Пептид40 MUB для использования в обнаружении нейтрофилов опосредованной воспаление события

Резюме

Здесь мы представляем протокол обнаружить присутствие нейтрофилов в разделах фиксированной/permeabilized гистология и оценить состояние активации живой очищенный нейтрофилов. В частности MUB пептид₄₀ связывает лактоферрина в гранулы нейтрофилов конкретных и высшего. Экспозиции блок содержимого через permeabilization или нейтрофилов активации позволяет для маркировки нейтрофилов.

Аннотация

Здесь мы предоставляем протокол с применением MUB₄₀, синтезированных пептидов с способностью связывать гликозилированного лактоферрин, хранящиеся в высоких концентрациях в конкретных и третичного Гранулы нейтрофилов. Этот протокол детали, как MUB₄₀ конъюгированных непосредственно к Флюорофор может использоваться для пятно нейтрофилов в фиксированной/permeabilized тканей также, как это может использоваться в живой клетки imaging для анализа для активации нейтрофилов и де грануляции. Методы обнаружения нейтрофилов ограничены к поставляемому моноклональные антитела, которые не всегда подходят для определенных приложений. MUB₄₀ не проникают клеточной мембраны и таким образом, исключается из лактоферрин, хранящиеся в не активировано/не permeabilized нейтрофилов. MUB₄₀ имеет добавленное преимущество признания лактоферрина из широкого хозяйского диапазона, что делает его особенно полезны для сравнения результатов исследований с участием нескольких исследований моделей, сократить количество повторяющихся реагентов и упрощения протоколы через единый этапа окрашивания.

Введение

Нейтрофилы являются одним из основных оружия иммунной системы и регулярно привлекаются к местам воспаления вокруг тела. Изучение нейтрофилов была значительной степени снижена путем их короткий срок в пробирке (менее 8 h) и средства ограничены обнаружения базальных условиях или после активации. Здесь мы представляем испытанный протокол для обнаружения широкого и конкретного млекопитающих нейтрофилов в образцах исправлены/permeabilized. Мы также предоставляем подробный протокол для окрашивания живой нейтрофилов с MUB₄₀. Можно pinpointed по протоколу живой нейтрофилов окрашивание, сроков и местоположения нейтрофилов активации. Этот протокол является идеальным для исследователей, которые желают учиться нейтрофилов активации или гранул выпуска. Помимо их антимикробной функций нейтрофилы теперь ценятся как иммуномодулирующих клеток, участвующих в широкий спектр заболеваний и иммунных реакций (врожденная и адаптивного)^1,2. Нейтрофилы присутствуют в наиболее воспалительных тканей, на высоких числах в инфицированных тканях, в воспалительных опухоли³, во время IBS и крона вспышки⁴и в районах неинфекционного воспаления например synovia (ревматоидный артрит Больных РА)⁵. Нейтрофилов содержат четыре класса с именем azurophil (α), специфические (β1), третичные (β2) гранул и секреторные пузырьки (γ)⁶предварительно сформированные гранулы. После миграции воспалительных сайт набранных нейтрофилы активируются и последовательно выделяют содержимое гранул (состоящий из адгезии, антимикробных соединений и иммуномодулирующих молекул), которые способствует дальнейшему вербовки и способствует инфекция резолюции (но и повреждение тканей хост)⁷. В то время как нейтрофилы считаются важным аспектом врожденного иммунитета, на сегодняшний день являются несколько обнаружения реагентов для их изучения, и даже меньше, который может использоваться для оценки состояния активации нейтрофилов жизни.

Нынешние методы обнаружения нейтрофилов полагаться на моноклональные антитела, созданных против клетк поверхности подвергаются антигенов, например Ly - 6 G² или белки, специально хранится в нейтрофильных гранул в базальных условиях (например, миелопероксидаза лактоферрин). Преимущества их сильной привязки, чувствительность и гибкость при различных условиях пробирного моноклональных антител. Однако есть несколько недостатков с помощью моноклональных антител и анти Ly - 6G в частности. Эти недостатки включают специфику, как Ly - 6G присутствует на большинстве миелоидных клеток в костном мозге и на всех гранулоцитов, включая эозинофилов; Таким образом расшифровка нейтрофилов из эозинофилов с этот маркер требует более комплексы подходов к⁸. Другой частой компромисс с моноклональными антителами — их часто ограниченный узел специфика хребет, затрудняет сравнение исследований с более чем одной видов животных. Третий недостаток методы обнаружения антител, особенно при использовании живой клетки или в естественных условиях, является их потенциал нарушить функцию клеток или привести к активации клеток. Например администрация анти Ly - 6G для мышей обычно применяется для нейтрофилов истощения и переходных нейтропении⁹. Дополнительно было продемонстрировано, что инъекции антител может стимулировать нейтрофилов противоопухолевые функции¹⁰. Наконец обнаружение антител нейтрофилов не показывают состояние активации клеток.

Мы определили 40-амино кислоты пептид, под названием MUB₄₀, который может использоваться в ряде анализов ярлык нейтрофилов в условиях in vitro или в естественных условиях , а также анализа состояния активации живой нейтрофилов¹¹. MUB₄₀ является производным от MUB₇₀¹², домен Lactobacillus reuteri поверхности слизь связывающий белок, первоначально описанных за его способность связывать слизи^13,14. MUB₄₀ взаимодействует с гликозилированного лактоферрин, который присутствует в высоких концентрациях в гранулы нейтрофилов конкретных и высшего. MUB₄₀ могут быть подвержены эти гранулы через стандартный permeabilization шаги в гистопатологии или активирована флуоресценции клеток, сортировка (FACS) протоколы для надежной пятнать фиксированной нейтрофилов. Когда живой нейтрофилов хранятся в состоянии инактивированная, пептид₄₀ MUB исключается из содержимое гранул, и клетки не испачкать положительных с маркером. После активации MUB₄₀ можно привязать к воздействию лактоферрин и привести к надежной окрашивание с пептида. Таким образом MUB₄₀ может использоваться для определения состояния активации очищенный нейтрофилов, что делает его привлекательным маркер следовать инфекционного процесса. Возможность привязать жить активированные нейтрофилы также позволяет MUB₄₀ , чтобы использоваться в качестве инструмента для выявления областей нейтрофилов воспаления в живых животных моделях (например, мыши артрит модель¹⁵). Протоколы в этой рукописи детали как дневно помечены MUB₄₀ может использоваться раскрыть нейтрофилов в Гистология ткани и как assay активации живой очищенный нейтрофилов в пробирке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы, описанные здесь были проанализированы и одобрены французских организаций веймутовой (Comité de исследований Clinique), CPP (Comité de защиты des Personnes) и CNIL (Комиссии Nationale Informatique et Liberté).

1. Окрашивание дневно нейтрофилов в гистопатологии ткани с маркировкой MUB₄₀

1. Для получения ткани для гистопатология, исправьте разделов ткани/биопсии в соразмерную громкость параформальдегида 4% (PFA) за 30 мин до 4 ч в зависимости от толщины образца. Поместите образцы в холодильнике 4 ° C во время фиксации.
   Примечание: Альтернативные фиксации методы/тайминги можно заменить основаны на уникальных потребностей пользователя.
   1. Удаление PFA, добавить 16% раствор сахарозы с достаточным объемом для полностью покрывают образца и поместите образец в 4 ° C на 4 ч до ночлега.
   2. Удаление 16% раствор сахарозы и добавить 30% раствора сахарозы на достаточно большой объем, чтобы полностью покрыть образца и поместите его на 4 ° C на 4 ч до ночлега.
   3. Удаление 30% раствор сахарозы и пятно от избыточного решения из ткани с бумажным полотенцем. Место в разделе ткани в СМИ оптимального раскроя температуры (OCT) и оснастки замораживание в 2-methylbutane охлаждением в ванне с сухим льдом этанол (-72 ° C). После замерзла (после ~ 2 мин), удалите блоки из 2-methylbutane и разместите их на сухой лед, пока все блоки закончена и готова для длительного хранения. Хранение замороженных блоков на-80 ° C для длительного хранения.
2. В ночь перед блоков ткани должны быть вырезать, удалить их из морозильной камеры-80 ° C и разместить их на 20 ° C ночь до сбалансировать.
   1. С помощью криостат, нарезать 10 - 30 мкм толстые ломтики OCT-врезанных тканей и абсорбируются высококачественных стеклянных скольжениях.
      Примечание: Толще или тоньше фрагментов может использоваться экспериментальные зависимости.
   2. С ручкой воска или других гидрофобные метода нарисуйте прямоугольник вокруг кусочек ткани на слайде стекло и высушить.
   3. Подготовить окрашивание решение, выполнив разведения 1:1,000 MUB₄₀-Cy5 (или другой флуоресцентный MUB₄₀версии, Стоковый раствор 1 мг/мл) в 0,1% раствора сапонина PBS. Оптимальная концентрация окончательный MUB₄₀ должно быть 1 мкг/мл.
      Примечание: Нижняя окончательный концентрации могут быть использованы (0.1-0,01 мкг/мл), но может привести к снижению интенсивности сигнала.
      Предупреждение: Сапонин порошок может вызвать раздражение дыхание. Убедитесь, что весят сапонин в кабинет или защищенной области. Permeabilization альтернативные методы могут использоваться как Тритон. Добавить дополнительные маркеры в концентрациях, рекомендованный изготовителем (например., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), Фаллоидин, флуоресцентные антитела).
   4. Аккуратно опустите стеклянное скольжение в раствор 0,1% сапонины PBS три раза.
   5. Тщательно пятно от лишней жидкости вокруг секции ткани и добавить достаточно окрашивание решение полностью покрывают ткани секции. Поместите слайд в камере влажности, чтобы избежать испарения и проинкубируйте 1 ч при комнатной температуре. Держите его от света.
   6. Аккуратно погрузите слайд в 0,1% раствора сапонина PBS 3 x. Затем, аккуратно погрузите слайд в PBS решение 3 x. Наконец, мягко погрузите слайд в дистиллированной H₂O 3 x. Тщательно высушите избыток жидкости от слайда.
   7. Добавить небольшое количество (~ 20 мкл) монтажа средних (20 мм трис рН 8,0, 0,5% Н-пропиловый галлат, 90% глицерина) рядом с кусок ткани и аккуратно сложить стекла coverslip поверх стеклянное скольжение. Аккуратно и равномерно насадить coverslip на разделе ткани и, используя бумажным полотенцем, осторожно извлеките носитель монтажа, вытяжки по краям coverslip.
   8. Место слайдов в темный шкаф для 24 h разрешить СМИ монтажа закрепить. Кроме того место слайдов при 37 ° C в течение 1 ч.
3. Изображения срезов ткани на флуоресцентный Микроскоп согласно методу желаемого приобретения.

2. Визуализация нейтрофилов активации с ретро Inverso-MUB₄₀-Cy5 пептида

1. Получение нейтрофилов человека, используя следующий протокол. Подготовить следующие решения и поместите их в ночевкой аноксии кабинета. Воздействия кислорода начнут активировать нейтрофилов и далее побуждать клетки смерти^16,17.
   Примечание: Нейтрофилов может альтернативно очиститься «на стенде» MUB₄₀-маркировки экспериментов; Однако имейте в виду, что воздействия кислорода начнет влиять на активацию нейтрофилов.
   1. Подготовьте следующее решение:
      Решение 1 [0,9% хлорида натрия (NaCl)]: добавить 4,5 г NaCl в 500 мл H₂O. фильтр решение.
      Решение 2 (6% декстрана): добавить 6 g декстрана в растворе 0,9% NaCl в 100 мл.
      Решение 3 (Отмывающий буфер): растворить Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS pH 7,2 до конечной концентрации ЭДТА 2 мм. Непосредственно перед использованием Растворите бычьим сывороточным альбумином (БСА) в растворе PBS/ЭДТА, что конечная концентрация BSA 10% w/v.
   2. Центрифуга пробирки на 650 x g 20 минут без перерыва.
   3. Не нарушая разлученных крови, передать аноксии кабинета и сбор плазмы фракций (сверху) в 50 мл Конические трубки трубки для сбора крови.
   4. Снять трубку плазмы содержащих из анаэробной кабинета и центрифуги на 2900 x g 20 минут с перерывами в гранулы тромбоцитов.
   5. Не нарушая гранулированных тромбоцитов, аккуратно передача плазмы трубку обратно в аноксии кабинета и пипетки тромбоцитов бедных плазмы в свежий 50 мл трубки (в дальнейшем именуется «плазмы»).
2. Разделение красных кровяных клеток из лейкоцитов
   1. С помощью пробирки, содержащие красные кровяные клетки (эритроциты) из шага 2.1.3., объединить эритроцитов в конической 50 мл трубки (5 крови трубки содержимое коллекции за Тюбик 50 мл).
   2. Добавьте NaCl 0,9%, до тех пор, пока общий объем достигает 44 мл. Добавьте 6 мл 6% декстрана (последний).
   3. Осторожно Смешайте смесь крови/декстрана, инвертирование трубки 10 - 20 раз. Пусть отложений трубки для по крайней мере 30 мин.
   4. В то время как происходит осаждение, подготовить Percoll градиент, добавив 4.2 мл Percoll раствора до 5,8 мл плазмы в 15 мл Конические трубки и перемешать хорошо, инвертирование трубки.
   5. Соберите верхняя часть декстран при попытке избежать дозирования красных кровяных клеток.
   6. Затяните резьбовую крышку, извлеките трубку декстрана из анаэробной камеры и центрифуги трубки на 300 g x 10 минут с перерывами.
   7. Тщательно место трубку обратно в зале аноксии не нарушая гранулированных клетки и удаление жидкости через закупорить.
   8. Аккуратно вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл плазмы и очень медленно, добавить в верхней части Percoll решения. Будьте осторожны, чтобы не вызвать смешивание слоев при закупорить клетки на вершине.
   9. Осторожно удалите трубки Percoll решения из анаэробной камеры (избегая смешивания) и центрифуги на 800 x g 20 минут без перерыва. Мононуклеаров периферической крови (получения) останется на поверхности раствора Percoll, и будет гранулах нейтрофилов с БС.
3. Удаление загрязняющих эритроцитов
   1. Подготовка 14 мл моющего раствора буфера путем добавления 700 мкл PBS + 10% BSA 14 мл отмывающего буфера.
   2. Место Percoll решение трубки обратно в зале аноксии. Удалить Percoll и репликацию через закупорить и вновь приостановить гранулированных клеток в 1 мл моющего раствора буфера. Пелле быть вновь приостановлено будет иметь красный цвет из-за загрязнения эритроцитов.
   3. Добавить 200 мкл магнитные бусы анти CD235a (Гликофорины) повторно подвесной клетки, осторожно перемешать и инкубировать в течение как минимум 15 мин. Этот шаг загружает загрязняющих эритроцитов с магнитной бусины, так что они могут быть удалены.
   4. Мыть разделения столбцов с 2 мл промывки буфер 3 x.
   5. Во время проведения 15 мл конические пробки в столбце разделения, медленно Пипетка нейтрофилов/RBC смесь в верхней части столбца. Соберите клетки в 15 мл Конические трубки, как они проходят через. Поток через должны быть мутной и потерять свой красный цвет из-за RBCs, оставаясь привязанным к столбцу.
   6. Добавить 2 мл отмывающего буфера в верхней части столбца и собирать в же 15 мл Конические трубки. К концу 2 мл мыть потока через должно быть ясно, означающий, что были собраны все нейтрофилы.
   7. Аккуратно перемешайте трубки для обеспечения равномерного распределения нейтрофилов и собирать 10 мкл для подсчета клеток. Обратите внимание, окончательный объем ячейки, считая целей. Перечислите общее количество клеток с любой стандартной ячейки, подсчитывая метод.
   8. Удаление нейтрофилов трубки из анаэробной камеры и центрифуги нейтрофилов в 300 x g 20 минут с перерывами.
   9. Место отложившейся нейтрофилов обратно в анаэробных камеру и удалите Отмывающий буфер через закупорить. Вновь приостановить нейтрофильных гранул в плазме с максимальной клеток плотность 10⁷ ПМН/мл.
4. Перечисление очищенный нейтрофилов и визуализация с помощью MUB₄₀
   1. Добавить 1 мкл ри-MUB₄₀-Cy5 (1 мг/мл) в 1 мл Розуэллом парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 среды без фенола красного. Смешайте хорошо закупорить.
   2. Для целей настоящего Протокола результат был разработан как если бы мощным нейтрофилов, Активация реагентов, N-formylmethionyl лейцил фенилаланин (FMLP), добавляется. Добавить 1 мкм FMLP RPMI/ри-MUB₄₀-Cy5 трубки и смеси через закупорить вверх и вниз.
      Примечание: Каждая экспериментальная процедура будет отличаться от этой точки вперед, в зависимости от рассматриваемых вопросов.
   3. Передача 1 мл RPMI/ри-MUB₄₀-Cy5/FMLP смесь для микроскопии блюдо дно стекла. К этому блюду добавьте объем очищенной клеток соответствует 10⁶ всего нейтрофилов. Смешайте нежно закупорить.
   4. Поместите блюдо в Перевернутый флуоресцентный микроскоп и начать получение изображения. Например рекомендуется приобрести исходных изображений до добавления реагента, активация нейтрофилов, например FMLP или бактерий. В этом примере, начать приобретение RPMI/ри-MUB₄₀-Cy5/нейтрофилов и в более поздних timepoint, Пипетка активация нейтрофилов реагента в стеклянную посуду и продолжить получение изображения.
      Примечание: Эти шаги могут быть внесены изменения на основе научных потребностей.
   5. Процесс приобрел изображения/времени-покадровой фильмов, которые касаются конкретных Микроскоп используется.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Результаты MUB₄₀-окрашенных тканей от гистопатология слайды обычно показывают отдельные клетки, разбросанных по всей ткани. MUB₄₀ пятна лактоферрин, который присутствует в нейтрофильных гранул и разобщенным. Таким образом обычно видели пунктата пятнать или н?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь двух анализов описаны, в котором MUB пептид₄₀ используется для изучения нейтрофилов воспаление и активации. Мы покажем, как можно выявить MUB₄₀ нейтрофилов присутствует в гистопатологии секций или показать их состояние активации с использованием живой очищенный нейтрофи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixative for histology
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Used to section tissues
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	Hi precision coverslip
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Stains DNA
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope	Various	Various	Used to image IF slides
Anoxic Cabinet	Various	Various	Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Washing buffer component
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Washing buffer component
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Used to remove contaminating RBCs
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Used for neutrophil assays