Il Peptide di40 MUB per uso nella rilevazione eventi infiammatori mediato dai neutrofili

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la presenza di neutrofili in sezioni di istologia fisso/permeabilizzate e valutare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati dal vivo. In particolare, il peptide di₄₀ MUB associa la lattoferrina presente nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. L'esposizione del contenuto granello tramite permeabilizzazione o l'attivazione del neutrofilo permette per la marcatura dei neutrofili.

Abstract

Qui, forniamo un protocollo che prevedono l'uso di MUB₄₀, un peptide sintetizzato con la capacità di legare la lattoferrina glicosilata memorizzata ad alte concentrazioni nei granuli specifici e terziari dei neutrofili. Dettagli di questo protocollo come MUB₄₀ coniugato direttamente a un fluoroforo possono essere utilizzato a macchiare i neutrofili in fissa/permeabilizzate tessuti pure come questo possa essere utilizzato in cellule vive di imaging analizzare per-granulazione e attivazione dei neutrofili. Metodi di rilevazione dei neutrofili sono limitati a specie-specifici anticorpi monoclonali, che non sono sempre adatti per determinate applicazioni. MUB₄₀ non penetrare la membrana cellulare e quindi è escluso dalla lattoferrina memorizzata nei neutrofili non-attivato/non-permeabilized. MUB₄₀ ha il beneficio aggiunto di riconoscere lattoferrina da una gamma vasta host, che lo rende particolarmente utile per confrontare i risultati di studi condotti su diversi modelli di ricerca, riducendo il numero di duplicati reagenti e semplificando i protocolli attraverso passo singolo di colorazione.

Introduzione

I neutrofili sono una delle armi primarie del sistema immunitario innato e ordinariamente sono reclutati ai siti di infiammazione intorno al corpo. Lo studio dei neutrofili è stato in gran parte alterato dalla loro durata di vita breve in vitro (meno di 8 h) e dagli strumenti di rilevazione limitata in condizioni basali o dopo l'attivazione. Qui, presentiamo un protocollo ben collaudato per la rilevazione di ampio e specifico dei mammiferi neutrofili nei campioni fissati/permeabilizzate. Forniamo anche un protocollo dettagliato per la macchiatura diretta neutrofili con MUB₄₀. Utilizzando il protocollo di colorazione del neutrofilo dal vivo, la tempistica e la posizione dell'attivazione dei neutrofili può essere individuati. Questo protocollo è ideale per i ricercatori che desiderano studiare il rilascio dei neutrofili di attivazione o granello. Di là di loro funzioni antimicrobiche, neutrofili sono ora apprezzati come immunomodulatori cellule coinvolte in una vasta gamma di malattie e le risposte immunitarie (innato e adattivo)^1,2. I neutrofili sono presenti in tessuti più infiammatori, agli alti numeri nei tessuti infetti, i tumori infiammatori³, durante IBS e di Crohn flare-up⁴e nelle aree di infiammazione non infettiva quali synovia di artrite reumatoide ( RA) pazienti⁵. Neutrofili contengono quattro classi di granuli preformati denominato azurophil (α), specifiche (β1), granuli di terziario (β2) e vescicole secretorie (γ)⁶. Durante la migrazione di un sito infiammatorio, reclutati neutrofili attivati e in sequenza secernono contenuto granello (composto da molecole di immunomodulatori, di adesione e di composti antimicrobici), che promuove ulteriormente reclutamento e contribuisce alla infezione ad alta risoluzione (ma anche a danno di tessuto host)⁷. Mentre i neutrofili sono considerati un aspetto critico dell'immunità innata, ad oggi vi sono alcuni reagenti di rilevamento disponibili per studiarli, e ancor meno che può essere utilizzato per valutare lo stato di attivazione dei neutrofili vivente.

Attuali metodi di rilevazione dei neutrofili si basano su anticorpi monoclonali generati contro gli antigeni esposti cellula-superficie, ad esempio Ly - 6 G² o proteine in particolare memorizzati in granuli neutrofili in condizioni basali (ad es., mieloperossidasi lattoferrina). Anticorpi monoclonali vantaggi loro forte legame, sensibilità e versatilità in diverse condizioni di dosaggio. Tuttavia, ci sono diversi aspetti negativi all'utilizzo di anticorpi monoclonali e anti-Ly - 6G in particolare. Questi aspetti negativi includono la specificità, come Ly - 6G è presente sulla maggior parte delle cellule mieloidi nel midollo osseo e su tutti i granulociti compresi gli eosinofilo; decifrare i neutrofili da eosinofilo con questo marcatore richiede pertanto più complessi si avvicina a⁸. Un altro frequente compromesso con gli anticorpi monoclonali è il loro range di specificità spesso limitata host, rendendo difficili gli studi di confronto con più di una specie animale. Un terzo inconveniente di metodi di rilevazione dell'anticorpo, specialmente quando si utilizzano celle in tensione o in vivo, è il loro potenziale per disturbare la funzione delle cellule o portare alla attivazione delle cellule. Ad esempio, la somministrazione di anti-Ly - 6g ai topi è comunemente applicata allo svuotamento del neutrofilo e neutropenia transitoria⁹. Inoltre è stato dimostrato che l'iniezione di anticorpi può stimolare funzione antitumorale del neutrofilo¹⁰. Infine, rilevazione dell'anticorpo dei neutrofili non rivela lo stato di attivazione della cellula.

Abbiamo identificato un peptide di 40 aminoacidi chiamato MUB₄₀, che può essere utilizzato in un certo numero di saggi per etichettare i neutrofili in condizioni in vitro o in vivo , nonché di analizzare lo stato di attivazione dei neutrofili live¹¹. MUB₄₀ è derivato da MUB₇₀¹², un dominio della superficie Lactobacillus reuteri muco-binding protein originariamente descritto per la sua capacità di legare il muco^13,14. MUB₄₀ interagisce con lattoferrina glicosilata che è presente in alte concentrazioni nei granuli specifici del neutrofilo e terziari. MUB₄₀ possono essere esposti a questi granuli attraverso passi di permeabilizzazione standard presenti in istopatologia o fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento protocolli (FACS) per la macchiatura robusta dei neutrofili fissi. Quando i neutrofili dal vivo sono tenuti in uno stato inattivato, il peptide di₄₀ MUB è escluso dal contenuto del granello, e cellule non macchia positive con il marcatore. Al momento dell'attivazione, MUB₄₀ possono associare alla lattoferrina esposta e portare a macchiatura robusta con il peptide. Così, MUB₄₀ può essere utilizzato per determinare lo stato di attivazione dei neutrofili purificati, che lo rende un marcatore attraente di seguire il processo contagioso. La capacità di legarsi a vivere neutrofili attivati consente inoltre MUB₄₀ essere utilizzato come uno strumento per rilevare le aree di infiammazione del neutrofilo nei modelli animali dal vivo (ad esempio, un mouse artrite modello¹⁵). I protocolli in questo dettaglio del manoscritto come fluorescente etichettati MUB₄₀ utilizzabile per rivelare i neutrofili in istologia tessuti e come analizzare l'attivazione dei neutrofili purificati dal vivo in vitro.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati esaminati e approvati dalle organizzazioni francese Zinebsbai (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) e CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).

1. colorazione fluorescente neutrofili nel tessuto di istopatologia con etichettati MUB₄₀

1. Per ottenere il tessuto per l'istopatologia, Difficoltà sezioni di biopsia del tessuto in un volume adeguato di paraformaldeide al 4% (PFA) per 30 min fino a 4 ore a seconda dello spessore del campione. Posizionare i campioni in frigorifero a 4 ° C durante la fissazione.
   Nota: Fissazione alternativi metodi/temporizzazione può essere sostituiti basata su esigenze specifiche dell'utente.
   1. Rimuovere il PFA, aggiungere 16% soluzione di saccarosio con volume sufficiente a coprire completamente il campione e il campione viene posto a 4 ° C per 4 ore fino a notte.
   2. Rimuovere la soluzione di saccarosio al 16% e aggiungere soluzione di saccarosio al 30% a un volume abbastanza grande da coprire completamente il campione e posizionarlo a 4 ° C per 4 ore fino a notte.
   3. Rimuovere la soluzione di saccarosio 30% e asciugare fuori della soluzione in eccesso dal tessuto con un tovagliolo di carta. Posizionare la parte di tessuto a media temperatura (OCT) di taglio ottimale e snap-freeze in 2-metilbutano raffreddata in un bagno di ghiaccio secco-etanolo (-72 ° C). Una volta congelato solido (dopo ~ 2 min), rimuovere i blocchi da 2-metilbutano e metterli su ghiaccio secco fino a quando tutti i blocchi sono finiti e pronti per l'archiviazione a lungo termine. Memorizzare i blocchi congelati a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
2. La notte prima di blocchi di tessuto devono essere tagliati, rimuoverli dal congelatore-80 ° C e metterli a-20 ° C durante la notte per equilibrare.
   1. Utilizzando un criostato, tagliare tessuto OCT-incastonato in 10 - 30 μm di spessore fette e adsorbire per lastre di vetro di alta qualità.
      Nota: Più spessi o più sottili fette possono essere utilizzati a seconda delle esigenze sperimentali.
   2. Con una penna di cera o altro metodo idrofobo, disegnare una casella intorno alla fetta di tessuto su vetrino e lasciare asciugare.
   3. Preparare la soluzione colorante eseguendo una diluizione di 1:1,000 di MUB₄₀-Cy5 (o altra versione di₄₀MUB fluorescente, soluzione madre 1 mg/mL) in soluzione di saponina-PBS 0.1%. La concentrazione di₄₀ MUB finale ottimale dovrebbe essere 1 μg/mL.
      Nota: Le concentrazioni più basse di finale possono essere utilizzate (0.1-0.01 μg/mL), ma può condurre per abbassare l'intensità del segnale.
      Attenzione: La polvere di saponina può causare irritazione di respirazione. Assicurati di pesare saponina in una zona protetta o del gabinetto. Permeabilizzazione alternativi metodi possono essere utilizzati come Tritone. Aggiungere ulteriori indicatori alle concentrazioni consigliate dal produttore (ad es., 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, anticorpi fluorescenti).
   4. Delicatamente immergere il vetrino in una soluzione di saponina-PBS + 0.1% tre volte.
   5. Accuratamente asciugare il liquido in eccesso lontano intorno alla sezione di tessuto e aggiungere sufficiente soluzione colorante per coprire completamente la sezione del tessuto. Porre il vetrino in una camera umida per evitare l'evaporazione e incubare per 1 h a temperatura ambiente. Tenerlo al riparo dalla luce.
   6. Immergere delicatamente il vetrino nella soluzione di saponina-PBS 0.1% 3 x. Quindi, immergete delicatamente il vetrino nella soluzione PBS 3 x. Infine, immergere delicatamente il vetrino in acqua distillata H₂O 3 volte. Asciugare accuratamente il liquido in eccesso dalla diapositiva.
   7. Aggiungere una piccola quantità (~ 20 μL) di mezzo di montaggio (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5% N-propyl gallate, 90% glicerolo) accanto la fetta di tessuto e si sdraiò delicatamente un vetrino coprioggetti sopra il vetrino. Delicatamente e uniformemente premere il coprioggetto sulla sezione del tessuto e, utilizzando un tovagliolo di carta, rimuovere con cura qualsiasi mezzi di montaggio che estrude intorno ai bordi del coprivetrino.
   8. Porre il vetrino montato in un armadio scuro per 24 h per consentire il supporto di montaggio a solidificare. In alternativa, è possibile porre il vetrino montato a 37 ° C per 1 h.
3. Le fette di tessuto su un microscopio a fluorescenza secondo il metodo di acquisizione desiderata dell'immagine.

2. visualizzazione dell'attivazione dei neutrofili con Retro-Inverso-MUB₄₀-Cy5 Peptide

1. Ottenere neutrofili umani utilizzando il seguente protocollo. Preparare le seguenti soluzioni e metterli in una notte di governo anossica. L'esposizione all'ossigeno inizierà attivare neutrofili e ulteriormente indurre cellule morte^16,17.
   Nota: I neutrofili possono essere in alternativa purificati "in panchina" per MUB₄₀-etichettatura esperimenti; Tuttavia, essere consapevoli che l'esposizione all'ossigeno comincerà a influire sull'attivazione dei neutrofili.
   1. Preparare la soluzione seguente:
      Soluzione 1 [0,9% di cloruro di sodio (NaCl)]: aggiungere 4,5 g di NaCl a 500 mL di H₂O. filtro la soluzione.
      Soluzione 2 (destrano 6%): aggiungere 6 g di destrano in soluzione di NaCl 0,9% a 100 mL.
      Soluzione 3 (tampone di lavaggio): sciogliere l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS pH 7.2 a una concentrazione finale di EDTA di 2 mM. Immediatamente prima dell'uso, sciogliere albumina di siero bovino (BSA) nella soluzione PBS/EDTA, tale che la concentrazione finale di BSA è 10% w/v.
   2. Centrifugare le provette per prelievo ematico a 650 x g per 20 minuti senza interruzioni.
   3. Senza interrompere il sangue separati, trasferire i tubi di raccolta del sangue a un frazioni del plasma di armadietto e raccogliere anossico (in alto) in una provetta conica da 50 mL.
   4. Rimuovere il tubo al plasma contenenti dal governo anossico e centrifugare a 2.900 x g per 20 min con pause per appallottolare le piastrine.
   5. Senza interrompere le piastrine pellettate, trasferire delicatamente il tubo al plasma nel governo anossico e dispensare il plasma povero di piastrine in una provetta di fresca 50 mL (d'ora in avanti chiamato "plasma").
2. Separazione dei globuli rossi dai leucociti
   1. Usando le provette contenenti i globuli rossi (RBCs) dal punto 2.1.3., combinare i globuli rossi in una provetta conica 50 mL (5 sangue tubo contenuto insieme al tubo da 50 mL).
   2. Aggiungere NaCl 0,9%, fino a quando il volume totale raggiunge 44 mL. Aggiungere 6 mL di destrano 6% (ultimo).
   3. Mescolare delicatamente la miscela di sangue/destrano capovolgendo la provetta 10 - 20 volte. Lasciate che il sedimento di tubo per almeno 30 min.
   4. Mentre avviene la sedimentazione, preparare un gradiente di Percoll aggiungendo 4,2 mL di soluzione di Percoll a 5,8 mL di plasma in una provetta conica da 15 mL e mescolare bene capovolgendo la provetta.
   5. Raccogliere la frazione superiore del destrano mentre cercava di evitare di pipettaggio globuli rossi.
   6. Serrare il tappo a vite, rimuovere il tubo di destrano dalla camera anossica e centrifugare la provetta a 300 x g per 10 min con pause.
   7. Posizionare il tubo indietro nella camera anossica senza disturbare le cellule pellettate e rimuovere il liquido tramite il pipettaggio.
   8. Delicatamente, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di plasma e aggiungere molto lentamente verso l'alto della soluzione Percoll. Fare attenzione a non indurre miscelazione degli strati quando si pipetta le cellule sulla parte superiore.
   9. Rimuovere con cautela il tubo di soluzione di Percoll dall'aula anossico (evitando di miscelazione) e centrifuga a 800 x g per 20 minuti senza interruzioni. Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) rimarrà sulla superficie di soluzione di Percoll e neutrofili saranno a pellet con globuli rossi.
3. Rimozione di contaminanti RBCs
   1. Preparare 14 mL di soluzione tampone di lavaggio aggiungendo 700 μL PBS + 10% BSA a 14 mL di tampone di lavaggio.
   2. Posizionare il tubo di soluzione di Percoll indietro nella camera anossica. Rimuovere il Percoll e PBMCs via pipettaggio e risospendere le cellule pellettate in 1 mL di soluzione tampone di lavaggio. Il pellet di essere ri-sospensione avrà un colore rosso a causa di contaminanti RBCs.
   3. Aggiungere 200 μL di biglie magnetiche anti-CD235a (glicoforina) alle cellule risospese, mescolare delicatamente e incubare per un minimo di 15 min. Questo passaggio carica il contaminante RBCs con biglie magnetiche in modo che possono essere rimossi.
   4. Lavare la colonna di separazione con 2 mL di lavaggio tampone x 3.
   5. Mentre si tiene una provetta conica da 15 mL sotto la colonna di separazione, pipettare lentamente la miscela di neutrofilo/RBC nella parte superiore della colonna. Raccogliere le cellule nel tubo conico da 15 mL come passano attraverso. Il passaggio dovrebbe essere nuvoloso e perdere il suo colore rosso a causa di RBCs restanti associato alla colonna.
   6. Aggiungere 2 mL di tampone alla parte superiore della colonna di lavaggio e raccogliere nello stesso tubo conico da 15 mL. Entro la fine del lavaggio 2 mL, il flusso continuo dovrebbe essere chiaro, che significa che tutti i neutrofili sono stati raccolti.
   7. Mescolare delicatamente il tubo per garantire una distribuzione omogenea dei neutrofili e raccogliere 10 μL per conta cellulare. Nota il volume finale per scopi di conteggio delle cellule. Enumerare il numero totale di cellule con qualsiasi cella standard metodo di conteggio.
   8. Rimuovere il tubo del neutrofilo dalla camera anossica e centrifugare i neutrofili a 300 x g per 20 min con pause.
   9. Inserire nuovamente i neutrofili sedimentati la camera anossica e rimuovere il tampone di lavaggio tramite il pipettaggio. Risospendere il pellet del neutrofilo nel plasma con una densità massima della cella di 10⁷ PMN/mL.
4. Enumerazione dei neutrofili purificati e visualizzazione utilizzando MUB₄₀
   1. Aggiungere 1 μL di RI-MUB₄₀-Cy5 (1 mg/mL) a 1 mL di mezzo di Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 senza rosso fenolo. Mescolare bene il pipettaggio.
   2. Ai fini del presente protocollo, il risultato è stato delineato come se un potente neutrofilo attivazione reagente, N-formylmethionyl-leucyl-fenilalanina (FMLP), viene aggiunto. Aggiungere 1 μm di FMLP al RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5 tubo e mix tramite pipettaggio su e giù.
      Nota: Ogni procedura sperimentale sarà diverso da questo punto in avanti, a seconda le questioni affrontate.
   3. Trasferire 1 mL RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5/FMLP miscela per un piatto di microscopia di vetro inferiore. Per questo piatto, aggiungere un volume delle cellule purificate, corrispondente a 10⁶ totale neutrofili. Mescolare pipettando delicatamente.
   4. Mettere la teglia in un microscopio invertito a fluorescenza e avviare l'acquisizione di immagini. Ad esempio, si consiglia di acquisire immagini della linea di base prima dell'aggiunta di un reagente d'attivazione dei neutrofili come FMLP o batteri. In questo esempio, avviare l'acquisizione di RPMI/RI-MUB₄₀-Cy5/neutrofili e ad un determinato timepoint successivo, dispensare il reagente d'attivazione dei neutrofili nel piatto di vetro e continuare l'acquisizione di immagini.
      Nota: Le modifiche a queste procedure possono essere fatta base su esigenze scientifiche.
   5. Processo acquisito immagini/time-lapse film come riguarda il microscopio specifico utilizzato.

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Risultati

Risultati di MUB₄₀-tessuti macchiati da diapositive di istopatologia tipicamente rivelano cellule singole sparse in tutto il tessuto. MUB₄₀ macchie lattoferrina, che è presente in granuli neutrofili e compartimenti stagni. Così, in genere visto punctate macchiatura o diverse grandi aree separate del segnale proviene da singoli neutrofili (Figura 1). È utile aggiungere un secondo indicatore di cella come DAPI per aiutare co-localizzano...

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Discussione

Qui, due analisi sono descritti in cui il peptide di₄₀ MUB è usato per studiare l'attivazione e l'infiammazione del neutrofilo. Vi mostriamo come MUB₄₀ può rivelare neutrofili presentano nelle sezioni di istopatologia o mostrano il loro stato di attivazione utilizzando neutrofili purificati dal vivo. I passaggi critici per l'utilizzo di MUB₄₀ come reagente di colorazione sono lo stesso come con qualsiasi altro metodo di rilevazione fluorescente. Cura deve essere presa per assicurare la ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixative for histology
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Used to section tissues
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	Hi precision coverslip
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Stains DNA
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope	Various	Various	Used to image IF slides
Anoxic Cabinet	Various	Various	Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Washing buffer component
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Washing buffer component
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Used to remove contaminating RBCs
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Used for neutrophil assays