MUB40 peptid nötrofil aracılıklı iltihaplanma olayları algılama kullanmak için

Özet

Burada, sabit/permeabilized Histoloji bölümlerde nötrofil var olup olmadığını belirlemek ve canlı arıtılmış nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için bir protokol mevcut. Özellikle, MUB₄₀ peptid laktoferrin nötrofil özgü ve Tersiyer granül mevcut bağlar. Pozlama permeabilization veya nötrofil harekete geçirmek granül İçindekiler nötrofil işaretleme için sağlar.

Özet

Burada, biz MUB₄₀, yüksek konsantrasyonlarda nötrofil özel ve Tersiyer granül depolanan glikozile laktoferrin bağlama yeteneği ile sentezlenmiş bir peptid kullanımını içeren bir protokol sağlar. Nasıl Birleşik MUB₄₀ doğrudan bir fluorophore için bu protokolü ayrıntıları bu canlı hücre Imaging'de nötrofil etkinleştirme ve de-granülasyon için tahlil için kullanılabilir ne kadar sabit/permeabilized dokularda de nötrofiller leke için kullanılabilir. Nötrofil algılama yöntemleri her zaman bazı uygulamalar için uygun değildir species-specific monoklonal antikorlar sınırlı olmalıdır. MUB₄₀ hücre zarı nüfuz etmez ve böylece sigara-aktif/sigara-permeabilized nötrofil içinde depolanan laktoferrin üzerinden söz konusu değildir. MUB₄₀ tane laktoferrin geniş ana bilgisayar aralığından, özellikle birden fazla araştırma modeli, ilgili çalışmalarda sonuçları karşılaştırmak için faydalı hale tanıma yararı yinelenen reaktifler sayısını azaltarak ve protokolleri kolaylaştırarak tek adım boyama yoluyla.

Giriş

Nötrofil bir doğuştan gelen bağışıklık sisteminin birincil silah ve rutin olarak inflamasyon vücut etrafında siteler için işe. Nötrofil çalışma büyük ölçüde bozulmuş onların kısa ömrü vitro (az 8 h) ve sınırlı algılama araçları bazal koşullar altında veya aktivasyon sonra olmuştur. Burada, sabit/permeabilized örneklerinde memeli nötrofil geniş ve belirli algılanması için iyi sınanmış bir protokol mevcut. Ayrıca canlı nötrofil MUB₄₀ile boyama için detaylı bir protokol sağlar. Canlı nötrofil boyama iletişim kuralını kullanarak, zamanlama ve nötrofil harekete geçirmek konumunu kesin olarak belirlemiş. Bu iletişim kuralı nötrofil harekete geçirmek ya da granül yayın eğitim almak isteyen araştırmacılar için idealdir. Antimikrobiyal işlevlerini, nötrofil şimdi immunomodulatory hücreler çeşitli hastalıklar ve immün yanıt (doğuştan gelen ve edinilmiş)^1,2yer olarak takdir edilmektedir. Nötrofil yüksek numaralarından enfekte dokularda, inflamatuar tümörler³, IBS ve Crohn flare-up⁴sırasında ve romatoid artrit (synovia gibi bulaşıcı olmayan iltihap alanlarında en inflamatuar doku mevcut RA) hastalar⁵. Nötrofil önceden biçimlendirilmiş granül azurophil (α), özel (β1), Tersiyer (B2) granülleri ve salgı veziküller (γ)⁶adlı dört sınıfları içerir. Geçiş inflamatuar sitesine üzerine işe nötrofil aktif hale ve sırayla granül içeriği daha fazla istihdamı teşvik ve katkıda bulunur (yapışma, antimikrobiyal bileşikleri ve immunomodulatory molekülleri oluşan), salgılar enfeksiyon çözünürlük (aynı zamanda için ana bilgisayar doku hasarı)⁷. Nötrofil olarak kabul edilir süre önemli bir özelliği, orada bugüne kadar doğuştan gelen bağışıklık kaç algılama reaktifler onlara eğitim kullanılabilir, ve hatta daha az bu yaşam nötrofil etkinleştirme durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.

Monoklonal antikor Ly - 6 G² veya özel olarak nötrofil granül bazal koşullar (Örneğin, myeloperoxidase altında depolanan proteinler gibi hücre yüzeyine maruz antijenlere karşı oluşturulan nötrofil tespit geçerli yöntemleri itimat Laktoferrin). Onların güçlü bağlama, ışık hassasiyeti ve çeşitli tahlil koşullarda çok yönlülük monoklonal antikorlar avantajları şunlardır. Ancak, özellikle kullanarak monoklonal antikorlar ve anti-Ly - 6 G birçok downsides vardır. Ly - 6 G mevcut myeloid hücrelerin bir çoğunluğu kemik iliği ve Eozinofiller de dahil olmak üzere tüm granülosit olduğu gibi bu downsides özgüllüğü, içerir; Böylece, nötrofil eozinofil üzerinden bu marker ile deşifre daha fazla kompleksleri yaklaşımlar⁸gerektirir. Başka bir sık tradeoff monoklonal antikorlar ile birden fazla hayvan türleri ile karşılaştırma çalışmaları zorlaştırıyor onların kez sınırlı ana özgüllük, aralıktır. Üçüncü ise bir antikor algılama yöntemleri özellikle canlı hücreleri veya içinde vivo kullanırken, hücre işlevi bozabilir veya hücre aktivasyonu için kurşun potansiyellerini dezavantajıdır. Örneğin, yönetim, anti-Ly - 6G farelere yaygın nötrofil tükenmesi ve geçici nötropeni⁹uygulanır. Ayrıca antikor enjeksiyon nötrofil antitümör işlev¹⁰teşvik edebilir kanıtlanmıştır. Son olarak, antikor algılama nötrofil hücre etkinleştirme durumunu ortaya koymuyor.

Biz 40-amino asit peptid MUB₄₀deneyleri bir sayısını nötrofil vitro ve in vivo koşulları altında etiket gibi canlı nötrofil¹¹etkinleştirme durumunu tahlil için kullanılabilir, denilen belirledik. MUB₄₀ MUB₇₀¹², aslında onun yetenek mukus^13,14bağlamak için açıklanan Lactobacillus reuteri yüzey mukus-bağlayıcı proteinin bir etki elde edilir. MUB₄₀ nötrofil özgü ve Tersiyer granül yüksek konsantrasyonlarda bulunur glikozile Laktoferrin ile etkileşim kurar. MUB₄₀ histopatoloji veya floresan aktif hücre sağlam sabit nötrofil boyama için (FACS) iletişim kuralları sıralama mevcut standart permeabilization adımlarda bu tanecikler için gösterilebilir. Canlı nötrofil Inaktif bir durumda tutulur MUB₄₀ peptid granül içeriğinden söz konusu değildir ve hücreleri marker ile pozitif leke değil. Harekete geçirmek MUB₄₀ maruz laktoferrin bağlamak ve sağlam ile peptid boyama için yol. Böylece, MUB₄₀ arıtılmış nötrofil, yapım o bulaşıcı süreci takip etmek çekici bir işaretleyici etkinleştirme durumunu belirlemek için kullanılabilir. Aktif nötrofil yaşamak için bağlama yeteneği aynı zamanda canlı hayvan modellerinde (Örneğin, bir fare artrit modeli¹⁵) nötrofil iltihap alanları tespit etmek için bir araç olarak kullanılacak MUB₄₀ sağlar. Bu el yazması ayrıntılı nasıl fluorescently MUB₄₀ etiketli iletişim kuralları nötrofil Histoloji doku ve nasıl canlı arıtılmış nötrofil vitroaktivasyonu tahlil ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada gözden geçirilmiş ve onaylanmış Fransız kuruluşlarca CoRC (Comite de Recherche Clinique), CPP (Comite de koruma des Personnes) ve CNIL (komisyon Nationale Informatique et Liberté).

1. Fluorescently nötrofil histopatoloji doku ile boyama MUB₄₀ etiketli

1. Histopatoloji için doku elde etmek için en fazla 4 h örnek kalınlığına bağlı olarak doku/biyopsisi bölümleri % 4 paraformaldehyde (PFA) 30 dk için uygun bir birimdeki düzeltmek. Örnekleri fiksasyon sırasında 4 ° C buzdolabında yerleştirin.
   Not: Alternatif fiksasyon yöntemleri/zamanlamaları kullanıcının benzersiz ihtiyaçlarına göre yedek olabilir.
   1. PFA kaldırmak ve örnek 4 gece kadar s için 4 ° C'de yer % 16 sükroz çözüm örnek tamamen karşılamak için yeterli hacim ile ekleyin.
   2. % 16 sükroz çözüm çıkarın ve % 30 sükroz çözüm örnek tamamen kapsayacak kadar geniş bir ses seviyesinde ekleyin ve 4 gece kadar s için 4 ° C'de yerleştirin.
   3. % 30 sükroz çözümü kaldırmak ve doku kağıt havlu ile fazla çözümden kapalı leke. Doku bölümü en iyi kesim ısı (OCT) medya yerleştirin ve 2-methylbutane bir kuru buz-etanol banyosunda (-72 ° C) soğutmalı içinde ek-kıpırdama. (~ 2 dakika sonra) donmuş bir kez, 2-methylbutane blokları kaldırmak ve tüm blokları bittiğinde ve uzun süreli depolama için hazır olana kuru buza koyun. Uzun süreli depolama için-80 ° C'de donmuş blok saklayın.
2. Kes,-80 ° C dondurucudan çıkarıp ve-20 ° equilibrate için C bir gecede yer onları doku taşlarıdır önceki gece.
   1. Bir cryostat kullanarak, OCT gömülü doku 10 - 30 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin ve yüksek kaliteli cam slaytlara absorbe.
      Not: Kalın veya ince dilimleri deneysel gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir.
   2. Bir balmumu kalem veya diğer hidrofobik yöntemi, cam slayt üzerinde doku dilim çevresinde bir kutu çizin ve kurumaya bırakın.
   3. 1:1,000 seyreltme MUB₄₀gerçekleştirerek boyama çözüm hazırlamak-Cy5 (ya da Diğer Floresan MUB₄₀yorum, hisse senedi 1 mg/mL solüsyon) % 0,1 saponin PBS çözümde. En iyi son MUB₄₀ konsantrasyon 1 μg/mL olması gerekir.
      Not: Son düşük konsantrasyonlarda kullanılabilir (0,1-0,01 μg/mL) ama sinyal yoğunluğu azaltmak için neden olabilir.
      Dikkat: Saponin toz nefes tahrişe neden olabilir. Bir kabin veya korumalı alanda saponin tartmak emin olun. Alternatif permeabilization yöntemleri Triton gibi kullanılabilir. Üretici tarafından önerilen konsantrasyonları ek işaretleyicileri ekleyin (Örn., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phalloidin, floresan antikor).
   4. Yavaşça % 0,1 saponin-PBS çözeltisi içine cam slayt üç kez daldırma.
   5. Dikkatle doku bölüm etrafında uzak aşırı sıvı leke ve tamamen doku bölümü kapsayacak şekilde boyama yeterli çözüm ekleyin. Slayt buharlaşma önlemek ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya nem odası içine koyun. Işıktan korunan devam et.
   6. Yavaşça slayt % 0,1 saponin PBS çözüm 3 içine daldırma x. Sonra yavaşça slayt PBS çözüm 3 içine daldırma x. Son olarak, yavaşça daldırma distile H₂O slayta 3 x. Dikkatli bir şekilde aşırı sıvı slayt kuru.
   7. Montaj Orta (20 mM Tris pH 8.0, % 0.5 N-propil gallat, % 90 gliserol) doku dilim yanındaki küçük bir miktar (~ 20 μL) ekleyin ve hafifçe aşağı bir cam coverslip cam slayt üstünde yatıyordu. Yavaşça ve eşit coverslip doku bölümü basın ve bir kağıt havlu kullanarak, dikkatle coverslip kenarları dışarı herhangi bir montaj medyayı çıkarın.
   8. Bağlı slayt kuvvetlendirmek montaj medya izin vermek 24 h için karanlık bir kabine yerleştirin. Alternatif olarak, bağlı slayt 37 ° C için 1 h yerleştirin.
3. İstenen edinme yöntemine göre floresan mikroskop doku dilimleri görüntü.

2. görsel olarak nötrofil harekete geçirmek ile Retro-Inverso-MUB₄₀-Cy5 peptid

1. İnsan nötrofil aşağıdaki iletişim kuralı kullanılarak elde edilir. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak ve anoksik kabine gece kalmak koyun. Oksijen maruz nötrofil etkinleştirmek ve daha fazla hücre ölüm^16,17teşvik etmeye başlayacaktır.
   Not: Nötrofiller alternatif olarak "tezgah" MUB₄₀için saf-deneyler; etiketleme Ancak, oksijen pozlama nötrofil harekete geçirmek etkilemeye başlar unutmayın.
   1. Ertesi gün eriyik hazırlayın:
      Eriyik 1 [% 0,9 sodyum klorür (NaCl)]: H₂O. filtre çözümü 500 mL NaCl 4,5 g ekleyin.
      Çözüm 2 (dextran % 6): 6 g dextran için 100 mL NaCl %0.9 çözümde ekleyin.
      Çözüm 3 (çamaşır arabellek): bir son 2 mM EDTA konsantrasyon için PBS pH 7.2 ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) geçiyoruz. Öyle ki son BSA konsantrasyonu % 10 w/v kullanımdan hemen önce Sığır serum albumin (BSA) PBS/EDTA çözümde geçiyoruz.
   2. 650 x g 20 dk olmadan tatili için de kan toplama tüpler santrifüj kapasitesi.
   3. Ayrılmış kan aksatmadan, kan toplama tüpler 50 mL konik tüp içinde bir anoksik kabine ve toplamak plazma kesirler (üst) aktarın.
   4. Plazma içeren tüp anoksik kabine ve trombosit cips sonlarıyla 20 dk santrifüj 2,900 x g de kaldırın.
   5. Pelleted trombosit aksatmadan, yavaşça plazma tüp anoksik kabine ve damlalıklı trombosit zavallı plazma (bundan sonra "plazma" olarak da adlandırılır) bir taze 50 mL tüp içine içine geri aktarın.
2. Kırmızı kan hücrelerinin ayrılması lökosit
   1. 2.1.3. adımdaki kırmızı kan hücreleri (RBCs) içeren borular kullanarak., konik 50 mL tüp (5 kan toplama tüp içeriği 50 mL tüp başına) içine RBCs birleştirmek.
   2. Toplam hacim 44 mL ulaşıncaya kadar % 0,9 NaCl ekleyin. 6 mL dextran %6 (son) ekleyin.
   3. 10 - 20 kez tüp ters çevirme tarafından kan/dextran karışımı karışımı yavaşça. Tüp tortu için en az 30 dakika izin ver.
   4. Sedimantasyon meydana gelen ise 15 mL konik tüp plazmada 5.8 mL 4,2 mL Percoll çözeltisi eklenerek Percoll degrade hazırlamak ve de tüp ters çevirme tarafından karıştırın.
   5. Dextran üst kısmını pipetting kırmızı kan hücreleri önlemek çalışırken toplamak.
   6. Vidalı kapak sıkın, anoksik odasından dextran tüpü çıkarması ve 300 x g sonlu 10 dk de tüp santrifüj kapasitesi.
   7. Dikkatle pelleted hücreleri bozmadan anoksik odasına tüpü yerleştirin ve pipetting yolu ile sıvı kaldırın.
   8. Yavaşça hücre Pelet yeniden 1 mL plazma askıya alma ve çok yavaş Percoll çözüm en üstüne ekleyin. Hücrelerin üstüne pipetting zaman katmanları karıştırma teşvik değil dikkatli olun.
   9. Dikkatle Percoll çözüm tüp anoksik odası (karıştırma kaçınarak) ve 800 x g, santrifüj sonları olmadan 20 dk için kaldırın. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) Percoll çözüm yüzeyde kalır ve nötrofil RBCs ile cips.
3. RBCs kirletici kaldırma
   1. Arabellek çözüm 700 μL PBS + % 10 BSA arabellek yıkama 14 mL için ekleyerek yıkama 14 mL hazırlayın.
   2. Percoll çözüm tüp anoksik odasına koyun. Percoll ve PBMCs pipetting üzerinden kaldırmak ve arabellek Çözüm yıkama 1 mL pelleted hücreleri yeniden askıya alma. Pelet yeniden askıya olmak bulaşıcı RBCs nedeniyle kırmızı bir renk olacak.
   3. Anti-CD235a (glycophorin) manyetik boncuklar 200 μL yeniden askıya alınmış hücrelere ekleme, karışımı yavaşça ve en az 15 dk için kuluçkaya. Böylece onlar-ebilmek var olmak çıkarmak bu adım manyetik boncuklar ile bulaşıcı RBCs yükler.
   4. Yıkama yıkama 2 mL ayrılık sütunla tampon 3 x.
   5. 15 mL konik tüp ayrılık sütununun altında tutarak, sütunun üst nötrofil/RBC karışıma yavaş yavaş pipette. Onlar akışı olarak 15 mL konik tüp hücrelerde toplamak. Akış ile bulutlu olmalı ve kırmızı rengini sütuna bağlı kalan RBCs nedeniyle kaybetmek.
   6. Arabellek sütunun üst için yıkama 2 mL ekleyin ve aynı 15 mL konik tüp toplamak. 2 mL yıkama yılı sonuna kadar akışı aracılığıyla tüm nötrofil toplanmıştır belirten açık olmalıdır.
   7. Nötrofil eşit dağılımı sağlamak ve hücre sayımı için 10 μL toplamak için tüp karışımı yavaşça. Amacıyla sayım hücre için son hacim unutmayın. Standart herhangi bir hücreyi sayma yöntemi ile toplam sayısı numaralandırır.
   8. Nötrofil tüp anoksik odasından kaldırın ve 300 x g sonları ile 20 dk için de nötrofiller santrifüj kapasitesi.
   9. Posalı nötrofil anoksik odanın içine yerleştirin ve pipetting yolu ile çamaşır arabellek kaldırın. Nötrofil Pelet plazma 10 en fazla hücre yoğunluğu ile yeniden askıya⁷ PMN/mL.
4. Numaralandırma arıtılmış nötrofil ve MUB₄₀ kullanarak görselleştirme
   1. RI-MUB₄₀1 μL eklemek-Cy5 (1 mg/mL) 1 ml Rosewell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta fenol red olmadan. De pipetting tarafından karıştırın.
   2. Sanki reaktif aktive güçlü bir nötrofil N-formylmethionyl-leucyl-Fenilalanin (FMLP), eklenir bu iletişim kuralının amacı gereği, sonucu açıklanan olmuştur. FMLP 1 mikron RPMI/RI-MUB₄₀' a Ekle-Cy5 tüp ve pipetting ile karışımı yukarı ve aşağı.
      Not: Her deneysel işlemin ele alınmaktadır sorular bağlı olarak bu noktadan sonra farklı olacaktır.
   3. 1 mL RPMI/RI-MUB₄₀transfer-Cy5/FMLP karışımı bir cam alt mikroskobu yemek için. Bu yemek için saflaştırılmış hücre 10⁶ toplam nötrofiller için karşılık gelen bir birim eklemek. Pipetting tarafından hafifçe karıştırın.
   4. Çanak ters bir Floresan Mikroskobu yerleştirin ve resim alma başlatın. Örneğin, bu temel görüntüleri önce nötrofil aktive reaktif FMLP veya bakteri gibi eklenmesi önerilir. Bu örnekte, RPMI/RI-MUB₄₀edinimi başlatmak-Cy5/nötrofil ve bir sonraki timepoint, nötrofil aktive reaktif cam tabak içine pipette ve resim alma devam.
      Not: Aşağıdaki adımları için değişiklik bilimsel ihtiyaçlarına göre yapılabilir.
   5. Süreç olarak kullanılan belirli mikroskop ile ilgilidir görüntüleri/zaman-lapse film satın aldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Sonuçları MUB₄₀-histopatoloji slaytlardan lekeli dokular genellikle tek tek hücreleri doku dağınık ortaya. MUB₄₀ lactoferrin, nötrofil granül bulunması ve bölümlere olan leke bırakır. Böylece, tipik olarak görülen punctate boyama veya sinyal çeşitli büyük ayrılmış alanlarda bireysel nötrofil (Şekil 1) geliyor. DAPI MUB₄₀ sinyal lekeli hücre ile birlikte yerelleştirilmesine yardımcı gibi ikinci bir ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, iki deneyleri MUB₄₀ peptid nötrofil inflamasyon ve harekete geçirmek için kullanılan açıklanır. Biz nasıl MUB₄₀ nötrofil histopatoloji bölümlerde ya da canlı arıtılmış nötrofil kullanarak onların harekete geçirmek durum göstermek-ebilmek açığa vurmak göstermek. MUB₄₀ boyama reaktifi kullanmak için kritik adımlar olarak başka bir floresan algılama yöntemi ile aynıdır. Floresan sinyallerin ve güncelliği ve yeterli çamaşır adımlar arka plan boyama...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Fluorescent MUB40 peptide (available with other conjugated fluorophores)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Retro-inverso fluorescent MUB40 peptide. Synthesized with D-amino acids and resistant to proteases (available with other conjugated fluorophores)
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixative for histology
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution used to remove excess PFA
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Used to freeze tissue before cryostat sectioning
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Used for dry ice bath to freeze tissue
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Used to section tissues
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	Hi precision coverslip
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Used to prevent liquid loss during tissue staining
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Used to permeabilize cells for IF staining
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Stains DNA
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	Binds actin
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolongs IF signal and resistance to photobleaching
Fluorescent microscope	Various	Various	Used to image IF slides
Anoxic Cabinet	Various	Various	Used for the purification of live inactivated neutrophils
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Washing buffer component
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	Washing buffer component
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient for neutrophil purification
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	Used to remove contaminating RBCs
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Used in the removal of RBCs from neutrophils
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	Used for neutrophil assays