션 표면에 남아 있을 것 이다 고 호 중구는 Rbc와 작은 것입니다.
3. Rbc 오염 제거
   1. 버퍼를 세척의 14 ml 700 μ PBS + 10 %BSA 추가 하 여 버퍼 솔루션을 세척의 14 mL를 준비 합니다.
   2. 무산 소 상공에 다시 Percoll 솔루션 튜브를 놓습니다. Pipetting 통해 Percoll와 PBMCs를 제거 하 고 다시 세척 버퍼 솔루션의 1 mL에 수송과 셀을 일시 중단. 다시 일시 중단 되도록 펠 릿 오염 Rbc 인해 빨간색이 있을 것 이다.
   3. 다시 일시 중단 된 셀 안티-CD235a (glycophorin) 자석 구슬의 200 μ를 추가 하 고 부드럽게 혼합, 최소 15 분의 품 어. 이 단계 그들은 제거 될 수 있도록 자석 구슬 가진 오염 RBCs를 로드 합니다.
   4. 워시 세척의 2 mL와 함께 분리 열 버퍼 3 배.
   5. 분리 열 아래 15 mL 원뿔 튜브를 잡고, 천천히 열 상단의 neutrophil/RBC 혼합 플라스틱. 그들은 통해 흐름 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 수집 합니다. 통해 흐름 해야 흐린 고 때문에 열에 바인딩된 남아 있는 Rbc의 붉은 색을 잃고.
   6. 버퍼는 칼럼의 상단에 세척의 2 개 mL를 추가 하 고 동일한 15 mL 원뿔 튜브에 수집. 2 mL 워시 말까지 흐름 통해 명확 해야 한다, 모든 호 중구 수집 된 상징.
   7. 부드럽게 믹스 하 호 중구의 동등한 배급을 보장 하 고 셀 카운팅을 위한 10 μ를 수집 튜브. 목적을 계산 하는 셀에 대 한 최종 볼륨 note 계산 방법 모든 표준 셀 셀의 총 개수를 열거 합니다.
   8. 무산 소 상공에서 호 중구 튜브를 제거 하 고 원심 휴식 20 분에 대 한 300 x g에서 호 중구.
   9. 무산 소 상공에 다시 sedimented neutrophils 놓고 pipetting 통해 세척 버퍼를 제거 합니다. 다시 10의 최대 셀 밀도 플라즈마에 호 중구 펠 릿을 중단⁷ PMN/mL.
4. 순화 된 호 중구 및 시각화 MUB₄₀ 을 사용 하 여 열거
   1. 추가 리 MUB₄₀의 1 μ-Cy5 (1 mg/mL)의 페 놀 레드 없이 Rosewell 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 1 ml. 잘 pipetting으로 혼합.
   2. 이 프로토콜의 목적을 위해 결과 마치 강력한 neutrophil 활성화 시, N-formylmethionyl-leucyl-페닐알라닌 (FMLP) 추가 개설 되었습니다. 1 μ m의 FMLP RPMI/RI-MUB₄₀추가-Cy5 튜브 및 pipetting 통해 믹스 고 아래로.
      참고: 각 실험 절차가이 시점에서 해결 되 고 질문에 따라 달라 집니다.
   3. 1 mL RPMI/RI-MUB₄₀전송-유리 하단 현미경 요리 Cy5/FMLP 혼합물. 이 접시에 순화 된 셀 10⁶ 총 호 중구에의 볼륨을 추가. 부드럽게 pipetting으로 혼합.
   4. 거꾸로 형광 현미경에 접시를 놓고 이미지 수집을 시작 합니다. 예를 들어 FMLP 또는 박테리아 같은 neutrophil 활성화 시 약의 추가 이전 초기 이미지를 수집 하는 것이 좋습니다. 이 예제에서는 시작 RPMI/RI-MUB₄₀의 수집-Cy5/호 중구, 나중 timepoint neutrophil 활성화 시 유리 그릇에 플라스틱 그리고 이미지 수집을 계속.
      참고: 다음이 단계를 수정 할 수 있다 기반으로 과학적 요구에.
   5. 프로세스는 이미지/시간 lapse 영화로 특정 현미경 사용에 관련 된 인수.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

MUB₄₀의 결과-얼룩진된 조직 histopathology 슬라이드에서 일반적으로 조직에 걸쳐 흩어져 개별 셀을 공개. MUB₄₀ 얼룩 lactoferrin, 호 중구과 립에 존재 하 고로 한정. 따라서, 일반적으로 본 punctate 얼룩 또는 신호의 여러 큰 분리 한 지역에서에서 오고 있다 개별 neutrophils (그림 1). 공동 스테인드 셀 MUB₄₀ 신호를 지역화할 수 있도록 DAPI ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

여기, 두 분석 MUB₄₀ 펩 티 드 호 중구 염증 및 활성화 연구에 사용 되는 설명 합니다. 우리는 어떻게 MUB₄₀ neutrophils histopathology 섹션에 제시 하거나 라이브 정화 중 성구를 사용 하 여 그들의 활성화 상태를 밝힐 수 있습니다 보여줍니다. 착 색 시 약으로 MUB₄₀ 을 사용 하는 중요 한 단계는 다른 형광 탐지 방법으로 동일 합니다. 형광 신호 호환성 및 적절 한 세척 단계 배경 얼룩...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixative for histology
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Used to section tissues
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	Hi precision coverslip
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Stains DNA
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope	Various	Various	Used to image IF slides
Anoxic Cabinet	Various	Various	Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Washing buffer component
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Washing buffer component
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Used to remove contaminating RBCs
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Used for neutrophil assays