Das MUB40 Peptid für den Einsatz bei der Aufdeckung von Neutrophilen-vermittelte Entzündung Veranstaltungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein der Neutrophilen behoben/permeabilized Histologie Abschnitte erkennen und bewerten den Aktivierungsstatus der live gereinigten Neutrophilen. Vor allem bindet MUB₄₀ Peptid Lactoferrin in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden. Exposition der Granulat-Inhalte durch Permeabilisierung oder Neutrophilen Aktivierung ermöglicht die Kennzeichnung von Neutrophilen.

Zusammenfassung

Hier bieten wir ein Protokoll unter Verwendung von MUB₄₀, ein synthetisiertes Peptid mit der Fähigkeit, glykosylierten Lactoferrin gespeichert in hohen Konzentrationen in bestimmten und tertiäre Körnchen der Neutrophilen zu binden. Dieses Protokolldetails wie MUB₄₀ direkt an ein Fluorophor konjugiert einsetzbar, Neutrophile in feste/permeabilized Geweben sowie zu beflecken, wie Hiermit können live Cell Imaging für die Neutrophilen Aktivierung und de-Granulierung assay. Neutrophilenzahl Nachweismethoden beschränken sich auf Spezies-spezifische monoklonale Antikörper, die nicht immer für bestimmte Anwendungen geeignet sind. MUB₄₀ die Zellmembran nicht durchdringen und ist somit von Lactoferrin gespeichert in nicht-aktiviert/nicht-permeabilized Neutrophilen ausgeschlossen. MUB₄₀ hat den zusätzlichen Vorteil erkennen Lactoferrin aus ein breites Wirtsspektrum, macht es besonders nützlich für den Vergleich der Ergebnisse in Studien mit mehreren Forschungsmodelle, Verringerung der Zahl der doppelte Reagenzien und Vereinfachung der Protokolle durch ein-Schritt-Färbung.

Einleitung

Neutrophile sind eines der primären Waffen des angeborenen Immunsystems und werden routinemäßig zu den Stätten der Entzündung um den Körper angeworben. Die Studie der Neutrophilen wurde weitgehend beeinträchtigt durch ihre kurze Lebensdauer in Vitro (weniger als 8 h) und begrenzte Erkennungs-Tools unter basalen Bedingungen oder nach der Aktivierung. Hier präsentieren wir Ihnen eine erprobte Protokoll für die Breite und spezifische Erkennung von Säugetier-Neutrophils in feste/permeabilized Proben. Wir bieten auch ein detailliertes Protokoll zum Beizen live Neutrophilen mit MUB₄₀. Mit dem live Neutrophilenzahl Färbung Protokoll, können den Zeitpunkt und Ort der Neutrophilen Aktivierung geortet werden. Dieses Protokoll ist ideal für Forscher, die Neutrophilen Aktivierung oder Granulat Release studieren möchten. Jenseits ihrer antimikrobiellen Funktionen werden Neutrophile jetzt als immunmodulatorische Zellen in einer Vielzahl von Krankheiten und Immunreaktionen (angeborene und adaptive)^1,2geschätzt. Neutrophile sind im meisten entzündlichen Gewebe, bei hohen Stückzahlen im infizierten Gewebe, entzündliche Tumoren³, während IBS und Morbus Crohn Schübe⁴, und in Bereichen der nicht-infektiöse Entzündung wie die Synovia der rheumatoiden Arthritis ( RA) Patienten⁵. Neutrophilen enthalten vier Klassen von vorgeformten Körnchen namens Azurophil (α), spezifische (β1), Tertiär (β2) Granulat und sekretorischen Vesikel (γ)⁶. Bei der Migration zu einer entzündlichen Site rekrutierte Neutrophilen werden aktiviert und sequenziell sezernieren Granulat Inhalte (bestehend aus Adhäsion, antimikrobielle Substanzen und immunmodulatorischen Molekülen), die fördert weitere Rekrutierung und trägt zur Infektion Auflösung (aber auch zu Host Gewebeschäden)⁷. Während Neutrophile gelten ein kritischer Aspekt der angeborenen Immunität, bisher gibt es sind einige Nachweisreagenzen zur Verfügung, um sie zu studieren, und noch weniger, die kann verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der lebenden Neutrophilen zu beurteilen.

Aktuelle Methoden zur Erkennung von neutrophilen Granulozyten verlassen sich auf monoklonale Antikörper gegen die Zelloberfläche exponierten Antigene, wie Ly - 6 G² oder Proteine im einzelnen gespeichert in Neutrophilen Granulat unter basalen Bedingungen (z. B. Myeloperoxidase erzeugt Lactoferrin). Vorteile von monoklonalen Antikörpern sind ihre starke Bindung, Empfindlichkeit und Vielseitigkeit unter verschiedenen Assay-Bedingungen. Es gibt jedoch einige Nachteile mit monoklonalen Antikörpern und Anti-Ly - 6G im besonderen. Diese Nachteile sind die Spezifität, Ly - 6G auf der Mehrzahl der myeloischen Zellen im Knochenmark und auf alle einschließlich der eosinophilen Granulozyten vorliegt; Entschlüsselung von Neutrophilen aus eosinophilen mit dieser Marker erfordert daher mehr komplexe Ansätze⁸. Eine weitere häufige Kompromiss mit monoklonalen Antikörpern ist ihre oft begrenzte Spezifität Wirtsspektrum, Vergleichsstudien mit mehreren Tierarten erschwert. Ein dritter Nachteil der Antikörper Abfragung Methoden, insbesondere bei Verwendung von lebenden Zellen oder in vivo, ist ihr Potenzial Zellfunktionen zu stören oder zu Zellaktivierung führen. Beispielsweise wird die Verwaltung von Anti-Ly - 6 G, Mäuse häufig auf Neutrophilen Erschöpfung und vorübergehende Neutropenie⁹angewendet. Zudem ist nachgewiesen, dass Antikörper Injektion Neutrophilenzahl Antitumor-Funktion¹⁰stimulieren kann. Schließlich verrät Antikörpernachweis der Neutrophilen nicht den Aktivierungsstatus der Zelle.

Wir haben festgestellt, dass eine 40-amino Acid Peptid namens MUB₄₀, die in einer Reihe von Tests zu beschriften Neutrophilen in Vitro oder in Vivo Bedingungen sowie die Aktivierungsstatus des live Neutrophilen¹¹assay verwendet werden können. MUB₄₀ leitet sich vom MUB₇₀¹², eine Domäne der Lactobacillus Reuteri Oberfläche Schleim-Bindeprotein ursprünglich für seine Fähigkeit, Schleim^13,14binden beschrieben. MUB₄₀ interagiert mit glykosylierten Lactoferrin, das in hohen Konzentrationen in Neutrophilen-spezifischen und tertiären Granulat vorhanden ist. MUB₄₀ können diese Module durch standard Permeabilisierung Schritte in Histopathologie oder Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Protokolle für robuste Färbung der festen Neutrophilen ausgesetzt werden. Wenn live Neutrophilen in einem inaktivierten Zustand gehalten werden, das MUB₄₀ Peptid ist aus dem Granulat Inhalt ausgeschlossen, und Zellen keine Flecken, positiv mit dem Marker. Nach der Aktivierung können MUB₄₀ binden an exponierten Lactoferrin und zu robusten Färbungen mit das Peptid führen. So kann MUB₄₀ verwendet werden, um den Aktivierungsstatus der gereinigten Neutrophilen, so dass es einen attraktive Marker der infektiösen Prozess folgen bestimmen. Auch Möglichkeit, binden an aktivierte Neutrophilen Leben MUB₄₀ als Werkzeug verwendet werden, um Bereiche der Neutrophilen Entzündung in live Tiermodellen (z. B. einer Maus Arthritis Modell¹⁵) zu erkennen. Die Protokolle in diesem Manuskript Detail wie Eindringmittel beschriftet MUB₄₀ einsetzbar, Neutrophile in Histologie Gewebe und wie man die Aktivierung des live gereinigten Neutrophilen in-vitro-Tests zu offenbaren.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden überprüft und genehmigt von den französischen Organisationen CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) und CNIL (Kommission Nationale Informatique et Liberté).

1. Neutrophile im Histopathologie Gewebe mit Gewebekulturen Färbung gekennzeichnet MUB₄₀

1. Um das Gewebe für die Histopathologie zu erhalten, befestigen Sie Gewebeentnahme/Abschnitte in einem geeigneten Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bis zu 4 h je nach der Dicke der Probe. Legen Sie die Proben im Kühlschrank 4 ° C, während der Fixierung.
   Hinweis: Alternative Fixierung Methoden/Timings können je nach individuellen Anforderungen des Benutzers ersetzt werden.
   1. Entfernen der PFA, fügen Sie 16 % Saccharose-Lösung mit genügend Volumen, um die Probe vollständig zu bedecken, und legen Sie die Probe bei 4 ° C für 4 h bis zur Übernachtung.
   2. Entfernen Sie 16 % Saccharoselösung und fügen Sie 30 % Saccharoselösung bei einem großen genug um die Probe vollständig zu bedecken hinzu, und legen Sie sie bei 4 ° C für 4 h bis zur Übernachtung.
   3. Entfernen Sie die 30 % Saccharose-Lösung und tupfen Sie überschüssige Lösung aus dem Gewebe mit einem Papiertuch. Die Gewebe-Abschnitt in optimale Temperatur (OCT) Medien und Snap-Freeze in 2-Methylbutane in Trockeneis-Ethanol Badewanne (-72 ° C) abgekühlt. Sobald (nach ~ 2 min) gefroren, entfernen Sie Blöcke aus der 2-Methylbutane und legen Sie sie auf Trockeneis, bis alle Blöcke fertig und bereit für die langfristige Lagerung sind. Speichern Sie die gefrorenen Blöcke bei-80 ° C für die langfristige Lagerung.
2. Am Abend vorher Gewebe Blöcke sind zu schneiden, entfernen Sie sie aus dem-80 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie bei-20 ° C über Nacht equilibrate.
   1. Mit einem Kryostaten, schneiden Sie OCT-eingebettetes Gewebe in 10 - 30 μm dicke Scheiben und adsorbieren Sie, qualitativ hochwertige Glas-Objektträger.
      Hinweis: Dicker oder dünnere Scheiben können abhängig von den experimentellen Anforderungen verwendet werden.
   2. Zeichnen Sie mit einem Wachs-Stift oder anderen hydrophoben Methode ein Feld um die Gewebe-Scheibe auf den Objektträger und lassen Sie trocknen.
   3. Vorbereiten der Färbelösung durch Ausführen einer 1:1,000 Verdünnung der MUB₄₀-Cy5 (oder andere fluoreszierende MUB₄₀Version, 1 mg/mL Stammlösung) in 0,1 % Saponin-PBS-Lösung. Die optimale MUB₄₀ Endkonzentration sollte 1 μg/mL.
      Hinweis: Untere Endkonzentrationen verwendet werden (0,1-0,01 μg/mL), aber kann um zu niedrigeren Signalintensität führen.
      Achtung: Saponin Pulver kann Atmung Reizungen verursachen. Achten Sie darauf, Saponin in einem Schaltschrank oder geschützten Bereich wiegen. Alternative Permeabilisierung Methoden können z. B. Triton verwendet werden. Fügen Sie zusätzliche Markierungen bei vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen (zB., 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Phalloidin, fluoreszierende Antikörper).
   4. Tauchen Sie vorsichtig die Objektträger in eine Lösung von 0,1 % Saponin-PBS dreimal.
   5. Sorgfältig blot entfernt überschüssige Flüssigkeit um den Gewebe-Abschnitt und fügen Sie genug Färbelösung um Abschnitt Gewebe vollständig zu bedecken. Legen Sie die Folie in eine feuchte Kammer zur Vermeidung von Verdampfung und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Halten Sie es vor Licht geschützt werden.
   6. Tauchen Sie vorsichtig die Folie in 0,1 % Saponin-PBS-Lösung 3 X. Dann tauchen Sie sanft die Folie in PBS-Lösung 3 X. Schließlich tauchen Sie sanft das Abrutschen in destilliertem H₂O 3 X. Trocknen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Folie.
   7. Fügen Sie eine kleine Menge (~ 20 μl) Eindeckmedium (20 mM Tris pH 8.0, 0,5 % N-Propyl Gallat, 90 % Glycerin) neben der Gewebe-Scheibe und einem Glas Deckgläschen auf den Objektträger legen Sie sanft hin. Schonend und gleichmäßig drücken Sie das Deckglas auf Abschnitt Gewebe und mit einem Papiertuch, entfernen Sie vorsichtig alle Montage-Medien, die an den Rändern des Deckglases extrudiert.
   8. Legen Sie die montierte Folie in einem dunklen Schrank für 24 h erlauben die Montage-Medien zu festigen. Alternativ legen Sie die montierte Folie bei 37 ° C für 1 h.
3. Bild des Gewebes Scheiben auf einem fluoreszierenden Mikroskop nach der gewünschten Erwerbsmethode.

2. Visualisierung von Neutrophilen Aktivierung mit Retro-Inverso-MUB₄₀-Cy5 Peptid

1. Erhalten Sie menschlichen Neutrophilen verwenden das folgende Protokoll. Bereiten Sie die folgenden Lösungen und legen Sie sie in einer anoxischen Kabinett über Nacht. Einwirkung von Sauerstoff wird zur Aktivierung von Neutrophilen und weiter induzieren Zelle Tod^16,17beginnen.
   Hinweis: Neutrophile können alternativ gereinigt werden "auf der Bank" für MUB₄₀-Kennzeichnung Experimente; Beachten Sie jedoch, dass Sauerstoff Exposition Neutrophilenzahl Aktivierung auswirken wird.
   1. Bereiten Sie die folgende Lösung:
      Lösung 1 [0,9 % Natriumchlorid (NaCl)]: 500 mL H₂O. Filter die Lösung 4,5 g NaCl hinzufügen.
      Lösung 2 (Dextran 6 %): 100 mL 6 g Dextran in NaCl 0,9 % Lösung hinzufügen.
      Lösung 3 (Waschen-Puffer): Auflösen von Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in PBS pH 7,2 bis eine EDTA-Endkonzentration von 2 mM. Unmittelbar vor Gebrauch lösen Sie Rinderserumalbumin (BSA) in der PBS/EDTA-Lösung so, dass die Endkonzentration BSA 10 % w/V auf.
   2. Zentrifugieren Sie Blutentnahmeröhrchen 650 X g für 20 min ohne Pause.
   3. Ohne Unterbrechung der getrennten Blut, übertragen Sie die Blutentnahmeröhrchen auf einer anoxischen Kabinett und sammle Plasma Brüche (oben) in einem 50 mL konische Röhrchen.
   4. Entfernen Sie das Plasma-haltigen Rohr aus dem anoxischen Kabinett und Zentrifuge bei 2.900 x g für 20 min mit Pausen, um die Thrombozyten pellet.
   5. Ohne Unterbrechung die gebeizte Thrombozyten, überweisen Sie sanft die Plasma Röhre zurück auf der anoxischen Kabinett und Pipettieren der Thrombozyten Armen Plasma in ein frisches 50 mL Röhrchen (nachstehend "Plasma").
2. Trennung von roten Blutkörperchen Leukozyten
   1. Verwenden die Röhrchen mit der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) aus Schritt 2.1.3., kombinieren die Erythrozyten in einer konischen 50 mL-Tube (5 Blut Sammlung Rohr Inhalt pro 50 mL-Tube).
   2. Fügen Sie NaCl 0,9 % hinzu, bis das Gesamtvolumen 44 mL erreicht. 6 mL Dextran 6 % (letzte) hinzugeben.
   3. Mischen Sie vorsichtig die Blut/Dextran-Mischung durch Umdrehen der Röhre 10 - 20 Mal. Lassen Sie das Rohr Sediment für mindestens 30 Minuten.
   4. Während Ablagerung stattfindet, bereiten Sie einen Percoll-Gradienten 5,8 mL Plasma in einem 15 mL konische Röhrchen 4,2 mL Percoll-Lösung hinzu, und mischen Sie gut durch das Rohr invertieren.
   5. Sammeln der oberen Teil der Dextran bei dem Versuch, Pipettieren Erythrozyten zu vermeiden.
   6. Ziehen Sie die Schraubkappe, entfernen Sie die Dextran-Röhre aus der anoxischen Kammer und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g für 10 min mit Pausen.
   7. Vorsichtig setzen Sie den Schlauch wieder in anoxischen Kammer ohne zu stören die gebeizte Zellen, und entfernen Sie die Flüssigkeit über pipettieren.
   8. Sanft wieder aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL Plasma und sehr langsam an die Spitze der die Percoll-Lösung. Achten Sie darauf, dass Sie nicht mischen der Schichten, wenn die Zellen an der Spitze Pipettieren zu induzieren.
   9. Entfernen Sie vorsichtig die Percoll-Lösung-Röhre von anoxischen Kammer (Vermeidung mischen) und Zentrifuge bei 800 X g für 20 min ohne Pause. Peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) bleibt auf die Percoll-Lösung-Oberfläche und Neutrophilen werden Pellets mit der Erythrozyten.
3. Entfernung von kontaminierenden Erythrozyten
   1. Bereiten Sie 14 mL Pufferlösung zu waschen, indem Sie 14 mL Waschpuffer 700 μl PBS + 10 % BSA hinzufügen.
   2. Setzen Sie die Percoll-Lösung-Röhre wieder in der anoxischen Kammer. Entfernen Sie die Percoll und PBMCs über pipettieren und auszusetzen Sie gebeizte Zellen in 1 mL der Pufferlösung waschen wieder. Das Pellet wieder ausgesetzt sein wird eine rote Farbe aufgrund von kontaminierenden Erythrozyten haben.
   3. Die neu suspendierten Zellen 200 μL des Anti-CD235a (Glycophorin) magnetische Beads hinzufügen, vorsichtig mischen und mindestens 15 min inkubieren. Dieser Schritt lädt die kontaminierenden Erythrozyten mit magnetischen Beads, damit sie entfernt werden können.
   4. Waschen der Trennsäule mit 2 mL des Waschens Puffer 3 X.
   5. Halten Sie eine 15 mL konische Rohr unter der Spalte "Trennung" pipette langsam die Neutrophilen/RBC-Mischung auf den oberen Rand der Spalte. Sammeln Sie die Zellen in der 15 mL konische Röhre, wie sie durchfließen. Die Durchströmung sollte bewölkt sein und verlieren seine rote Farbe durch die Erythrozyten bleiben an der Spalte gebunden.
   6. Fügen Sie 2 mL Waschpuffer an die Spitze der Säule und sammeln Sie sich in der gleichen 15 mL konische Rohr. Bis zum Ende des Spülprogramms 2 mL sollte der durchströmten klar sein, was bedeutet, dass die Neutrophilen gesammelt worden sind.
   7. Mischen Sie vorsichtig das Rohr um sorgen für gleichmäßige Verteilung der Neutrophilen und 10 μL für Zellzählung zu sammeln. Beachten Sie das Endvolumen für Zelle zählen Zwecke. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einer Standardzelle Zählmethode auf.
   8. Entfernen der Neutrophilen Röhre aus der anoxischen Kammer und Zentrifugieren die Neutrophilen bei 300 X g für 20 min mit Pausen.
   9. Setzen Sie sedimentierte Neutrophilen anoxischen Kammer zurück und entfernen Sie waschen Puffer über pipettieren. Wieder aussetzen der Neutrophilen Pellet im Plasma mit einer maximalen Zelldichte von 10⁷ PMN/mL.
4. Aufzählung der gereinigten Neutrophilen und Visualisierung mit MUB₄₀
   1. Fügen Sie 1 μL des RI-MUB₄₀-Cy5 (1 mg/mL), 1 mL der eine Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium ohne Phenol rot. Durch Pipettieren gut mischen.
   2. Für die Zwecke dieses Protokolls wurde das Ergebnis erläutert, wie wenn ein potenter Neutrophilen Aktivierung Reagenz, N-Formylmethionyl-Leucyl-Phenylalanin (FMLP), wird hinzugefügt. Die RPMI/RI-MUB₄₀1 μm FMLP hinzufügen-Cy5 Rohr und Mix über Pipettieren rauf und runter.
      Hinweis: Jeder Versuchsdurchführung wird von diesem Punkt vorwärts, je nach der Fragen unterscheiden.
   3. 1 mL RPMI/RI-MUB₄₀überführen-Cy5/FMLP-Mischung zu einer Glasschale unten Mikroskopie. Dieses Gericht fügen Sie ein Volumen von gereinigten Zellen entspricht 10⁶ total Neutrophilen hinzu. Mischen Sie, indem Sie sanft pipettieren.
   4. Legen Sie die Schale in einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop und starten Sie Bildaufnahme zu. Beispielsweise empfiehlt es sich, Grundlinie Bilder vor der Zugabe von einer Aktivierung von Neutrophilen Reagenz wie FMLP oder Bakterien erwerben. In diesem Beispiel beginnen die Übernahme von RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5/Neutrophilen, und bei einer späteren Timepoint pipette die Aktivierung von Neutrophilen Reagenz in der Glasschale und Bildaufnahme fortsetzen.
      Hinweis: Änderungen an diesen Schritten können basierend auf wissenschaftlichen Bedürfnisse erfolgen.
   5. Prozess erworbenen Bilder/time-Zeitraffer Filme wie bezieht sich auf die speziellen Mikroskop verwendet.

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Ergebnisse

Ergebnisse der MUB₄₀-gefärbten Gewebe von Histopathology Dias zeigen in der Regel einzelne Zellen in das Gewebe verteilt. MUB₄₀ Flecken Lactoferrin, die ist in Neutrophilen Granulat und Abteilen. So gesehen, in der Regel punctata beflecken oder mehrere große getrennte Bereiche des Signals aus einzelnen Neutrophilen (Abbildung 1) kommen. Es ist hilfreich, fügen eine zweite Zelle Markierung wie DAPI zu helfen, das MUB₄₀ Signa...

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Diskussion

Hier sind zwei Tests beschrieben, in denen das MUB₄₀ Peptid verwendet wird, um Neutrophilenzahl Entzündung und Aktivierung zu studieren. Wir zeigen, wie MUB₄₀ offenbaren kann, Neutrophile in Histopathologie Abschnitte oder zeigen ihren Aktivierungsstatus mit live gereinigten Neutrophilen. Die entscheidenden Schritte für die Verwendung von MUB₄₀ als Färbung Reagens sind dasselbe wie mit keiner anderen Methode der Fluoreszenz-Detektion. Vorsicht ist geboten, damit Kompatibilität von flu...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixative for histology
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Used to section tissues
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	Hi precision coverslip
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Stains DNA
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope	Various	Various	Used to image IF slides
Anoxic Cabinet	Various	Various	Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Washing buffer component
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Washing buffer component
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Used to remove contaminating RBCs
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Used for neutrophil assays