JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור העיבוד של קידוד (mRNA) האופטימיזציות גלובין (ncRNA) ללא קידוד RNA-seq ספריות של דגימת דם כל יחיד.

Abstract

כניסתו של יותר ויותר חזקים וחדשניים הבא הדור רצף טכניקות פתחה דרכים חדשות היכולת לבחון בביטוי הגן הבסיסי הקשור תהליכים ביולוגיים של עניין. חידושים אלה מאפשרים לא רק חוקרים לבחון ביטוי מ רצפי mRNA זה הקוד של הגנים את תפקוד התאים השפעה, אך גם מולקולות RNA (ncRNA) ללא קידוד שנותרו לא מתורגם, אבל עדיין יש פונקציות רגולטוריות. למרות חוקרים יש את היכולת להתבונן ביטוי mRNA והן ncRNA, זה כבר מקובל מחקר להתמקד אחת או אחרת. עם זאת, כאשר מחקרים מעוניינים בביטוי mRNA והן ncRNA, פעמים רבות הם משתמשים דגימות נפרד לבחון קידוד או ללא קידוד RNAs לאור ההבדל בהכנות ספריה. זה יכול להוביל הצורך לקבלת דוגמאות נוספות, אשר יכול להגביר הזמן, מתכלים, והלחץ בעלי חיים. בנוסף, הוא עלול לגרום חוקרים להחליט להכין דגימות לבדיקה אחת בלבד, בדרך כלל mRNA, הגבלת מספר שאלות ביולוגי יכול ייחקרו. עם זאת, ncRNAs להקיף כמה מחלקות רגולטוריות תפקידים עם הביטוי הזה mRNA אפקט. כי ncRNA חשובים היסוד תהליכים ביולוגיים, הפרעה של תהליכים אלה ב במהלך זיהום, הם עשויים, לכן, לבצע יעדים אטרקטיביים עבור הרפוי. כתב יד זה מדגים פרוטוקול ששונה לדור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ביטוי ספריות, כולל RNA נגיפי, מתוך מדגם יחיד של דם מלא. אופטימיזציה של פרוטוקול זה, שיפור טוהר RNA, גדל מצדו להתאוששות של RNAs מפוגל, הושמט גודל הבחירה, כדי לאפשר לכידה של RNA יותר מינים.

Introduction

רצף הדור הבא (הגדרות) התפתחה כלי רב עוצמה עבור החקירה של השינויים המתרחשים ברמת גנומית של אורגניזם ביולוגי. הכנת הדוגמא לשיטות המיתרים יכולים להיות מגוונים בהתאם האורגניזם, סוג הרקמה, והם וחשוב השאלות החוקרים להוטים כתובת. מחקרים רבים פנו המיתרים כאמצעי של הלומדים את ההבדלים בביטוי הגנים בין מדינות כגון אנשים בריאים וחולים1,2,3,4. קח רצף במקום על בסיס כל הגנום ומאפשר חוקר ללכוד את רוב, אם לא כל, של המידע גנומית סמן גנטי מסוים בכל פעם הצבע.

הסימנים הנפוצים ביותר הביטוי נצפו הן RNAs שליח (mRNAs). ההליכים הנפוצה ביותר עבור ספריות מכין עבור ה-RNA-seq ממוטבים עבור ההתאוששות של מולקולות ה-mRNA באמצעות סדרה של purifications, fragmentations ו-5,ligations6. עם זאת, ההחלטה על איך פרוטוקול נמצא שיבוצע מסתמכת במידה רבה על סוג הדגימה ואת השאלות להיות דיגמנה על הדגימה האמורה. ברוב המקרים מופק RNA הכולל; ובכל זאת, לא כל מולקולות RNA עניין, במקרים כמו ה-mRNA ביטוי מחקרים מופרזת שופע מינים RNA, כמו ribosomal RNAs (rRNA) צורך להסיר כדי להגדיל את מספר תעתיקים לזיהוי המשויך את mRNAs. שיטת ביותר פופולריים והשימוש בהם נפוץ עבור הסרת מולקולות rRNA שופע היא הפחתת polyadenylated RNA תעתיקים המכונה תיקים עשויים דלדול7. גישה זו עובד היטב עבור הניתוח של mRNA ביטוי זה אינו משפיע על התרשימים mRNA. עם זאת, מחקרים הם מעוניינים RNAs ללא קידוד או ויראלי, תיקים עשויים דלדול מסיר גם מולקולות אלה.

מחקרים רבים בחרו להתמקד ההכנה ספריית רצף הרנ א לבחון אחד מהביטויים mRNA (קידוד) או שיעור מסוים ללא קידוד RNA קטנות או גדולות. למרות שיש אחרים הליכים8 כמו שלנו המאפשרים הכנת הדוגמא כפול, מחקרים רבים להכין ספריות מדגימות נפרדת ללימודים נפרדים כאשר היא זמינה. עבור מחקר כמו שלנו, זה בדרך כלל דורש מספר דגימות דם הגדלת זמן, מתכלים, מתח בעלי חיים. מטרת המחקר שלנו היה להיות מסוגל להשתמש דם מבעלי כדי לזהות ולכמת את מחלקות שונות של שני mRNA והביע ללא קידוד RNA בין הרבייה חזירי פתוגני ובריאה תסמונת נשימתית וירוס (HP-PRRSV) תגר חזירים9,,10 , למרות שיש רק דגימת דם כל יחיד (2.5 מ ל) של חזיר אחד. כדי לעשות זאת, היינו צריכים למטב את החילוץ אופייני והפרוטוקולים ספריית יצירה כדי ליצור את הנתונים המתאימים כדי לאפשר ניתוח של mRNA והן ללא קידוד RNA (ncRNA) ביטוי11 מתוך מדגם בודד.

הנחיה זו צורך פרוטוקול המותר עבור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ניתוח כי ערכות סטנדרטיים זמינים ושיטות ליצירת RNA-חילוץ וספריה היו מיועדות בעיקר mRNA ולהשתמש עם דלדול poly-A בשלב12. שלב זה הייתה בלתי אפשרי לשחזר ללא קידוד RNA או ויראלי תעתיקים מדגם. לכן, שיטת אופטימיזציה היה צורך זה מותר לחילוץ RNA הכולל ללא מדגם תיקים עשויים דלדול. השיטה המובאת כתב יד זה מוטבה כדי לאפשר לשימוש של דם מלא כסוג לדוגמה, להקים ספריות רצפי mRNA והן ncRNAs בגדלים קטנים וגדולים. השיטה מוטבה כדי לאפשר הניתוח של כל לזיהוי אי קידוד RNAs, כמו גם לשמר RNAs נגיפי עבור חקירה מאוחר יותר13. בסך הכל, פרוטוקול הכנה שלנו ספריית ממוטבת מאפשר החקירה של מספר מולקולות RNA מתוך דגימת דם כל יחיד.

המטרה הכוללת מאחורי השימוש בשיטה זו הייתה לפתח תהליך איפשרה לאוסף ללא קידוד RNA וגם mRNA דוגמא אחת של דם מלא. זה מאפשר לנו יש mRNA, ncRNA ו- RNA נגיפי עבור כל בעל חיים במחקר שלנו הטרייה דוגמה יחידה9. זה, בסופו של דבר, מאפשר גילוי מדעי יותר ללא עלויות נוספות חיות ונותן תמונה שלמה יותר של הביטוי של כל דגימה בודדת. השיטה המתוארת מאפשרת הבחינה של הרגולטורים של ביטוי גנים, כמו גם לאפשר את השלמת correlative מחקרים שהשוו את שניהם mRNA וביטוי ללא קידוד RNA באמצעות דגימת דם כל יחיד. המחקר שלנו להשתמש בפרוטוקול זה לבחון השינויים בביטוי הגנים, הרגולטורים epigenetic ניתן ב נגוע לשווק 9 - בן שבועיים חזירים מסחרי זכרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

פרוטוקולים בעלי חיים אושרו על ידי המרכז הלאומי חיה המחלה (USDA-ARS-NADC) חיה אכפת ועל שימוש הוועדה.

1. דם חזיר חנקן נוזלי

  1. לאסוף דגימות דם לתוך צינורות RNA. איסוף ~2.5 mL ומעלה אם צינורות אוסף גדול יותר זמינים.

2. עיבוד של דם חזיר דגימות

  1. Centrifuge צינורות הדם ב x 5,020 g 10 דקות בטמפרטורת החדר (15-25 ° C). אם עיבוד קפוא דגימות דגירה צינור בטמפרטורת החדר במשך מינימום של 2 h לפני צנטריפוגה.
  2. להסיר את תגובת שיקוע ולהוסיף 8 מ ל מים נטולי RNase בגדר. סגור, מערבולת בגדר עד זה בעליל היא התפרקה. צנטריפוגה צינורות מדגם ב x 5,020 g 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לשחזר את גלולה. למחוק את כל תגובת שיקוע ולשמר את גלולה.

3. חילוץ אורגני הכולל RNA ו RNA קטנים (miRNA בידוד ערכת)

  1. מתחילים החילוץ-RNA הכולל על-ידי pipetting µL 300 פירוק איגוד מאגר בגדר מהשלב 2.2.
  2. מערבולת ולהעביר התערובת עד חדש מתויג 1.5 mL צנטריפוגה שפופרת. להוסיף 30 µL של homogenate מוספים הערכה. מערבולת הצינור והמקום על הקרח למשך 10 דקות.
  3. להסיר את הצינור ולהוסיף 300 µL של חומצה-פנול: כלורופורם ריאגנט הערכה. מערבולת צינור כדי לערבב. צנטריפוגה ב x 10,000 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הסר בזהירות פאזה מימית (300-350 µL) לרכבת התחתית טריים. הערה האחסון עבור השלב הבא.

4. הליך בידוד RNA הכולל

  1. מבוסס על הסכום של התאוששות מימית (300-350 µL) להוסיף נפח 1.25 x 100% (µL ~ 375) אתנול פאזה מימית. מערבבים את הדגימה באמצעות פיפטה.
  2. הגדרת חדש אוסף צינורות המכיל מחסנית מסנן עבור כל דגימה. פיפטה ~ µL 675 של התערובת lysate/אתנול על הדיו מסנן.
    הערה: אל תוסיף > 700 µL מסנן מחסנית בבת אחת. עבור אחסון גדולים יותר להחיל ברצף.
  3. צנטריפוגה בקצרה (~ 15-20 s) ב- x 10,000 g כדי לעבור נוזלי דרך המסנן. לא יצאו יותר. מזה.
  4. למחוק את הזרימה, במידת הצורך, חזור על צנטריפוגה בתערובת אתנול/lysate הנותרים עד כל שהוחלה. שומרים על אותו מסנן מחסנית ואוסף הצינור לשלב הבא.
  5. להוסיף 700 µL של שטיפת פתרון 1 הערכה הדיו מסנן, צנטריפוגה בקצרה (~ 10 s) למשוך דרך המסנן. למחוק את הזרימה ולשמור אותו מסנן מחסנית ואוסף הצינור.
  6. להוסיף 500 µL של שטיפת פתרון 2/3. צנטריפוגה כדי לצייר את הנוזל דרך המחסנית מסנן. למחוק את הזרימה. חזור על שלב שטיפה.
  7. בחלק אותו צינור, לסובב מחסנית מסנן של 60 נוספים s כדי להסיר את כל נוזל שיורית מסנן. להעביר את מחסנית מסנן צינור אוסף טריים.
  8. להוסיף 100 µL של מים נטולי נוקלאז מחומם מראש (95 ° C) למרכז של מיכל הדיו מסנן. ספין עבור 20-30 s במהירות מקסימלית צנטריפוגה שולחן.
    הערה: RNA מכילה את eluate, עכשיו ניתן עוד יותר מעובד או המאוחסנים ב-20 ° C, או מתחת. העשרה עבור RNAs קטן לא בוצעה.

5. גלובין הפחתה (בהתבסס על פרוטוקול אופטימיזציה עבור דגימות דם חזירי)14,15

הערה: גלובין הפחתת מתבצע כך ספריות לא מפוצץ באנשים עם קורא מיפוי גנים גלובין, אשר יוריד את מספר קריאות זמינה למיפוי גנים אחרים של עניין גדול14,15 .

  1. הכלאה עם גלובין הפחתת oligos
    1. Denature את הרנ א (דוגמה 6 µg RNA באמצעי אחסון מרבי µL 7) על ידי pipetting המדגם חילוץ לתוך צינור דק עם קירות התגובה ללא נוקלאז 0.2 מ"ל ו הצבת הצנטרפוגה תרמי ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. . זה המפתח לקרח צינורות מיד לאחר השלב הראשון denature לקבלת איכות מיטבית של RNA אין טיפול DNase נדרשת.
    2. בעוד צינורות מגניב להכין µL 400 של 10 x גלובין הפחתת oligo מיקס: 100 µL כל של שני HBA oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3', ו- 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3')-30 מיקרומטר, שני oligos HBB (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', ו 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3')-מיקרומטר 120 לכל תגובה, מניב ריכוז סופי של 7.5 מיקרומטר HBA oligos ו- 30 מיקרומטר HBB oligos. הכנת מאגר הכלאה x oligo 10: 100 מ מ טריס-HCL, pH 7.6; 200 מ"מ אשלגן כלורי.
    3. מכינים את תערובת הכלאה: µg 6 מדגם RNA (7 µL עוצמת קול גבוהה), 2 µL של µL 400 של 10 x גלובין הפחתת oligo מיקס (ריכוז סופי 2 X), µL 1 10 מאגר הכלאה x oligo (ריכוז סופי 1 x). להוסיף מים נטולי נוקלאז נפח סופי של 10 µL.
    4. הגדר thermocycler-70 מעלות צלזיוס במשך 5 דק מגניב מיד עד 4 ° C והמשך RNase H לעיכול.
  2. עיכול RNase H
    1. לדלל 10 x RNase H (10 U / µL) ל- 1 x RNase H עם 1 x מאגר RNase H.
      הערה: RNase מאגר מגיע ב- 10 x, יהיה צורך לדלל אותו עם 1 x RNase H המאגר ל- x 1 לפני השימוש.
    2. להכין תערובת התגובה RNase H ע י שילוב של: 2 µL של 10 x RNase מאגר µL 1 של מעכב RNase ב 2 µL 1 x RNase H, µL 5 נוקלאז ללא מים µL הנפח הכולל 10.
    3. מערבבים ביסודיות את הדגימות הכלאה גלובין הפחתת עם 10 µL של תערובת התגובה RNase H ו- digest ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות מגניב עד 4 ° C.
    4. לעצור לעיכול על ידי תוספת של µL 1.0 של 0.5 M EDTA כל מדגם והמשך מיד לשלב ניקוי.
  3. RNase H שטופלו RNA ניקוי כולל.
    1. לטהר RNase H מטופלים RNA באמצעות ערכת ניקוי טיהור סיליקה-המבוסס על רפידה • תנאי לפי הנחיות היצרן. Premix מאגרים: עבור מאגר כביסה קלה, להוסיף 44 מ ל 100% אתנול.
    2. לא להעביר את הדגימה צינור חדש. מוסיפים 80 µL של מים נטולי RNase µL 350 פירוק המאגר. להוסיף 250 µL של 100% אתנול מדולל RNA ולערבב היטב על ידי pipetting.
      הערה: לא צנטריפוגה. המשך מיד לשלב 5.3.3.
    3. עכשיו להעביר את הדגימה µL 700 מחסנית מסנן • תנאי להציב בצינור אוסף 2 מ"ל כדי לאסוף את הזרימה. צנטריפוגה 15 s ב-8,000 x ≥ g. למחוק את הזרימה דרך.
    4. חזור על זה על ידי הצבת הדיו מסנן • תנאי לתוך צינור חדש אוסף 2 מ"ל. להוסיף 500 µL של המאגר כביסה מתון מסנן מחסנית, צנטריפוגה 15 s ב-8,000 x ≥ g כדי לשטוף את הקרום מחסנית מסנן. למחוק את הזרימה דרך. שימוש חוזר ברכבת התחתית אוסף בשלב 5.3.5.
    5. עכשיו באמצעות הרכבת התחתית מדגם זהה, להוסיף עוד 500 µL של 80% אתנול הדיו מסנן. הפעם centrifuge ברכבת התחתית למשך 2 דקות ב ≥ x 8000 g. לאסוף את העמודה ספין • תנאי עבור השלב הבא ולמחוק את צינור זרימה דרך והן אוסף.
    6. לשים את מחסנית מסנן • תנאי מן השלב האחרון לתוך צינור חדש אוסף 2 מ"ל. . עזוב המכסה פתח שעל מחסנית מסנן ולאחר צנטריפוגה במלוא המהירות עבור 5 דקות כדי לייבש את הקרום עמודה ספין ולמנוע אתנול מועברים. למחוק את צינור זרימה דרך וגבייה.
      הערה: כדי למנוע נזק זווית עפעפיו להצביע בכיוון ההפוך מזה של הרוטור.
    7. לקחת את מחסנית מסנן מיובשים ולהניח לתוך צינור אוסף חדש של 1.5 mL. הוסף µL 14 של מים נטולי RNase לסינון ממברנה מחסנית מקפיד להוסיף את המים ללא RNase ישירות אל המרכז. צנטריפוגה 60 s במלוא המהירות כדי elute את הרנ א.
  4. להעריך איכות של דגימות RNA גלובין-מופחתת (שלב 6). המשך הכנת הדוגמא mRNA (שלב 7) ו16,הכנה (שלב 8) ספריית ה-RNA קטנים17.
    הערה: RNA גלובין-מופחתת דגימות עכשיו ניתן לאחסן ב-20 ° C, אולם אחסון ב-80 מעלות צלזיוס מומלץ לשימור לטווח ארוך.

6. הערכה של RNA

  1. ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים לכמת. נבחן היחס אורך הגל של 260 ו 280 ננומטר. יחס של ~ 2 ומעלה נחשב טהור עבור ה-RNA, ערכים נמוכים יותר להצביע על זיהום כלשהו. המכשיר משתמש יחס זה כדי לקבוע ריכוז ה-RNA כמו ng/µL.
  2. להעריך את איכות ה-RNA באמצעות 1 µL (100 ng) מדגם השבב המתאים. המוצר הסופי צריך להיות של רין ~ 2 ומעלה לשיא ב ~ 280 nt עבור ה-mRNA אחת לקרוא ספריות; פסגות ספריות ה-RNA קטנים-143 תואמות miRNAs.

7. תקועים הכולל הכנת הדוגמא RNA עבור ה-mRNA וספריות ncRNA ארוך. 16

  1. הערה: מביאים • תנאי מאגר rRNA להסרת חרוזים לטמפרטורת החדר. מראש תווית 0.2 מ"ל דק עם קירות המבחנות (צלחות עשוי לשמש גם). צעדים פרוטוקול מבוסס על הוראות היצרן16.
    1. להתחיל עם 4 µL של RNA גלובין-מופחתת. להוסיף 6 µL של מים נטולי נוקלאז µL 5 מאגר איגוד rRNA, 5 µL של rRNA מיקס להסרת למחזור (1סנט הצינור). פיפטה כדי לערבב מחדש קאפ. הכנס thermocycler עם 100 ° C מחומם-מכסה למשך 5 דקות על 68° ג הסר ומשאירים בטמפרטורת החדר במשך 60 s.
    2. Resuspend rRNA חרוזים להסרה על ידי מערבולת; להוסיף µL 35 של חרוזי צינור חדש של ה-PCR (2nd), פיפטה מדגם הצינורות 1סנט על גבי חרוזים את החצוצרות שלה 2nd . דגירה 2nd PCR צינור בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות. מניחים על הדוכן מגנטי במשך 7 דקות.
      הערה: לערבב כל מדגם ביסודיות על ידי pipetting של האופטימלית דלדול rRNA. גיוס/Lowering צינור בבסטה עשוי לעזור לזרז את תהליך ההפרדה.
    3. העברת תגובת שיקוע מהצינור PCR 2nd התאמה 3rd PCR שפופרת ואת המקום על המגנטי לעמוד למשך תקופה מינימלית של חוזר ס' 60 העברת לתוך צינור PCR חדש רק אם החרוזים לא תעביר לצדדים שפופרת.
    4. טיהור מדגם מיקס חרוזים על ידי מערבולת; להוסיף 99 µL כל שפופרת PCR 3rd . אפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות במקום מעמד מגנטי עבור 5 דק. ודא מהלכים חרוזים על הצדדים. פיפטה להשליך את תגובת שיקוע.
    5. שמור 3 אונסלוrd על מעמד מגנטי. להוסיף 200 µL של 70% אתנול בזמן נזהר שלא לדחוק את החרוזים. אפשר לשבת לפחות 30 s, פיפטה להשליך את תגובת שיקוע. חזור על שלב.
    6. מאפשרים מדגם לייבוש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על הדוכן מגנטי. Centrifuge המאגר • תנאי ערכת 5 s ב x 600 גרם. להסיר את הצינור ולהוסיף µL 11 • תנאי מאגר ערבוב ביסודיות. תקופת דגירה של 2 דקות על הספסל אז לפחות 5 דקות על הדוכן מגנטי בטמפרטורת החדר.
    7. להעביר µL 8.5 של תגובת שיקוע 3rd חדש (4ה) צינור ה-PCR. להוסיף 8.5 µL של מיקס גבוהה Elute/ראש/קטע מתוך הערכה. מערבבים היטב. קאפ, במקום thermocycler עם מחומם מראש מכסה במשך 8 דקות ב 94 ° C, תחזיק ב 4 º C. הסר ולאחר צנטריפוגה בקצרה.
  2. לסנתז קווצת הראשון cDNA
    1. לאפשר הראשונה לערבב סינתזה סטרנד מ ערכת לבוא לטמפרטורת החדר, צנטריפוגה-× 600 g עבור µL 5 ס 50 העברה של רוורס טרנסקריפטאז לתערובת סינתזה של גדיל הראשון. ניתן להוסיף רוורס טרנסקריפטאז קודם לנטישה של סינתזה ביחס של 1:9.
    2. פיפטה 8 µL של רוורס טרנסקריפטאז משולב/קודם לנטישה של סינתזה לערבב לתוך הצינור הרביעית עם דגימת. קאפ, צנטריפוגה x 600 גרם למקום ס' 5 לתוך thermocycler עם מכסה מחומם מראש להגדיר ב- 100 מעלות צלזיוס. רוצי: 10 דקות 25 ° c, 15 דקות ב- 42 ° C, 15 דקות ב 70 ° C, אז השאר ב 4 º C. אחסון הסופי הוא µL ~ 25 לכל טוב. להעביר מיד לשלב הבא.
  3. לסנתז cDNA חוט השני
    1. סיום תיקון ריאגנט (ERR), שילוב חוט השני (SSM) לטמפרטורת החדר, ומביא צנטריפוגה ב g 600 x עבור 5 ס' מיקס לטעות עם מאגר resuspension בשעה 1:50 דילול. הפקק צינורth 4 ולהוסיף 5 µL של ERR מדולל µL 20 של SSM לכל אחד; פיפטה לערבב היטב. נפח סופי ~ 50 µL ds cDNA.
    2. קאפ, תקופת דגירה של thermocycler של שעה ב-16 ° c בסיום המחזור, להסיר כובעי ומאפשרים להגיע לטמפרטורת החדר על גבי ספסל.
  4. שלב הניקיון cDNA ds
    1. התחל על ידי ערבוב את החרוזים פאראמגנטיים מוצק שלב הפיך הנייח (אלוהים אדירים) על ידי מערבולת. µL 90 של החרוזים להעביר הדגימה בצינורth4 (ds cDNA) ומערבבים. אחסון הסופי הוא 140 אפשר צינורות µL. תשב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות דגירה מעמד מגנטי ~ 5 דקות. הסר ~ 135 µL של תגובת שיקוע מכל קידוח. שם צריך 5 µL נשאר מכל קידוח.
    2. להשאיר את הצינורית על הדוכן מגנטי ולשטוף על-ידי הוספת 200 µL של 80% אתנול. אפשר לשבת 30 s ולאחר מכן הסר ו להשליך supernatant. חזור על שלב שטיפה. יוצאים צינורות על הדוכן מגנטית למשך 15 דקות לאפשר להתייבש.
    3. Centrifuge מאגר resuspension ב x 600 גרם 5 s לאחר מגיע לטמפרטורת החדר. הסר את צינורות של המעמד. להעביר הצינור µL 17.5 מאגר resuspension ומערבבים. תן צינורות דגירה על גבי ספסל במשך 2 דקות ואז לעבור לעמוד מגנטי במשך 5 דקות.
    4. פיפטה µL 15 של תגובת שיקוע המכיל את דגימות cDNA ds צינורות נגלו (5th) מ ל 0.2 דקות קיר חדש. לעבור לשלב הבא מיד או לאטום ולאחסן ב-15 ° C ל--25 ° C עבור לא יותר מ- 7 ימים.
  5. אדנילאט 3' קצוות.
    1. פיפטה 2.5 µL בטמפרטורת החדר resuspension מאגר לאמבטיה מדגם ואז להוסיף 12.5 µL של מיקס A-עוקב המופשרים. מערבבים לחלוטין על-ידי pipetting.
      הערה: שליטה A-עוקב בשימוש.
    2. קאפ, דגירה ב thermocycler עם מכסה מחומם מראש 100 ° C. הפעל ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם מכסה מחוממת. לאפשר את thermocycler לנוח ב 4 º C.
  6. מאתרים ומפסיקים אינדקס מתאמים
    1. מביאים הצינורות RNA מתאם השילוב לעצור את המאגר מצדו לטמפרטורת החדר. עבור כל אחד, צנטריפוגה ב x 600 g עבור שילוב מצדו לעזוב ס' 5 במקפיא עד מוכן לשימוש. יש לדעת מדגם באגירת סידור לצורך יצירת אינדקס.
    2. להוסיף כל שפופרת מדגם µL 2.5 מאגר resuspension ו- 2.5 µL של מיקס מצדו. עכשיו פיפטה ב- 2.5 µL של מתאם ה-RNA תקין לתוך כל שפופרת הדגימה. מתאם הבחירה צריכה להתבצע לפי הוראות היצרן עבור ערכת שבחרת.
    3. לסכם ומערבבים על ידי צנטריפוגה עבור 1 דקות ב x 280 גרם. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי 10 דקות ב 30 º C. להוסיף 5 µL לעצור את המאגר מצדו הדגימה כדי לעצור את התגובה ומערבבים היטב.
    4. בגין לנקות על ידי ערבוב חרוזים פאראמגנטיים אלוהים אדירים על ידי מערבולת עבור 60-ס' 42 להעביר µL של חרוזים על כל שפופרת. מיקס thoroughlythen תקופת דגירה של 15 דקות על גבי ספסל.
    5. להעביר צינורות מעמד מגנטי ולהשאיר עד פונה נוזלי הסימון (~ 5 דקות). פעם אחת ברורה להסיר ולמחוק µL 79.5 של תגובת שיקוע. יוצאים צינורות על הדוכן מגנטי, לרחוץ על-ידי הוספת 200 µL של 80% אתנול. אפשר לשבת לפחות 30 s ולאחר מכן הסר ו להשליך supernatant. חזור על שלב שטיפה. יוצאים במעמד מגנטי נוסף ~ 15 דקות לאפשר ייבוש. לא לשבש את החרוזים במהלך שטיפת מדרגות.
    6. להוסיף µL 52.5 resuspension מאגר הצינור מדגם ומערבבים עד החרוזים לגמרי מחדש על תנאי. תקופת דגירה של 2 דקות על גבי ספסל. המהלך מדגם צינור חזרה לדוכן מגנטי עד שהנוזל ברור (~ 5 דקות).
    7. להשאיר על דוכן העדים, בעדינות פיפטה µL 50 של תגובת שיקוע חדש (6th) צינורות. הוסף µL 50 vortexed אלוהים אדירים החרוזים. מאפשרים דגירה על גבי ספסל למשך 15 דקות.
    8. מעבר לדוכן מגנטי ותנו הצלחת להישאר עד פונה נוזל נקה (~ 5 דקות). ביטול 95 µL של תגובת שיקוע עוזבים 5 µL בתוך כל שפופרת.
    9. יוצאים צינורות מעמד מגנטי, לרחוץ על-ידי הוספת 200 µL של 80% אתנול. לאפשר צינור לשבת ב-30 s ואז להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. לחזור על השטיפה. תן צינורות יבש מעמד מגנטי למשך 15 דקות.
    10. מוסיפים µL 22.5 resuspension מאגר, מערבבים עד חרוזים מושעים. דגירה על הספסל למשך 2 דקות ואז לעבור לעמוד מגנטי עד ברור נוזלי תורות (~ 5 דקות). פיפטה 20 µL מדגם לתוך המבחנות חדש (7th).
  7. להביא למרכיבי הקיט הדרושים בטמפרטורת החדר. להעביר 5 µL של ה-PCR פריימר מיקס, 25 µL של מיקס מאסטר PCR ערכת מדגם (7ה PCR צינור) המכיל דוגמאות באינדקס. מערבבים צינור מדגם והכובע.
    1. מניחים צינורות הצנטרפוגה תרמי עם מכסה מחומם מראש. הפעל תוכנית: 98 ° C ל 30 s ולאחר מכן 15 מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s, 72 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להחזיק ב 4 º C.
  8. לנקות את דגימות על-ידי הוספת µL 50 של חרוזים אלוהים אדירים מעורב מספיק לדגום שפופרת, פיפטה לשלב. לאפשר התגובה דגירה על גבי ספסל למשך 15 דקות.
    1. להעביר את הצינור אל דוכן מגנטי, דגירה עד פונה נוזלי הסימון (~ 5 דקות). ביטול 95 µL של תגובת שיקוע עוזבים 5 µL בתוך כל שפופרת.
    2. יוצאים צינור מעמד מגנטי, לרחוץ על-ידי הוספת 200 µL של 80% אתנול. אפשר לשבת לפחות 30 s, ואז להסיר, להשליך תגובת שיקוע. חזור על שלב זה לשטוף. יוצאים במעמד מגנטי למשך 15 דקות לאפשר להתייבש.
    3. מוסיפים µL 32.5 מאגר resuspension, לערבב עד חרוזים לגמרי מחדש על תנאי. דגירה על הספסל למשך 2 דקות ואז לעבור לעמוד מגנטי עד ברור נוזלי תורות (~ 5 דקות). פיפטה µL 30 מדגם מהצינור כל לתוך צינור ה-PCR.
    4. להעריך DNA ובאיכות חוזרת שלבים 6.1 ו- 6.2 עם השבב המתאים. לעבור באגירת צעד (9).

8. קטן RNA ספריית הכנה sncRNAs. 17

הערה: השלבים פרוטוקול מבוסס על הוראות היצרן17.

  1. נתחיל קטן RNA הספרייה במכינה ~ 220 ng - ~1.1 µg / µL של RNA גלובין-מופחתת דגימות (4 µL).
  2. מתאם מצדו
    1. מאתרים ומפסיקים את 3'-המתאם על ידי ערבוב יסודי 1 µL של מתאם, µL 2 של מים נטולי נוקלאז µL 4 מדגם ה-RNA גלובין-מופחתת. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן מקם באופן מיידי על קרח.
    2. להוסיף 10 µL של 2 x מאגר מצדו, 3 µL של תערובת אנזימים מצדו, לערבב, דגירה 16 ° C עבור 18 h.
      הערה: זמן הדגירה של הדגימה עלייה ל 18 שעות בטמפרטורה נמוכה יותר של 16 ° C מומלצת מחקרים מעוניין מפוגל RNA מינים, כגון piwi RNAs. זמן הדגירה ארוך מאפשר יעילות רבה יותר מצדו בשל המעמד של שינויים בשלב 3' מתאם מצדו.
    3. להוסיף 1 µL של שעתוק במהופך תחל ב- 4.5 µL של מים נטולי נוקלאז לתערובת מצדו כדי למנוע היווצרות עודף 3' מתאם מתאם-דימר.
    4. דגירה ב הצנטרפוגה תרמיות preheated מתוכנת 5 דקות ב 75 ° C, 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 15 דקות ב- 25 ° C, ולהחזיק ב 4 º C.
    5. Denature µL 1 של טרום מדולל 5'-מתאם לפי מדגם הצנטרפוגה תרמי ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן מקם באופן מיידי על קרח.
    6. להוסיף 1 µL של שפגע בסימני 5'-מתאם, µL 1 מצדו מאגר 10 x 5' ו- 2.5 µL של מצדו האנזים 5'. לערבב, דגירה 25 מעלות לשעה.
  3. cDNA סינתזה, הגברה
    1. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 30 µL של RNA יונקות/3′-מתאם-ובין אם לא, µL 8 המאגר הראשון-strand, µL 1 של מעכב RNase µL 1 של רוורס טרנסקריפטאז. דגירה התערובת ב 50 מעלות צלזיוס במשך 60 דק להמשיך מיד כדי PCR הגברה או חום להשבית את התגובה ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחסן ב-20 ° C.
    2. PCR להגביר את µL 40 של רוורס טרנסקריפטאז תגובה על-ידי הוספת µL 50 של מיקס מאסטר PCR, µL 2.5 של תחל RNA PCR, להוסיף µL 2.5 ייעודית RNA PCR מדד פריימר מדגם, ומים ללא נוקלאז כדי הנפח הכולל של 100 µL. לערבב על ידי pipetting. לרוץ PCR הצנטרפוגה תרמי באמצעות רכיבה על אופניים התנאים הבאים: דנטורציה הראשונית ב 94 ° C ל 30 s; 11 מחזורים של 94 ° C 15 s, חישול ב 62 ° C s 30, ואת סיומת ב 70 ° C 15 s; ואחריהם סיומת הסופי ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; דוגמאות יכולים להתקיים ב 4 ° C ב הצנטרפוגה.
    3. הערה: אינדקסים נוספים למטרה של מדגם איגום.
  4. ניקיון מדגם
    1. מערכת ניקוי הדנ א הוסף µL 500 איגוד מאגר (5 מ' גו-HCl, 30% אלכוהול איזופרופיל) µL 100 PCR מדגם מוגבר כדי לאפשר קשירה יעיל קרום ספין-טור.
      הערה: אם המאגר איגוד יש pH מחוון כלול זה הצבע של התערובת הוא צהוב.
    2. פיפטה 600 µL תערובת של מדגם ומאגר איגוד לתוך מחסנית מסנן בתוך צינור אוסף 2 מ"ל, ספין עבור 30-60 s ב x 17,900 g ומפרידה שולחן. להתעלם זרימה דרך.
    3. לשטוף את מחסנית מסנן לתוך הצינור אוסף אותו עם 0.75 מ של ערכת שסופק שטיפת מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 80% אתנול) מאת ספינינג עבור 30-60 s ב 17,900 x g ומפרידה שולחן ומחיקת הזרם-דרך. ספין הדיו מסנן להתייבש במשך 60 נוספים s.
    4. מניחים את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף mL 1.5 נקי. להוסיף 30 µL • תנאי מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 8.5), תן את העמודה לעמוד במשך 60 s ולאחר מכן ספין 60 s ב x 17,900 g בצנטריפוגה שולחן.
  5. להעריך איכות מדגם חוזרת שלבים 6.1 ו- 6.2 עם שבב דנ א מתאים. להעביר איגוד צעד (9).

9. לטעום באגירת עבור רצף

  1. בריכת לבר-קוד ודוגמאות QC'ed על-ידי הגדרת ולקרוא צינורות חדשים (או צלחת PCR טוב 96) להכיל דוגמאות mRNA או ncRNA. העברת µL 13 של כל ספריה 10nM לבר-קוד צינורות המתאים (או בארות בצלחת חדש) לכל יצרן הוראות16,17. שלח במאגר דגימות עבור רצף, להיות בטוח לבחור אורכי קריאה דומה אם הדגימות שיופעל על השבב אותו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הדגימות נציג במחקר שלנו הם גלובין דגימות דם כל מדולדל ribo. התוצאה נציג של הפרוטוקול מורכב מדגם ספריית מדולדל גלובין עם מספר שלמות RNA (RIN) מעל 7 (איור 1) ו- 260/280 nm ריכוז יחסי או מעל 2 (איור 1ב' וג' 1). אימות של התוצאה מדגם בוצעה באמצע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול כי עשה את זה אופטימיזציה כלל הצעדים דלדול נוסף גלובין, שהפכו אותו ניתן לקבל איכות קריאות מדגימות דם מלא. אחת המגבלות הגדולות על השימוש דם במחקרים רצף המספרים גבוהה הקריאות במדגם זה יהיה למפות גלובין מולקולות להפחית את הקורא את יכולת למפות את מולקולות אחרות הר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה היא אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית. משרד החקלאות הוא הזדמנות שווה ספק המעסיק.

Acknowledgements

עבודה זו בעיקר נתמך על ידי על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2013-67015-21236, וכן על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2015-67015-23216. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי פעילות חקלאית מחקר שירות מחקר השתתפות בתוכנית מנוהל על ידי המכון אוק רידג על מדע, חינוך (ORISE) דרך הסוכנויות הסכם בין (משרד האנרגיה של ארה DOE), מחלקת החקלאות של ארצות הברית. ORISE מנוהלת על ידי אלון רכס Associated אוניברסיטאות תחת חוזה דו. לא. דה-AC05-06OR2310.

ברצוננו להודות ד ר קיי Faaberg HP-PRRSV זיהומיות שיבוטים, ד ר סוזן Brockmeier עזרה עם חיות מעורב בניסוי, סו Ohlendorf עבור שירותי מזכירות בהכנה של כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PAXgene TubesPreAnalytix762165
Molecular Biology Grade WaterThermoFisher10977-015
mirVana miRNA Isolation KitThermoFisherAM1560
Rneasy MinElute Clean Up KitQIAGEN74204
100% EthanolDecon Labs, Inc.2716
0.2 mL thin-walled tubesThermoFisher98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubesAny supplier
Veriti 96-well ThermocyclerThermoFisher4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1)Any supplierSequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2)Any supplierSequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1)Any supplierSequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2)Any supplierSequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
-KClMillipore Sigma60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
 -DTTThermoFisherY00147
 -MgCl2PromegaA351B
 -Molecular Biology Grade WaterThermoFisher10977-015
RNase HThermoFisherAM2292
SUPERase-INThermoFisherAM2694Rnase inhibitor
EDTAMillipore SigmaE7889
MicrocentrifugeAny supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer InstrumentAgilent TechnologiesG2938C
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent Technologies5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  KitAgilent Technologies5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero IlluminaRS-122-2201mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation GuideIlluminaAvailable on-line
RNAClean XP BeadsBeckmanCoulterA63987
AMPure XP BeadsBeckmanCoulterA63880
MicroAmp Optical 8-tube StripThermoFisherN80105800.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip CapThermoFisherN801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirsAny supplier
SuperScript II Reverse TranscriptaseThermoFisher18064-014
MicroAmp Optical 96 well platesThermoFisherN8010560These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive filmThermoFisher4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) New England BiolabsE73005small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) New England BiolabsE75805small RNA kit
QIAQuick PCR Purification KitQIAGEN28104
96S Super Magnet PlateALPAQUAA001322

References

  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084(2014).
  3. Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412(2015).
  4. Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).
  5. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  6. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  7. Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  8. Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf (2015).
  9. Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
  10. Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).
  11. Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
  12. Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
  13. Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9(2015).
  14. Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954(2014).
  15. Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf (2007).
  16. TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
  17. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018).
  18. Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041(2014).
  19. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).
  20. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141mRNARNARNA SeqEpigenetic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved