O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar a presença de neutrófilos em seções fixas/permeabilizado histologia e avaliar o estado de ativação de neutrófilos purificados ao vivo. Em particular, o peptídeo de₄₀ MUB vincula lactoferrina presente nos grânulos neutrófilos específicos e terciários. Exposição do conteúdo do grânulo através de permeabilização ou ativação de neutrófilos permite a marcação de neutrófilos.

Resumo

Aqui, nós fornecemos um protocolo que envolve a utilização de MUB₄₀, um peptídeo sintetizado com a capacidade de se ligar a lactoferrina glicosilados armazenada em concentrações elevadas em grânulos específicos e terciários de neutrófilos. Este detalhes de protocolo como MUB₄₀ conjugado diretamente com um fluoróforo pode ser usado para manchar os neutrófilos nos tecidos fixo/permeabilizado, bem como a forma como isso pode ser usado em imagens de viver-pilha a ensaiar para a granulação e ativação de neutrófilos. Métodos de deteção dos neutrófilos são limitados a espécie anticorpos monoclonais, que nem sempre são adequados para determinadas aplicações. MUB₄₀ não penetra a membrana celular e, portanto, é excluído da lactoferrina armazenada em neutrófilos não-ativado/não-permeabilizado. MUB₄₀ tem o benefício adicionado de reconhecer lactoferrina de um leque amplo acolhimento, tornando-se especialmente útil para comparar resultados em estudos envolvendo vários modelos de pesquisa, reduzindo o número de reagentes duplicados e simplificando os protocolos através de coloração de etapa única.

Introdução

Os neutrófilos são um dos principais braços do sistema imune inato e rotineiramente são recrutados para os locais de inflamação ao redor do corpo. O estudo de neutrófilos foi em grande parte prejudicado por sua vida curta em vitro (menos de 8 h) e ferramentas de detecção limitada em condições basais ou após a ativação. Aqui, apresentamos um protocolo bem testado para a detecção de amplo e específico de neutrófilos mamíferos em amostras fixas/permeabilizado. Nós também fornecemos um protocolo detalhado para coloração de neutrófilos ao vivo com MUB₄₀. Usando o protocolo de coloração dos neutrófilos ao vivo, o calendário e a localização da ativação de neutrófilos podem ser identificados. Este protocolo é ideal para os investigadores que desejem estudar a liberação de ativação ou grânulos neutrófilos. Além de suas funções antimicrobianas, neutrófilos agora são apreciados como imunomodulador células envolvidas em uma ampla gama de doenças e respostas imunes (inata e adaptativa)^1,2. Os neutrófilos estão presentes em tecidos mais inflamatórios, em números elevados em tecidos infectados, em tumores inflamatórios³, durante a IBS e Crohn flare-ups⁴e em áreas de inflamação não-infecciosa, tais como a sinóvia de artrite reumatoide ( RA) pacientes⁵. Os neutrófilos contêm quatro classes de grânulos pré-formados, chamado azurophil (α), específicas (β1), grânulos de terciário (β2) e vesículas secretoras (γ)⁶. Após a migração para um site inflamatória, recrutados os neutrófilos se tornar ativados e sequencialmente secretam grânulo conteúdo (composto por adesão, compostos antimicrobianos e imunomoduladores moléculas), que promove ainda mais recrutamento e contribui para infecção de resolução (mas também de danos aos tecidos do hospedeiro)⁷. Enquanto os neutrófilos são considerados um aspecto crítico da imunidade inata, até à data, lá são alguns reagentes de detecção disponíveis para estudá-los, e ainda menos que pode ser usado para avaliar o estado de ativação de neutrófilos vivos.

Atuais métodos de detecção de neutrófilos dependem de anticorpos monoclonais gerados contra antígenos de superfície expostos, como Ly - 6G² ou proteínas especificamente armazenadas nos grânulos neutrófilos em condições basais (por exemplo, mieloperoxidase lactoferrina). Vantagens de anticorpos monoclonais incluem sua forte ligação, sensibilidade e versatilidade em diversas condições de ensaio. No entanto, existem várias desvantagens ao uso de anticorpos monoclonais e anti-Ly - 6G em particular. Essas desvantagens incluem a especificidade, como Ly - 6G está presente na maioria das células mieloides, na medula óssea e em todos os granulócitos incluindo eosinófilos; Portanto, decifrar os neutrófilos de eosinófilos com este marcador requer mais complexos se aproxima de⁸. Outra troca frequente com anticorpos monoclonais é sua gama de especificidade de hospedeiros muitas vezes limitada, dificultando estudos de comparação com mais de uma espécie animal. Uma terceira desvantagem dos métodos de detecção de anticorpos, especialmente quando se utiliza células vivas ou in vivo, é o seu potencial para perturbar a função celular ou levar a ativação de células. Por exemplo, a administração de anti-Ly - 6G para ratos é comumente aplicada a depleção de neutrófilos e neutropenia transitória⁹. Além disso foi demonstrado que a injeção de anticorpos pode estimular neutrófilos função antitumoral¹⁰. Finalmente, pesquisa de anticorpos de neutrófilos não revela o estado de ativação da célula.

Nós identificamos um 40-amino peptídeo ácido chamado MUB,₄₀, que pode ser usado em um número de ensaios para rotular os neutrófilos em condições em vitro e em vivo , bem como o status de ativação de neutrófilos ao vivo¹¹de ensaios. MUB₄₀ é derivado de MUB₇₀¹², um domínio do Lactobacillus reuteri superfície muco-proteína originalmente descrita por sua capacidade de vincular o muco^13,14. MUB₄₀ interage com lactoferrina glicosilados que está presente em altas concentrações em grânulos neutrófilos específicos e terciários. MUB₄₀ pode ser exposto a estes grânulos através de etapas de permeabilização padrão presentes na histopatologia ou fluorescência-ativado da pilha protocolos (FACS) para coloração robusto de neutrófilos fixos de classificação. Quando os neutrófilos ao vivo são mantidos em um estado inativado, o peptídeo de₄₀ MUB é excluído do conteúdo do grânulo, e células não mancha positivas com o marcador. Após a ativação, MUB₄₀ pode vincular a lactoferrina exposta e levar a coloração robusto com o peptídeo. Assim, MUB₄₀ pode ser usado para determinar o estado de ativação de neutrófilos purificados, tornando-se um marcador atraente para seguir o processo infeccioso. A capacidade de se ligar a viver os neutrófilos ativados também permite MUB₄₀ ser usado como uma ferramenta para detectar áreas de inflamação dos neutrófilos em modelos animais vivos (por exemplo, um rato artrite modelo¹⁵). Os protocolos detalhadamente este manuscrito como fluorescente etiquetado MUB₄₀ podem ser usados para revelar os neutrófilos em histologia tecidos e como a ensaiar a ativação de neutrófilos purificado ao vivo em vitro.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram revistos e aprovados pelas organizações francesas modificaes (Comité de Recherche Clinique), CPP (des Personnes de Comité de proteção) e CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).

1. neutrófilos no tecido histopatologia com a coloração fluorescente rotulados MUB₄₀

1. Para obter o tecido para histopatologia, corrigi secções de tecido/biopsia em um volume adequado de paraformaldeído 4% (PFA) por 30 min até 4 h dependendo da espessura da amostra. Coloca as amostras em um frigorífico de 4 ° C durante a fixação.
   Nota: Fixação alternativos métodos/horários pode ser substituídos com base em necessidades específicas do usuário.
   1. Remover o PFA, adicionar solução de sacarose 16% com volume suficiente para cobrir completamente a amostra e colocar a amostra a 4 ° C por 4 h até durante a noite.
   2. Remover a solução de sacarose de 16% e adicionar a solução de sacarose de 30% em um volume grande o suficiente para cobrir completamente a amostra e colocá-lo em 4 ° C por 4 h até durante a noite.
   3. Remover a solução de sacarose de 30% e borre fora solução em excesso de tecido com uma toalha de papel. Coloque a secção de tecido na mídia de corte óptima temperatura (OCT) e snap-freeze em 2-methylbutane resfriado em um banho de gelo seco-etanol (-72 º C). Uma vez congelado (depois de ~ 2 min), remover blocos do 2-methylbutane e coloque-os em gelo seco, até que todos os blocos são acabados e prontos para o armazenamento a longo prazo. Armazene os blocos congelados a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.
2. Na véspera de blocos de tecido devem ser cortadas, removê-los do congelador a-80 ° C e colocá-los a-20 ° C durante a noite para equilibrar.
   1. Usando um criostato, cortar tecido incorporado no OCT 10 - a 30 μm de espessura fatias e adsorver para lâminas de vidro de alta qualidade.
      Nota: Fatias mais finas ou mais grossas podem ser usadas dependendo das exigências experimentais.
   2. Com uma caneta de cera ou outro método hidrofóbico, desenhe uma caixa ao redor do pedaço de tecido sobre a lâmina de vidro e deixe secar.
   3. Preparar a solução de coloração, realizando uma diluição de 1:1,000 de MUB₄₀-Cy5 (ou outra versão de₄₀MUB fluorescente, 1 mg/mL de solução) em solução de saponina-PBS 0,1%. A concentração de₄₀ MUB final ideal deve ser de 1 μg/mL.
      Nota: Concentrações finais podem ser utilizadas (0,1-0,01 μg/mL), mas pode levar a baixa intensidade de sinal.
      Cuidado: O pó de saponina pode causar irritação de respiração. Certifique-se de pesar saponina em uma área protegida ou armário. Métodos de permeabilização alternativo podem ser usados como Triton. Adicionar marcadores adicionais em concentrações recomendadas fabricante (EG., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), faloidina, anticorpos fluorescentes).
   4. Delicadamente, mergulhe a lâmina de vidro em uma solução de 0.1% saponina-PBS três vezes.
   5. Cuidadosamente, borre fora excesso de líquido ao redor da seção de tecido e adicionar suficiente solução coloração para cobrir completamente a secção de tecido. Coloque o slide em uma câmara de umidade para evitar a evaporação e incube-lo por 1h à temperatura ambiente. Mantê-lo protegido da luz.
   6. Mergulhe delicadamente o slide em solução de saponina-PBS 0,1% 3 x. Em seguida, delicadamente mergulhe o slide em solução de PBS 3 x. Finalmente, delicadamente mergulhe o slide em água destilada H₂O 3 x. Seca cuidadosamente excesso líquido do slide.
   7. Adicione uma pequena quantidade (~ 20 μL) do meio de montagem (20 mM Tris pH 8.0, N-propil galato de 0,5%, 90% de glicerol) junto a fatia de tecido e delicadamente estabelecer uma lamela de vidro na parte superior da lâmina de vidro. Delicadamente e uniformente prima a lamela na seção de tecido e, usando uma toalha de papel, remova cuidadosamente qualquer mídia de montagem que extrusão em torno das bordas da lamela.
   8. Coloque o slide montado em um armário escuro por 24 h permitir que os meios de montagem solidificar. Como alternativa, coloque o slide montado a 37 ° C por 1h.
3. As fatias de tecido em um microscópio fluorescente de acordo com o método de aquisição desejada da imagem.

2. visualização de ativação dos neutrófilos com Retro-Inverso-MUB₄₀-peptídeo Cy5

1. Obter usando o seguinte protocolo de neutrófilos humanos. Preparar as seguintes soluções e colocá-los em um pernoite anóxico do armário. Exposição ao oxigênio vai começar a ativar os neutrófilos e mais induzir célula morte^16,17.
   Nota: Os neutrófilos podem ser alternativamente purificados "no banco" para MUB₄₀-rotulagem de experimentos; no entanto, esteja ciente de que a exposição do oxigênio começará a afetar a ativação de neutrófilos.
   1. Prepare a seguinte solução:
      Solução 1 [0,9% de cloreto de sódio (NaCl)]: adicionar 4,5 g de NaCl a 500 mL de H₂O. filtrar a solução.
      Solução 2 (6% de dextran): Adicionar 6 g de dextran em solução de NaCl 0,9% 100 ml.
      Solução 3 (tampão de lavagem): dissolver o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em pH de PBS 7.2 a uma concentração final de EDTA de 2 mM. Imediatamente antes da utilização, dissolva albumina de soro bovino (BSA) em solução de PBS/EDTA, tal que a concentração de BSA a final é 10% w/v.
   2. Centrifugar tubos de colheita de sangue a 650 x g por 20 min sem pausas.
   3. Sem interromper o sangue separado, transferi os tubos de coleta de sangue para um frações anóxica do armário e coletar plasma (topo) em um tubo cónico de 50 mL.
   4. Retire o tubo contendo plasma do gabinete anóxico e centrifugar 2.900 x g por 20 min com intervalos para as plaquetas de Pelotas.
   5. Sem interromper as plaquetas peletizadas, transferi cuidadosamente o tubo de plasma volta para o armário anóxico e pipetar o plasma pobre de plaquetas em um tubo de 50 mL (a seguir designado por "plasma").
2. Separação de células vermelhas do sangue de leucócitos
   1. Usando os tubos contendo as células vermelhas do sangue (hemácias) da etapa 2.1.3., combinar as hemácias em um tubo cónico de 50 mL (5 sangue coleção tubo conteúdo por tubo de 50 mL).
   2. Adicione NaCl 0,9%, até que o volume total atinge 44 mL. Adicione 6 mL de dextran 6% (último).
   3. Misture suavemente a mistura de sangue/dextran por inversão do tubo 10 - 20 vezes. Deixe o sedimento do tubo pelo menos 30 min.
   4. Enquanto estiver ocorrendo a sedimentação, prepare um gradiente de Percoll, acrescentando 4,2 mL de solução de Percoll a 5,8 mL de plasma em um tubo cônico de 15 mL e misture bem por inversão do tubo.
   5. Colete a fração superior do dextran tentando evitar pipetagem de glóbulos vermelhos.
   6. Aperte a tampa de rosca, retire o tubo de dextrano da câmara anóxica e centrifugar o tubo a 300 x g por 10 min com intervalos.
   7. Cuidadosamente coloque o tubo de volta para a câmara anóxica sem perturbar as células peletizadas e remover o líquido através de pipetagem.
   8. Delicadamente Ressuspender o pellet de células em 1 mL de plasma e muito lentamente, adicionar à parte superior da solução Percoll. Tenha cuidado para não induzir a mistura das camadas quando pipetagem das células na parte superior.
   9. Remova cuidadosamente o tubo de solução de Percoll da câmara anóxica (evitando a mistura) e centrifugar 800 x g por 20 min sem pausas. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) permanecerá na superfície da solução de Percoll e neutrófilos serão pelota com as hemácias.
3. Remoção de contaminantes hemácias
   1. Prepare a 14 mL de solução tampão de lavagem adicionando 700 µ l PBS + 10% de BSA a 14 mL de tampão de lavagem.
   2. Coloca o tubo de solução de Percoll volta para a câmara anóxica. Remova o Percoll e PBMCs através de pipetagem e ressuspender as células peletizadas em 1 mL de solução tampão de lavagem. A pelota para ser re-suspenso terá uma cor vermelha devido a contaminantes de hemácias.
   3. Adicionar 200 μL de grânulos magnético anti-CD235a (glucoforina) para as células re-suspensas, misture suavemente e incubar durante um mínimo de 15 min. Esta etapa carrega as hemácias contaminantes com grânulos magnéticos para que eles podem ser removidos.
   4. Lavar a coluna de separação com 2 mL de lavagem buffer 3x.
   5. Mantendo um tubo cônico de 15 mL sob a coluna de separação, pipete lentamente a mistura de neutrófilos/RBC para o topo da coluna. Como fluem através de, colete as células no tubo cônico de 15 mL. A passagem deve ser nublado e perder a sua cor vermelha devido as RBCs restantes acoplado à coluna.
   6. Adicionar 2 mL de tampão para o topo da coluna de lavagem e recolher no mesmo tubo cônico de 15 mL. No final da lavagem de 2 mL, a passagem deve ser clara, significando que todos os neutrófilos foram recolhidos.
   7. Misture suavemente o tubo para assegurar uma distribuição uniforme dos neutrófilos e coletar 10 μL para a contagem de células. Anote o volume final para fins de contagem de célula. Enumere o número total de células com qualquer célula padrão método de contagem.
   8. Remover o tubo de neutrófilos da câmara anóxica e centrifugue os neutrófilos a 300 x g por 20 min com intervalos.
   9. Coloque a câmara anóxica sedimentados neutrófilos e remover o tampão de lavagem através de pipetagem. Ressuspender o sedimento dos neutrófilos no plasma, com uma densidade celular máxima de 10⁷ PMN/mL.
4. Enumeração de neutrófilos purificados e visualização usando MUB₄₀
   1. Adicionar 1 μL de RI-MUB₄₀-Cy5 (1 mg/mL) a 1 mL de meio de Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sem vermelho de fenol. Misture pipetando bem.
   2. Para efeitos do presente protocolo, o resultado tem sido descrito como se um potente neutrófilos ativando reagente, N-formylmethionyl-leucyl-fenilalanina (FMLP), é adicionado. Adicionar 1 μm de FMLP os RPMI/RI-MUB₄₀-tubo de Cy5 e mistura através de pipetagem para cima e para baixo.
      Nota: Cada procedimento experimental será diferente daqui para frente, dependendo as questões a ser tratadas.
   3. Transferir a 1 mL RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5/FMLP mistura para um prato de microscopia de fundo de vidro. Para este prato, adicione um volume de células purificadas, correspondente a 10⁶ total neutrófilos. Misture suavemente pipetando.
   4. Coloque o prato em um microscópio fluorescente invertido e iniciar a aquisição de imagens. Por exemplo, recomenda-se adquirir imagens de linha de base antes da adição de um reagente de ativação de neutrófilos como FMLP ou bactérias. Neste exemplo, iniciar a aquisição de RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5/neutrófilos e em um Commit depois, pipetar o reagente de ativação de neutrófilos para o prato de vidro e continuar a aquisição de imagens.
      Nota: Modificações para estas etapas podem ser feitas com baseadas nas necessidades científicas.
   5. Processo adquiriu imagens/time-lapse filmes como pertence ao microscópio específico usado.

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Resultados

Resultados de MUB₄₀-tecidos manchados de slides histopatologia tipicamente revelam células individuais espalhadas por todo o tecido. MUB₄₀ manchas de lactoferrina, que está presente nos grânulos neutrófilos e compartimentada. Assim, tipicamente vistos são punctate manchas ou vários grandes áreas separadas do sinal vindo de neutrófilos individuais (Figura 1). É útil adicionar um segundo marcador de célula como DAPI para ajudar ...

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Discussão

Aqui, dois ensaios são descritos em que o peptídeo de₄₀ MUB é usado para estudar a ativação e inflamação dos neutrófilos. Mostramos como MUB₄₀ pode revelar os neutrófilos presentes nas seções de histopatologia ou mostram seu estado de ativação usando neutrófilos purificados ao vivo. As etapas críticas para usar MUB₄₀ como um reagente de coloração são os mesmos que com qualquer outro método de deteção fluorescente. Deve ter cuidado para garantir a compatibilidade de si...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixative for histology
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Used to section tissues
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	Hi precision coverslip
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Stains DNA
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope	Various	Various	Used to image IF slides
Anoxic Cabinet	Various	Various	Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Washing buffer component
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Washing buffer component
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Used to remove contaminating RBCs
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Used for neutrophil assays