Le Peptide de40 MUB destinés à détecter l’Inflammation induite par le neutrophile événements

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à détecter la présence de neutrophiles dans les sections fixes/perméabilisées histologie et évaluer l’état d’activation des neutrophiles purifiées direct. En particulier, le peptide de₄₀ MUB lie la lactoferrine présente dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. Exposition du contenu par perméabilisation ou activation neutrophile granule permet le marquage des neutrophiles.

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole impliquant l’utilisation de MUB₄₀, un peptide synthétisé avec le pouvoir de lier la lactoferrine glycosylée stockée à des concentrations élevées dans les granules spécifiques et tertiaires des neutrophiles. Ce détails du protocole comment MUB₄₀ conjugué directement à un fluorophore peuvent être utilisé pour colorer les neutrophiles en fixe/perméabilisées tissus ainsi que la façon dont ceci peut être utilisé dans l’imagerie de cellules vivantes à analyser pour la granulation et activation de neutrophile. Méthodes de détection neutrophiles sont limités à des anticorps monoclonaux spécifiques à l’espèce, qui ne sont pas toujours adaptés pour certaines applications. MUB₄₀ ne pénètre pas la membrane cellulaire et est donc exclu de la lactoferrine stockée dans les neutrophiles non-activé/non-perméabilisées. MUB₄₀ a l’avantage de reconnaître la lactoferrine d’une vaste gamme d’hôtes, ce qui en fait surtout utile pour comparer les résultats dans les études impliquant des modèles de recherche multiple, réduisant le nombre de réactifs en double et en simplifiant les protocoles par la seule étape souillure.

Introduction

Neutrophiles sont une des branches principales du système immunitaire inné et sont systématiquement recrutés aux sites d’inflammation autour du corps. L’étude des neutrophiles a été grandement altérée par leur courte durée de vie in vitro (moins de 8 h) et par les outils de détection limitée dans des conditions basales ou après l’activation. Nous présentons ici un protocole éprouvé pour la détection large et spécifique des neutrophiles mammifères dans les échantillons fixe/perméabilisées. Nous fournissons également un protocole détaillé pour la coloration des neutrophiles direct avec MUB₄₀. En utilisant le protocole de coloration neutrophil direct, le calendrier et la localisation d’activation neutrophile peuvent être déterminées. Ce protocole est idéal pour les chercheurs qui souhaitent étudier les neutrophile libération d’activation ou de granules. Au-delà de leurs fonctions antimicrobiennes, neutrophiles sont maintenant appréciés comme des immunomodulateurs cellules impliqués dans un large éventail de maladies et de la réponse immunitaire (inné et adaptatif)^1,2. Les neutrophiles sont présents dans les tissus inflammatoires plus, à des nombres élevés dans les tissus infectés et dans les tumeurs inflammatoires³, au cours de l’IBS et de Crohn poussées⁴, dans les zones d’inflammation non infectieuses comme le synovia de polyarthrite rhumatoïde ( Les patients de RA)⁵. Neutrophiles contiennent des quatre classes de granules préformés nommées azurophiles (α), spécifiques (β1), granules tertiaires (β2) et vésicules de sécrétion (γ)⁶. Lors de la migration vers un site inflammatoire, neutrophiles recrutés deviennent activés et sécrètent séquentiellement contenu de granule (composé d’adhérence, composés antimicrobiens et molécules immunomodulatrices), qui favorise davantage le recrutement et contribue à infection de résolution (mais aussi à des lésions tissulaires hôte)⁷. Tandis que les neutrophiles sont considérés comme un aspect essentiel de l’immunité innée, ce jour là sont peu réactifs de détection disponibles à les étudier, et encore moins qui peut être utilisé pour évaluer l’état d’activation des neutrophiles vivant.

Les méthodes actuelles de détection des neutrophiles s’appuient sur des anticorps monoclonaux contre des antigènes exposés de surface cellulaire, comme Ly - 6 G² ou protéines spécifiquement stockés dans des granules de neutrophiles dans les conditions basales (p. ex., myéloperoxydase la lactoferrine). Avantages des anticorps monoclonaux sont leur forte liaison, une sensibilité et polyvalence dans diverses conditions de test. Cependant, il y a plusieurs inconvénients à l’utilisation des anticorps monoclonaux et anti-Ly - 6G en particulier. Ces inconvénients incluent la spécificité, comme Ly - 6G est présent sur la plupart des cellules myéloïdes dans la moelle osseuse et sur tous les granulocytes notamment éosinophiles ; déchiffrage des neutrophiles d’éosinophiles avec ce marqueur requiert donc⁸des approches plus complexes. Un autre compromis fréquents avec des anticorps monoclonaux est leur gamme de spécificité d’hôte souvent limité, complique les comparaisons effectuées avec plus d’une espèce animale. Un troisième inconvénient des méthodes de détection d’anticorps, en particulier lors de l’utilisation des cellules vivantes ou in vivo, est leur capacité à perturber la fonction cellulaire ou mènent à l’activation des cellules. Par exemple, l’administration d’anti-Ly - 6G de souris est couramment appliquée à l’appauvrissement de neutrophil et de neutropénie transitoire⁹. En outre, il a été démontré qu’injection d’anticorps pourrait stimuler la fonction antitumorale neutrophiles¹⁰. Enfin, la détection des anticorps des neutrophiles ne révèle pas l’état d’activation de la cellule.

Nous avons identifié un peptide d’acides aminés 40 appelé MUB₄₀, qui peut être utilisé dans un certain nombre d’épreuves pour étiqueter des neutrophiles dans des conditions in vitro ou in vivo ainsi que d’analyse l’état d’activation des neutrophiles direct¹¹. MUB₄₀ est dérivé de MUB₇₀¹², un domaine de la protéine liant le mucus de surface de Lactobacillus reuteri décrite à l’origine pour sa capacité à lier les mucus^13,14. MUB₄₀ interagit avec la lactoferrine glycosylée qui est présente à des concentrations élevées dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. MUB₄₀ peuvent être exposés à ces granules des étapes perméabilisation standard qui sont présents en histopathologie ou fluorescence-lancée de cellules tri des protocoles (FACS) pour coloration robuste des neutrophiles fixes. Lorsque live neutrophiles sont conservés dans un état inactivé, le peptide de₄₀ MUB est exclu le contenu de granule et cellules tache pas positifs avec le marqueur. Lors de l’activation, MUB₄₀ peut se lier à la lactoferrine exposée et conduire à coloration robuste avec le peptide. Ainsi, MUB₄₀ peut servir à déterminer l’état d’activation des neutrophiles purifiés, ce qui en fait un marqueur attrayant de suivre le processus infectieux. La capacité de liaison aux neutrophiles activés en direct permet également aux MUB₄₀ à être utilisé comme un outil pour détecter les zones d’inflammation neutrophile dans des modèles animaux vivants (par exemple, une souris arthrite modèle¹⁵). Les protocoles ce manuscrit en détail comment fluorescent étiqueté MUB₄₀ peuvent être utilisés pour révéler des neutrophiles dans les tissus de l’histologie et comment analyser l’activation des neutrophiles purifiée live in vitro.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été examinées et approuvées par les organismes Français CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) et CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).

1. coloration des neutrophiles dans le tissu d’histopathologie avec fluorescent étiquetés MUB₄₀

1. Pour obtenir le tissu pour l’histopathologie, difficulté sections/biopsie de tissu dans un volume adéquat de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 30 min à 4 h selon l’épaisseur de l’échantillon. Placer les échantillons dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la fixation.
   Remarque : Méthodes de fixation Alternative/horaires peuvent être remplacés selon les exigences uniques de l’utilisateur.
   1. Supprimer la PFA, ajouter la solution de saccharose de 16 % avec un volume suffisant pour recouvrir entièrement l’échantillon et placer l’échantillon à 4 ° C pendant 4 h jusqu'à la nuit.
   2. Enlever la solution de saccharose de 16 % et ajouter une solution de saccharose 30 % à un volume assez grand pour recouvrir entièrement l’échantillon et placez-le à 4 ° C pendant 4 h jusqu'à la nuit.
   3. Enlever la solution de saccharose 30 % et éponger hors excédent de solution du tissu avec du papier absorbant. Placer la section de tissu dans les médias de température (OCT) de coupe optimale et clin d’oeil-gel 2-méthylbutane refroidi dans un bain de glace sèche-éthanol (-72 ° C). Une fois gelé (après environ 2 min), retirer les blocs de la 2-méthylbutane et placez-les sur la glace sèche jusqu'à ce que tous les blocs sont terminé et prêt pour le stockage à long terme. Stocker les blocs congelés à-80 ° C pour le stockage à long terme.
2. La veille de blocs de tissus doivent être coupés, les sortir du congélateur-80 ° C et placez-les à-20 ° C pendant la nuit s’équilibrer.
   1. À l’aide d’un cryostat, couper le tissu OCT-encastré en tranches de 10 à 30 μm d’épaisseur et s’adsorber sur lames de verre de haute qualité.
      Remarque : Plus épais ou plus minces tranches peuvent être utilisés selon les conditions expérimentales.
   2. Avec un crayon de cire ou autre méthode hydrophobe, dessinez un rectangle autour de la tranche de tissu sur la lame de verre et laissez sécher.
   3. Préparer la solution colorante en effectuant une dilution de 1 : 1 000 de MUB₄₀-Cy5 (ou autre version fluorescente de₄₀MUB, 1 mg/mL de solution) dans une solution de saponine-PBS de 0,1 %. La concentration optimale de₄₀ MUB finale devrait être de 1 μg/mL.
      Nota : La concentration finale inférieure peut être utilisée (0,01-0,1 μg/mL), mais peut conduire à abaisser l’intensité du signal.
      Attention : Poudre de saponine peut causer une irritation respiratoire. Prenez soin de peser la saponine dans un placard ou protégées. Méthodes perméabilisation alternatives peuvent être utilisées comme Triton. Ajouter des marqueurs supplémentaires à des concentrations de fabricant-recommandé (p. ex.., 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), la phalloïdine, anticorps fluorescents).
   4. Doucement, trempez la lame de verre dans une solution de saponine-PBS de 0,1 % trois fois.
   5. Soigneusement éponger le liquide en excès loin autour de la section de tissus et ajouter assez solution colorante pour couvrir complètement la section de tissu. Placez le chariot dans une chambre humide pour éviter l’évaporation et il incuber pendant 1 heure à température ambiante. Gardez-la à l’abri de la lumière.
   6. Tremper délicatement la lame dans la solution de saponine-PBS 0,1 % 3 x. Puis, doucement tremper la lame dans la solution de PBS 3 x. Enfin, doucement tremper la lame dans distillée H₂O 3 x. Séchez soigneusement le liquide en excès de la diapositive.
   7. Ajouter une petite quantité (~ 20 μL) de milieu de montage (20 mM Tris pH 8,0, gallate de propyle de 0,5 %, 90 % de glycérol) à côté de la tranche de tissu et poser délicatement vers le bas une lamelle de verre sur le dessus de la lame de verre. Légèrement et uniformément, appuyer sur la lamelle couvre-objet sur la section de tissu et, à l’aide d’une serviette en papier, retirez soigneusement tout support de montage qui extrude autour des bords de la lamelle.
   8. Placez le chariot monté dans une armoire sombre pendant 24 heures afin de permettre le support de montage solidifier. Vous pouvez également mettre la lame montée à 37 ° C pendant 1 h.
3. Les tranches de tissu sur un microscope à fluorescence selon la méthode d’acquisition souhaitée de l’image.

2. visualisation des neutrophile Activation avec rétro-Inverso-MUB₄₀-Peptide Cy5

1. Obtenir des neutrophiles humains en utilisant le protocole suivant. Préparer les solutions suivantes et placez-les dans une nuit armoire anoxique. Exposition à l’oxygène commence à activer des neutrophiles et induire davantage cellule mort^16,17.
   Remarque : Neutrophiles peuvent être alternativement purifiés « sur le banc » MUB₄₀-étiquetage des expériences ; Toutefois, sachez qu’exposition oxygène vont commencer à affecter les neutrophile activation.
   1. Préparer la solution suivante :
      Solution 1 [chlorure de sodium (NaCl) 0,9 %] : ajouter 4,5 g de NaCl à 500 mL d’H₂O. filtrer la solution.
      Solution 2 (dextran 6 %) : ajouter 6 g de dextran dans NaCl 0,9 % solution à 100 mL.
      Solution 3 (tampon de lavage) : dissoudre l’acide tétraacétique (EDTA) dans le tampon au phosphate pH 7,2 à une concentration finale de EDTA de 2 mM. Immédiatement avant l’utilisation, dissoudre l’albumine sérique bovine (BSA) dans la solution de PBS/EDTA telle que la concentration finale de BSA est 10 % p/v.
   2. Centrifuger les tubes de prélèvement sanguin à 650 x g pendant 20 minutes sans pauses.
   3. Sans perturber le sang séparé, transférer les tubes de prélèvement sanguin à un fractions anoxique plasma frais virés et du cabinet (en haut) dans un tube conique de 50 mL.
   4. Retirer le tube contenant du plasma du cabinet anoxique et centrifuger à 2 900 x g pendant 20 min avec des pauses pour granuler les plaquettes.
   5. Sans perturber les plaquettes granulés, transfert de doucement le tube de plasma dans le cabinet anoxique et la pipette le plasma pauvre en plaquettes dans un tube de frais 50 mL (ci-après dénommé « plasma »).
2. Séparation des globules rouges de leucocytes
   1. En utilisant les tubes contenant les globules rouges (hématies) de l’étape 2.1.3., combiner les globules rouges dans un tube conique de 50 mL (5 sang tube contenu de la collection par tube de 50 mL).
   2. Ajouter NaCl 0,9 % jusqu'à ce que le volume total s’élève à 44 mL. Ajouter 6 mL de dextran 6 % (dernier).
   3. Mélanger délicatement le mélange de sang/dextran en renversant le tube de 10 à 20 fois. Laissez le sédiment du tube pendant au moins 30 min.
   4. Alors que la sédimentation se produit, préparer un gradient de Percoll en ajoutant 4,2 mL de solution de Percoll à 5,8 mL de plasma dans un tube conique de 15 mL et bien mélanger en renversant le tube.
   5. Recueillir la fraction supérieure du dextran tout en essayant d’éviter de pipetage de globules rouges.
   6. Serrer le bouchon à vis, retirez le tube de dextran de la chambre anoxique et centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 min avec des pauses.
   7. Soigneusement placer le tube dans la chambre d’anoxique sans déranger les cellules granulés et évacuer le liquide par pipetage.
   8. Doucement resuspendre le culot dans 1 mL de plasma et ajouter très lentement vers le haut de la solution de Percoll. Veillez à ne pas induire le mélange des couches lors du pipetage les cellules sur le dessus.
   9. Retirer délicatement le tube de solution Percoll de la chambre anoxique (en évitant le mélange) et centrifuger à 800 x g pendant 20 minutes sans pauses. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) restera à la surface de solution Percoll et neutrophiles seront pellet avec les globules rouges.
3. Enlèvement de contaminer des globules rouges
   1. Préparation de 14 mL de solution tampon de lavage en ajoutant 700 μL PBS + 10 % de BSA à 14 mL de tampon de lavage.
   2. Placer le tube de solution Percoll dans la chambre d’anoxique. Retirez le Percoll et PBMC par pipetage et remettre en suspension les cellules boulettes dans 1 mL de solution tampon de lavage. Le culot d’être remises en suspension aura une couleur rouge en raison de la contamination de globules rouges.
   3. Ajouter 200 μl de billes magnétiques anti-CD235a (glycophorine) aux cellules remises en suspension, mélanger doucement et incuber pendant au moins 15 min. Cette étape charge les hématies contaminantes avec billes magnétiques afin qu’ils puissent être enlevés.
   4. Laver la colonne de séparation avec 2 mL de lavage tampon x 3.
   5. Tout en maintenant un tube conique de 15 mL sous la colonne de séparation, lentement déposer le mélange de neutrophile/RBC en haut de la colonne. Recueillir les cellules dans le tube de 15 mL conique qu’ils traversent. Le cheminement sera nuageux et perdre sa couleur rouge à cause de la SCFR restant lié à la colonne.
   6. Ajouter 2 mL de tampon vers le haut de la colonne de lavage et de recueillir dans le même tube conique de 15 mL. La fin du cycle de lavage 2 mL, le cheminement doit être clair, ce qui signifie que tous les neutrophiles ont été recueillis.
   7. Mélanger doucement le tube pour assurer une répartition égale des neutrophiles et collecter 10 μL pour le comptage des cellules. Noter le volume final de cellule comptage fins. Énumérer le nombre total de cellules avec n’importe quelle cellule standard méthode de comptage.
   8. Retirer le tube de neutrophil de la chambre anoxique et centrifuger les neutrophiles à 300 x g pendant 20 min avec des pauses.
   9. Placer les neutrophiles sédimentés dans la chambre d’anoxique et retirer le tampon de lavage par pipetage. Resuspendre le culot de neutrophil dans le plasma avec une densité maximale de 10⁷ PMN/mL.
4. Énumération des neutrophiles purifiées et visualisation à l’aide de MUB₄₀
   1. Ajouter 1 μL de RI-MUB₄₀-Cy5 (1 mg/mL) à 1 mL de milieu Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sans rouge de phénol. Mélanger en pipettant également bien.
   2. Aux fins du présent protocole, le résultat a été décrit comme si un puissant neutrophile activation réactif, N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine (FMLP), est ajouté. Ajouter 1 μm de FMLP dans le RPMI/RI-MUB₄₀-mélange par pipetage et Cy5 tube haut et bas.
      Remarque : Chaque procédure expérimentale sera différente à partir de ce moment, selon les questions abordées.
   3. Transférer le RPMI/RI-MUB₄₀de 1 mL-Cy5/FMLP mélange dans un plat de microscopie de fond de verre. Pour ce plat, ajouter un volume de cellules purifiées correspondant à 10⁶ total neutrophiles. La composition de pipetage doucement.
   4. Placer le plat dans un microscope inversé à fluorescent et acquisition d’images de démarrage. Par exemple, il est recommandé d’acquérir des images de référence avant l’addition d’un réactif d’activation des neutrophiles comme FMLP ou bactéries. Dans cet exemple, commencer l’acquisition de RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5/neutrophiles, un validant ultérieure, pipeter le réactif de l’activation des neutrophiles dans le plat en verre et à poursuivre l’acquisition d’images.
      Remarque : Modifications à ces étapes peuvent être effectuées selon besoins scientifiques.
   5. Processus acquis films images/time-lapse comme se rapporte au microscope spécifique utilisé.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Résultats de MUB₄₀-tissus tachés de diapositives d’histopathologie révèlent en général des cellules individuelles, dispersés à travers le tissu. MUB₄₀ taches lactoferrine, qui est présente dans les granules neutrophiles et compartimentée. Ainsi, généralement vu sont ponctuée de taches ou de plusieurs grandes surfaces séparées du signal en provenance des neutrophiles (Figure 1). Il est utile d’ajouter un deuxième marqu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ici, deux essais sont décrits dans lequel le peptide de₄₀ MUB est utilisé pour étudier l’activation et l’inflammation neutrophile. Nous montrons comment MUB₄₀ peut révéler des neutrophiles présent dans les sections de l’histopathologie ou montrent leur état d’activation à l’aide de direct neutrophiles purifiées. Les étapes critiques d’utilisation MUB₄₀ comme réactif de coloration sont les mêmes qu’avec n’importe quelle autre méthode de détection par fluoresce...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixative for histology
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Used to section tissues
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	Hi precision coverslip
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Stains DNA
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope	Various	Various	Used to image IF slides
Anoxic Cabinet	Various	Various	Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Washing buffer component
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Washing buffer component
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Used to remove contaminating RBCs
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Used for neutrophil assays