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요약

여기, 우리가 코딩 (mRNA)의 처리를 위해 최적화 된 프로토콜을 제시 하 고 비 코딩 (ncRNA) globin 단일 전체 혈액 샘플에서 RNA-seq 라이브러리를 감소.

초록

점점 더 강력 하 고 혁신적인 다음 세대 시퀀싱 기술의 출현 관심의 생물학 프로세스에 관련 된 기본 유전자 발현 검사 하는 기능으로 새로운 길을 열었습니다. 이러한 혁신 뿐만 아니라 그 효과 세포 기능, 유전자에 대 한 코드는 mRNA 시퀀스에서 관찰 하는 연구원을 허용 하지만 또한 비 코딩 RNA (ncRNA) 분자 번역, 하지만 여전히 남아 있는 규정 하는 기능. 연구자는 mRNA와 ncRNA 식 관찰 하는 능력, 그것은 하나 또는 다른에 집중 하는 연구에 대 한 관습 되었습니다. 그러나, 연구는 mRNA와 ncRNA 식으로 관심이 있다, 여러 번 사용 별도 샘플 검사 코딩 또는 비 코딩 RNAs 라이브러리 준비에 차이 때문에. 이 시간, 소모품 및 동물 스트레스를 증가 시킬 수 있는 더 많은 샘플에 대 한 필요 발생할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 분석, 일반적으로 mRNA, 조사 될 수 있는 생물 학적 질문의 수를 제한에 대 한 샘플을 준비 하기로 하는 연구자를 발생할 수 있습니다. 그러나, ncRNAs 효과 mRNA 식 규제 역할을 가진 여러 클래스를 스팬. 중요 하기 때문에 ncRNA 기본적인 생물 학적 프로세스와 이러한 프로세스에서의 장애를 감염 하는 동안, 그들은 따라서, 치료제에 대 한 매력적인 목표를 만들 수 있습니다. 이 원고는 세대에 대 한 수정된 프로토콜을 보여줍니다 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 라이브러리, 전 혈의 단일 샘플에서 바이러스 성 RNA를 포함 하 여. 이 프로토콜의 최적화 RNA의 순도 향상, 갠 RNAs의 복구용 결 찰을 증가 하 고 더 많은 RNA의 캡처 수 있도록 크기 선택, 생략.

서문

다음 차세대 시퀀싱 (NGS) 생물학 유 기체의 게놈 수준에서 발생 하는 변경의 수사를 위한 강력한 도구로 떠오르고 있다. NGS 메서드에 대 한 샘플 준비 유기 체, 조직 유형에 따라 변화 될 수 있습니다 그리고 더 중요 한 것은 질문 연구원은 촉각을 곤두세우고 있다 주소. 많은 연구 결과 건강 하 고 아픈 개인1,2,,34같은 국가 사이 유전자 발현의 차이 공부 하는 수단으로 NGS를 아닙니다. 시퀀싱 걸릴 전체 게놈으로 놓고, 대부분 캡처 연구원 수 없다면, 한 번에 특정 유전자 표식에 대 한 게놈 정보의 포인트.

관찰 하는 식의 가장 일반적인 표시는 메신저 RNAs (mRNAs). RNA-seq에 대 한 준비 라이브러리에 대 한 가장 많이 사용 된 절차 purifications, fragmentations, 및 ligations5,6의 시리즈를 통해 mRNA 분자의 복구를 위해 최적화 되어 있다. 그러나, 수행 하는 프로토콜은 어떻게에 결정 샘플 유형과 말했다 샘플에 대해 제기 되는 질문에 무 겁 게 의존 합니다. 대부분의 경우에서 총 RNA 추출; 그러나, 관심의 모든 RNA 분자는 고 mRNA 식 연구 같은 경우에 리보솜 RNAs (rRNA) 같은 지나치게 풍부한 RNA 종 감지 성적표는 mRNAs와 관련 된의 수를 늘리기 위해 제거 될 필요가 있다. 풍부한 rRNA 분자를 제거 하기 위한 가장 대중적이 고 널리 사용 방법은 polyadenylated RNA 사본 polyA 고갈7로의 감소 이다. 이 접근은 mRNA 발현의 분석으로 mRNA 사본에는 영향을 주지 않습니다. 그러나, 비 코딩 또는 바이러스 성 RNAs에 관심이 있는 연구에 polyA 고갈이이 분자도 제거 합니다.

많은 연구는 RNA 순서 라이브러리 준비 검사 (코딩) mRNA 식 이거나 또는 작은 또는 큰 비 코딩 RNA의 특정 클래스에 초점을 선택 합니다. 듀얼 샘플 준비에 대 한 허용 하는 우리 같은 다른 절차8 있지만, 많은 연구 가능한 경우 별도 연구에 대 한 별도 샘플에서 라이브러리를 준비 합니다. 우리 같은 연구에 대 한이 일반적으로 여러 개의 혈액 샘플, 소모품, 시간과 동물 스트레스 증가 요구할 것입니다. 우리의 연구의 목표를 사용 하 여 전체 혈액 동물에서 식별 하 고 두 mRNA의 다른 클래스를 계량 수 되었고 건강 하 고 높은 병원 성 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV HP) 사이 비 코딩 RNA 표현 도 불구 하 고만 하나의 전체 혈액 샘플 (2.5 mL) 각 돼지에서 돼지9,10 도전. 이 위해서 우리 일반적인 추출 및 mRNA 및 비 코딩 RNA (ncRNA) 식11 단일 샘플에서의 분석에 대 한 있도록 적절 한 데이터를 생성 하기 위해 라이브러리 생성 프로토콜을 최적화 하기 위해 필요 합니다.

이 때문에 RNA 추출 및 라이브러리 생성을 위한 방법과 사용할 수 있는 표준 키트 mRNA를 위해 주로 예정 되었다 폴 리 A 고갈 단계12를 사용 하 여 mRNA 및 비 코딩 RNA 분석에 대 한 허용 하는 프로토콜에 대 한 필요 라는 메시지가 나타납니다. 이 단계 만들었을 것입니다 그것은 비 코딩 RNA 바이러스 증명서 샘플에서 복구 불가능. 따라서, 최적화 방법 필요 했다 샘플 polyA 고갈 없이 총 RNA 추출에 대 한 허용. 이 원고에 표시 메서드에 mRNA를 소형 및 대형 크기의 ncRNAs 시퀀싱 라이브러리를 빌드를 샘플 형식으로 전체 혈액의 사용 하 고 최적화 되었습니다. 메서드는 모든 감지 비 코딩 RNAs의 분석에 대 한 허용 하 고 이후 수사13에 대 한 바이러스 성 RNAs를 유지 최적화 되었습니다. 모두 있음, 우리의 최적화 된 라이브러리 준비 프로토콜 단일 전체 혈액 샘플에서 여러 개의 RNA 분자의 조사에 대 한 수 있습니다.

이 메서드를 사용 하 여 뒤에 전반적인 목표는 전체 혈액의 1 개의 샘플에서 비 코딩 RNA와 mRNA의 컬렉션에 대 한 허용 하는 프로세스를 개발 했다. 우리의 연구는 단일 샘플9에서 공급에 mRNA, ncRNA, 및 각 동물에 대 한 바이러스 성 RNA를가지고 수 있습니다. 이, 궁극적으로, 동물 추가 비용 없이 더 많은 과학적 발견에 대 한 허용 하 고 각 개별 샘플의 식의 더 완전 한 그림을 제공 합니다. 설명 된 메서드를 모두 비교 하는 상호 학문의 완료에 대 한 허용 뿐만 아니라 유전자 발현의 레 귤 레이 터의 시험에 대 한 수 있습니다 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 단일 전체 혈액 샘플을 사용 하 여. 우리의 연구는 유전자 발현에 변화를 검사 하이 프로토콜을 사용 하 고 가능한 후 레 귤 레이 터는 9 주 된 남성 상업 돼지에 virally 감염 된.

프로토콜

동물 프로토콜 국립 동물 질병 센터 (미국 농 무부-ARS-NADC) 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 돼지 혈액의 수집 샘플링

  1. RNA 튜브로 혈액 샘플을 수집 합니다. 수집 ~2.5 mL 또는 더 큰 컬렉션 튜브를 사용할 수 있는 경우.

2. 돼지 혈액의 처리 샘플

  1. 5,020 x g 실 온 (15-25 ° C)에서 10 분 동안에 혈액 튜브 원심 만약 냉동 처리 샘플 튜브는 최소 원심 분리 이전 2 h의에 대 한 실 온에서 품 어.
  2. 상쾌한을 제거 하 고 펠 릿에 RNase 무료 물 8 mL를 추가 합니다. 닫기 하 고 소용돌이 펠 릿 눈 녹아 때까지. 샘플 튜브는 펠 릿을 복구를 실 온에서 10 분 동안 5,020 x g 에서 원심 모든 상쾌한 무시 하 고 펠 릿을 보존 한다.

3. 유기 추출 총 RNA와 작은 RNA (miRNA 격리 키트)

  1. 2.2 단계에서 세포 바인딩 버퍼의 pipetting 300 µ L에 의해 펠 릿 총 RNA 추출을 시작 합니다.
  2. 소용돌이 전송 하는 새로운 혼합 이라는 1.5 mL 원심 분리기 튜브. 키트에서 homogenate 첨가제의 30 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관과 10 분 동안 얼음에 장소.
  3. 튜브를 제거 하 고 산 페 놀의 300 µ L를 추가: 클로 프롬 시 약 키트에서. 소용돌이를 섞어 튜브입니다. 실 온에서 5 분 동안 10000 x g 에서 원심.
  4. 수성 단계 (300-350 µ L) 신선한 튜브를 조심 스럽게 제거. 다음 단계에 대 한 볼륨 note

4. 총 RNA 격리 절차

  1. 수성 복구 (300-350 µ L)의 금액에 따라 수성 단계로 100% (~ 375 µ L) 에탄올의 1.25 x 볼륨을 추가. 피 펫을 사용 하 여 샘플을 믹스.
  2. 설정 새로운 컬렉션 튜브 포함 하는 각 샘플에 대 한 필터 카트리지. 피 펫 ~ 675 µ L 필터 카트리지로 lysate/에탄올 혼합물의.
    참고: 추가 하지 마십시오 > 700 µ L 필터 카트리지를 한 번에. 더 큰 볼륨에 대 한 연속적으로 적용 됩니다.
  3. 짧게 원심 (~ 15-20 s) 10000 x g 필터를 통해 액체를 통과에서. 이것 보다 더 회전 하지 않습니다.
  4. 통해 흐름을 무시 하 고 필요한 경우 반복 하 여 나머지 lysate/에탄올 혼합 원심 모두 적용 된. 다음 단계에 대 한 동일한 필터 카트리지 및 컬렉션 튜브를 유지 합니다.
  5. 필터 카트리지에 키트에서 세척 솔루션 1의 700 µ L을 추가 하 고 간단히 원심 (~ 10 s) 필터를 이겨낼. 통해 흐름을 무시 하 고 동일한 필터 카트리지 및 수집 관을 유지.
  6. 세척 솔루션 2/3의 500 µ L를 추가 합니다. 필터 카트리지를 통해 액체를 그리는 원심 분리기. 삭제를 통해 흐름. 세척 단계를 반복 합니다.
  7. 기계가 동일 관, 스핀 필터 카트리지는 추가 60 필터에서 모든 잔여 액체를 제거 하는 s. 신선한 수집 튜브에 필터 카트리지를 전송.
  8. 필터 카트리지의 센터에 미리가 열된 (95 ° C) nuclease 무료 물 100 µ L를 추가 합니다. 탁상 원심 분리기 최대 속도에서 약 20-30 s에 대 한 스핀.
    참고: RNA는 eluate에 포함 하 고 수 지금 될 추가 처리 또는 저장-20 ° C 이하로. 작은 RNAs에 대 한 농축은 수행 되지 않습니다.

5. globin 감소 (돼지 전체 혈액 샘플에 대 한 최적화 된 프로토콜에 따라)14,15

참고: 있도록 라이브러리와 overpopulated 하지는 감소를 수행 하는 Globin globin 유전자, 큰 관심14,15 의 다른 유전자를 매핑하는 데 사용할 수 있는 읽기의 수를 낮은 것에 대 한 매핑을 읽습니다.

  1. Globin 감소 oligos와 교 잡
    1. (최대 7 µ L 볼륨에서 6 µ g RNA 샘플) RNA 추출된 샘플 0.2 mL nuclease 무료 반응 얇은 벽 관에 pipetting으로 2 분 동안 70 ° C에서 열 cycler에서 변성. 최적의 RNA 품질에 대 한 첫 번째 denature 단계 직후 튜브 아이스 하 키입니다. DNase 치료 필요 합니다.
    2. 튜브 멋진 globin 감소 올리고 믹스 x 10의 400 µ L를 준비 하는 동안: 100 µ L 각 두 개의 HBA oligos의 (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3', 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3 ') 30 µ M, 두 HBB oligos에 (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', 그리고 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3')에서 반응 당 120 µ M, 7.5 µ M HBA oligos 30 µ M HBB oligos의 최종 농도 저조한. 10 x oligo 교 잡 버퍼 준비: 100 mM Tris HCL, pH 7.6; 200 m m KCl입니다.
    3. 교 잡 믹스 준비: RNA 샘플 (최대 7 µ L 볼륨), globin 감소 올리고 믹스 (최종 농도 2 배), 1 µ L 10 x oligo 교 잡 버퍼의 x 10의 400 µ L의 2 µ L의 6 µ g (최종 농도 1 x). 10 µ L의 최종 볼륨을 nuclease 무료 물을 추가 합니다.
    4. 70 ° C 5 분 쿨 즉시 4 ° C에서 thermocycler를 설정 하 고 RNase H 소화를 진행.
  2. RNase H 소화
    1. RNase H x 10 희석 (10 U / µ L) 버퍼 RNase H x 1과 RNase H x 1를.
      참고: 버퍼 10 x에서 온다 고 1x로 희석 될 필요가 있을 것 이다 RNase RNase H 1 x는 사용 전에 버퍼링 합니다.
    2. RNase H 반응 혼합 결합 하 여 준비: 2 µ L x RNase 버퍼, RNase H x 1의 2 µ L에서 RNase 억제제의 1 µ L nuclease 무료 물 총 볼륨 10 µ L에 5 µ L 10의.
    3. RNase H 반응 혼합 및 4 ° c 10 분 쿨에 대 한 37 ° C에서 다이제스트 10 µ L Globin 감소 교 잡 샘플 철저 하 게 혼합
    4. 각 샘플에 0.5 M EDTA의 1.0 µ L의 추가 의해 소화를 중지 하 고 즉시 정리 단계를 수행 하십시오.
  3. RNase H 처리 총 RNA 정리입니다.
    1. 정화 RNase H RNA 제조업체의 지침에 따라 실리 카 멤브레인 기반 차입 정화 청소 키트를 사용 하 여 처리. 버퍼를 공기로: 가벼운 세척 버퍼에 대 한 100% 에탄올의 44 개 mL를 추가.
    2. 새로운 튜브에 샘플을 전송 하지 않습니다. RNase 무료 물 80 µ L 350 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 잘 pipetting으로 희석 RNA를 혼합 100% 에탄올의 250 µ L를 추가 합니다.
      참고: 원심 하지 마십시오. 5.3.3 단계로 바로 진행 합니다.
    3. 이제 2 mL 컬렉션 튜브를 통해 흐름을 수집에 배치 하는 차입 필터 카트리지를 700 µ L 샘플을 전송 합니다. 원심 분리기 15 ≥ 8000 x g에서 s. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    4. 새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 차입 필터 카트리지를 배치 하 여이 반복 합니다. 필터 카트리지 및 15에 대 한 원심 분리기에 가벼운 세척 버퍼의 500 µ L를 추가 s ≥ 8000 x g 필터 카트리지 막 세척 하기 위하여. 흐름을 통해 삭제 합니다. 5.3.5 단계에서 컬렉션 튜브를 다시 사용 합니다.
    5. 이제 동일한 샘플 튜브를 사용 하 여 필터 카트리지를 80% 에탄올의 또 다른 500 µ L를 추가 합니다. 이 시간 원심 ≥ 8000 x g2 분에 대 한 관. 다음 단계에 대 한 차입 스핀 열을 수집 하 고 흐름을 통해와 수집 튜브를 삭제.
    6. 새로운 2 mL 컬렉션 튜브에 마지막 단계에서 차입 필터 카트리지를 넣어. 두고 뚜껑 열고 필터 카트리지에 스핀 열 막 건조 방지 에탄올을 5 분 최고 속도로 원심이 월. 흐름을 통해 및 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.
      참고: 피하기 위해 손상 각도 터의 반대 방향으로 가리키도록 뚜껑.
    7. 말린된 필터 카트리지를가지고 고 새로운 1.5 mL 수집 관으로 장소. 14 µ L RNase 무료 물 필터 카트리지 막 RNase 무료 물 센터에 직접 추가 추가 합니다. 원심 분리기 60 s elute RNA를 최고 속도로.
  4. RNA 샘플 globin 감소 (6 단계)의 품질을 평가 합니다. MRNA 샘플 준비 (7 단계)와 작은 RNA 라이브러리 준비 (8 단계)16,17를 진행 합니다.
    그러나 참고: Globin 감소 RNA 샘플 지금 저장할 수 있습니다-20 ° C에 저장-80 ° C에서 장기 보존을 위한 것이 좋습니다.

6입니다. RNA의 평가

  1. RNA 농도 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량. 260과 280 nm의 파장 비율을 확인 합니다. 고 ~ 2 이상 비율 RNA에 대 한 순수한 간주 됩니다 낮은 값을 나타내는 몇 가지 오염. 악기는 ng / µ L로 RNA 농도 결정 하기 위해이 비율을 사용 합니다.
  2. 1 µ L를 사용 하 여 RNA 품질 평가 (100 ng) 적절 한 칩에 샘플의. 최종 제품 있어야 ~ 2 이상 린 ~ 280에서 피크 단일 mRNA에 대 한 nt 읽기 라이브러리; 143에서 작은 RNA 라이브러리 봉우리 miRNAs에 해당합니다.

7. 좌초 mRNA 및 긴 ncRNA 라이브러리에 대 한 총 RNA 샘플 준비. 16

  1. 참고: 차입 버퍼와 가져올 rRNA 제거 구슬 실내 온도에. 미리 레이블을 0.2 ml 얇은-벽으로 PCR 튜브 (번호판도 사용할 수 있습니다). 프로토콜 단계 제조 업체의 지침16에 따라.
    1. Globin 감소 RNA의 4 µ L로 시작 합니다. 6 µ L nuclease 무료 물, rRNA 바인딩 버퍼의 5 µ L 및 튜브 (1st 관) 당 rRNA 제거 믹스의 5 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 다시 뚜껑 플라스틱. 68 ° C. 제거에 5 분 동안 100 ° C가 열 뚜껑 thermocycler 놓고 60 실 온에 두고 s.
    2. 의해 소용돌이; rRNA 제거 구슬 resuspend 새로운 2 (nd) PCR 튜브에 구슬의 35 µ L을 추가 하 고 샘플 2nd 튜브에 구슬에 1st 튜브에서 플라스틱. 3 분 동안 실 온에서 2차 PCR 튜브를 품 어. 7 분 마그네틱 스탠드에 놓습니다.
      참고: 최적의 rRNA 고갈에 대 한 pipetting으로 각 샘플을 철저 하 게 혼합. 높이 낮추기 튜브 스탠드에서 분리 과정을 신속 하 게 하는 데 도움이 있습니다.
    3. 일치 3rd PCR 튜브 및 자석에 장소는 상쾌한 2nd PCR 튜브에서 전송 서 최소 60 미 반복에 대 한 새로운 PCR 관으로 전송 구슬 튜브 양쪽에 이동 되지 않습니다 경우에.
    4. 소용돌이;에 의해 혼합 샘플 정화 구슬 각 3rd PCR 튜브를 99 µ L를 추가 합니다. 확인 구슬 이동 면 실 온에 5 분에 대 한 자기 서 15 분 장소에 대 한에 앉아 수 있습니다. 폐기는 상쾌한 피 펫입니다.
    5. 3rd 튜브를 마그네틱 스탠드에 설정 하십시오. 되 고자 구슬 하지 않도록 주의 하는 동안 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 적어도 30 s 및 폐기는 상쾌한 피 펫 앉아 허용. 단계를 반복 합니다.
    6. 마그네틱 스탠드에 15 분 동안 실내 온도에 건조 하는 샘플을 수 있습니다. 5에 대 한 키트 차입 버퍼 원심 600 x g에서 s. 튜브를 제거 하 고 철저 하 게 혼합 하는 차입 버퍼의 11 µ L를 추가 합니다. 벤치에 2 분 후 5 분 이상 실 온에서 마그네틱 스탠드에 품 어.
    7. 새로운 (4일)에 3rd 에서 상쾌한의 8.5 µ L를 전송 PCR 튜브. 키트에서 Elute/프라임/조각 높은 믹스 8.5 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스. 모자 및 장소에 미리가 열 된 thermocycler 94 ° C에서 8 분 뚜껑, 4 ° c.에서 개최 제거 하 고 짧게 원심.
  2. 첫번째 물가 cDNA를 합성
    1. 실내 온도에 서 첫 번째 가닥 합성 혼합으로 역전사의 5 미 전송 50 µ L에 대 한 600 × g 에서 원심을 키트 첫 번째 가닥 합성 혼합을 수 있습니다. 먼저 1: 9의 비율로 종합 물가를 역전사를 추가할 수 있습니다.
    2. 플라스틱의 결합된 역전사 8 µ L/처음 합성 혼합 샘플 4 관으로 가닥. 뚜껑과 100 ° c.에 설정 미리가 열 뚜껑 thermocycler로 600 x g 5 미 장소에 대 한 원심 실행: 25 ° C, 42 ° C, 70 ° C에서 15 분에서 15 분에서 10 분 후 4 ° c.에 휴식 마지막 볼륨은 잘 당 25 µ L. 즉시 다음 단계로 이동 합니다.
  3. 두 번째 가닥 cDNA를 합성
    1. 실내 온도, 고 5 s. 믹스 잘못 물의 resuspension 버퍼 1시 50분에 대 한 600 x g에서 원심 끝 복구 시 약 (ERR)와 두 번째 가닥 믹스 (SSM) 희석. 4번째 튜브를 벗기다; 각 5 µ L 희석된 ERR의 SSM의 20 µ L을 추가 하 고 잘 섞어 피 펫입니다. 마지막 볼륨 ~ 50 µ L ds cDNA
    2. 모자와 16 ° c.에 1 시간 동안 thermocycler에서 품 어 주기가 완료 되 면 모자를 제거 하 고 벤치 위에 실내 온도에 올 수 있게.
  4. ds cDNA 정리 단계
    1. 소용돌이 의해 단단한 단계 가역 동원 정지 (SPRI) 상자성 구슬 혼합 하 여 시작 합니다. 4번째튜브 (ds cDNA)에 샘플을 구슬의 90 µ L를 전송 하 고 섞으십시오. 마지막 볼륨은 140 µ L. 허용 관을 실 온에서 15 분 동안 앉아 ~ 5 분 마그네틱 스탠드에 품 어. 각 우물에서의 상쾌한 ~ 135 µ L을 제거 합니다. 5 µ L 각 우물에 남아 해야 합니다.
    2. 마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 세척. 30 s 다음 제거 하 고 표면에 뜨는 폐기 앉아 허용. 세척 단계를 반복 합니다. 15 분 건조 있도록 마그네틱 스탠드에 튜브를 남겨 주세요.
    3. 600 x g 5에서 물의 resuspension 버퍼 원심 후 실내 온도에 오는 s. 스탠드에서 튜브를 제거 합니다. 튜브를 물의 resuspension 버퍼의 17.5 µ L를 전송 하 고 섞으십시오. 튜브 2 분 후 5 분 동안 마그네틱 스탠드 이동 벤치 위에 품 어 보자.
    4. 15 µ L의 상쾌한 새로운 얇은 벽 (5회) 세트 0.2 mL 튜브에 ds cDNA 샘플 포함 된 플라스틱 다음 단계로 신속 하 게 또는 인감 이동한-25 ° c-15 ° C에서 7 일 동안 저장 합니다.
  5. Adenylate 3' 끝입니다.
    1. 샘플 튜브에 실내 온도 물의 resuspension 버퍼의 2.5 µ L 플라스틱 다음 해 동된 A-미행 믹스의 12.5 µ L를 추가 합니다. 완전히 pipetting으로 혼합.
      참고: 없음 A-미행 제어 사용입니다.
    2. 모자 하 고 100 ° C 미리가 열 뚜껑 thermocycler에서 품 어. 다음 온수 뚜껑을 5 분 동안 70 ° C에서 30 분 동안 37 ° C에서 실행 합니다. 4 ° c.에 휴식 thermocycler 허용
  6. 인덱스 어댑터 선
    1. 실내 온도에 RNA 어댑터 튜브와 결 찰 버퍼 중지 믹스를 가져와. 각각에 대 한 사용을 위해 준비 될 때까지 냉동 실에 5 미 휴가 내 고 믹스에 대 한 600 x g 에서 원심. 샘플 배열 인덱싱 풀링 알려져야 한다.
    2. 각 샘플 튜브를 물의 resuspension 버퍼의 2.5 µ L 및 2.5 µ L의 결 찰 믹스를 추가 합니다. 이제 각 샘플 튜브에 적절 한 RNA 어댑터의 2.5 µ L에 플라스틱. 어댑터 선택 선택한 키트에 대 한 제조업체의 지침에 의해 수행 되어야 한다.
    3. 요점 되풀이 하 고 280 x g에서 1 분 동안 원심 분리에 의해 혼합. 30 ° c.에서 10 분에 대 한 열 cycler에 품 어 반응을 정지 하 여 잘 혼합 샘플에 그만 결 찰 버퍼의 5 µ L를 추가 합니다.
    4. 시작 정리 SPRI 상자성 구슬 구슬 각 튜브의 60 미 전송 42 µ L에 대 한 소용돌이 의해 혼합 하 여. 혼합 thoroughlythen 벤치 위에 15 분 동안 품 어.
    5. 마그네틱 스탠드에 튜브를 이동 하 고 액체 회전 취소 (~ 5 분) 때까지. 분명 한 번 제거 하 고 상쾌한의 79.5 µ L를 삭제. 마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 세척. 적어도 30 s 다음 제거 하 고 표면에 뜨는 폐기 앉아 허용. 세척 단계를 반복 합니다. 추가 ~ 15 분 건조 있도록 마그네틱 스탠드에 둡니다. 세척 단계 동안 구슬을 방해 하지 않습니다.
    6. 샘플 튜브를 물의 resuspension 버퍼의 52.5 µ L을 추가 하 고 구슬 완전히 다시 중단 될 때까지 혼합. 벤치 위에 2 분 동안 품 어. 액체까지 마그네틱 스탠드를 다시 이동 샘플 튜브 분명 하다 (~ 5 분).
    7. 스탠드에 두고 부드럽게 상쾌한 새로운 (6일)에 50 µ L 플라스틱 튜브. Vortexed SPRI 구슬의 50 µ L를 추가 합니다. 허용 15 분 동안 벤치 위에 품 어.
    8. 마그네틱 스탠드를 이동 하 고 액체 회전 취소 (~ 5 분) 때까지 접시를 보자. 각 관에서 5 µ L를 떠나 버리기 95 µ L의 상쾌한.
    9. 마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 세척. 허용 30 앉아 튜브 s 다음 제거 하 고 상쾌한 삭제. 세척을 반복 합니다. 튜브 마그네틱 스탠드 15 분에 건조 하자.
    10. 물의 resuspension 버퍼의 22.5 µ L에 추가 하 고 구슬 일시 중단 때까지 섞는다. 2 분 동안 벤치에 incubate 다음 마그네틱 스탠드 명확한 액체 회전까지 (~ 5 분)로 이동 합니다. 새로운 PCR 튜브 (7일)으로 20 µ L의 샘플을 플라스틱.
  7. 실내 온도에 필요한 키트 구성 요소를가지고. 샘플 키트에서 PCR 뇌관 믹스의 5 µ L 및 PCR 마스터 믹스의 25 µ L를 전송 (7번째 PCR 튜브) 포함 하는 인덱싱된 샘플. 샘플 및 캡 튜브를 혼합.
    1. 미리가 열 뚜껑 열 cycler에 튜브를 놓습니다. 프로그램 실행: 98 ° C 30에 대 한 s, 다음 10 98 ° C의 15 주기 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C에 4 ° c.에서 5 분 대기에 대 한
  8. 결합 하 여 충분히 혼합된 SPRI 구슬 튜브 샘플 및 플라스틱의 50 µ L을 추가 하 여 샘플을 정리 합니다. 15 분 동안 벤치 위에 품 어에 반응을 수 있습니다.
    1. 마그네틱 스탠드에 튜브를 이동 하 고 액체 회전 취소 (~ 5 분) 때까지 품 어. 각 관에서 5 µ L를 떠나 버리기 95 µ L의 상쾌한.
    2. 마그네틱 스탠드에 관을 두고 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 세척. 적어도 30 s 다음 제거와 삭제는 상쾌한 앉아 허용. 이 세 단계를 반복 합니다. 15 분 건조 있도록 마그네틱 스탠드에 둡니다.
    3. 물의 resuspension 버퍼의 32.5 µ L에 추가 하 고 구슬 완전히 다시 중단 될 때까지 혼합. 2 분 동안 벤치에 incubate 다음 마그네틱 스탠드 명확한 액체 회전까지 (~ 5 분)로 이동 합니다. 새로운 PCR 튜브에 각 관에서 샘플의 30 µ L 플라스틱.
    4. 6.1 및 6.2 적절 한 칩을 단계를 반복 하 여 DNA 수량 및 품질을 평가 합니다. 풀링을 단계 (9 단계)로 이동.

8. 작은 RNA 라이브러리는 sncRNAs에 대 한 준비. 17

참고: 프로토콜 단계 제조 업체의 지침17에 따라.

  1. 작은 RNA 라이브러리 준비 시작 ~ 220 ng-~1.1 µ g / µ L globin 감소 RNA의 샘플 (4 µ L).
  2. 어댑터 결 찰
    1. 3'-어댑터 어댑터, nuclease 무료 물, 2 µ L 그리고 globin 감소 RNA 샘플의 4 µ L의 철저 하 게 1 µ L를 혼합 하 여 선. 2 분 동안 70 ° C에서 품 어 하 고 즉시 얼음에 놓습니다.
    2. 결 찰 버퍼, x 2의 10 µ L을 추가 하 고 3 µ L의 결 찰 효소 혼합, 혼합 및 18 h 16 ° C를 품 어.
      참고: 16 ° C의 낮은 온도에서 18 시간 증가 샘플 보육 시간 연구 갠 RNA 종, piwi RNAs에에서 관심이 적합 합니다. 장시간 보육 단계 3' 어댑터 결 찰 결 찰 효율성 때문에 수정의 클래스에 대 한 수 있습니다.
    3. 초과 3' 어댑터의 어댑터-이합체 형성을 방지 하기 위해 결 찰 혼합물에 nuclease 무료 물 4.5 µ L에서 반전 녹음 방송 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다.
    4. 75 ° C, 37 ° C, 25 ° C에서 15 분에서 15 분에서 5 분 동안 프로그램 데워 열 cycler에서 incubate 및 4 ° c.에서 개최
    5. 미리 희석된 5'-어댑터의 2 분 동안 70 ° C에서 열 cycler에서 샘플 당 1 µ L를 변성 하 고 즉시 얼음에 놓습니다.
    6. 변성된 5'-어댑터의 1 µ L, 10 x 5' 결 찰 버퍼의 1 µ L 5' 결 찰 효소의 2.5 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 1 시간에 25 ° C를 품 어.
  3. cDNA 합성 및 증폭
    1. 5 ' / 3-어댑터-출혈 RNA, 첫 번째 가닥 버퍼의 8 µ L, RNase 억제제의 1 µ L의 역전사의 1 µ L pipetting 30 µ L에 의해 철저 하 게 혼합. 60 분 진행 즉시 PCR 증폭을 위한 50 ° C에 혼합물을 품 어 또는 열 비활성화 15 분 동안 70 ° C에서 반응 하 고-20 ° c.에 저장
    2. PCR 증폭 PCR 마스터 믹스, RNA PCR 뇌관의 2.5 µ L의 50 µ L 추가 지정 된 RNA PCR 뇌관 인덱스 샘플의 2.5 µ L을 추가 하 여 역전사 반응의 40 µ L과 nuclease 무료 물 100 µ L. 총 볼륨에 pipetting으로 혼합. 다음 자전거 조건을 사용 하 여 열 cycler에서 실행 하는 PCR: 30 94 ° C에서 초기 변성 s; 15 94 ° C의 11 주기 30 s, 및 15에 대 한 70 ° C에서 확장 하는 62 ° C에서 어 닐 링 s s; 70 ° c 5 분;에 대 한 최종 확장명 샘플은 cycler에 4 ° C에서 개최 될 수 있습니다.
    3. 참고: 인덱스 샘플 풀링의 목적에 대 한 추가 됩니다.
  4. 샘플 정리
    1. DNA 정리 키트에서 500 µ L 바인딩 버퍼의 추가 (5 M 구-HCl, 30% 소 프로 파 놀) 스핀-열 막에 효율적인 바인딩 수 있도록 PCR 증폭된 샘플의 100 µ L를.
      참고: 바인딩 버퍼 인디케이터가 pH 포함 되어 있는지 확인 하는 경우는 혼합물의 색 노란색 이다.
    2. 샘플 및 필터 카트리지 2 mL 수집 관, 스핀 탁상 원심 분리기에 17,900 x g 에서 30-60 s 안쪽에 바인딩 버퍼의 피 펫 600 µ L 혼합물. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    3. 30-60 s 17,900 x g 탁상 원심 분리기에서 회전 하 고 흐름을 무시 하 여 제공 하는 키트 워시 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 7.5, 80% 에탄올)의 0.75 mL와 같은 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 씻어-통해. 회전 필터 카트리지는 추가 60 건조 s.
    4. 깨끗 한 1.5 mL 컬렉션 튜브에서 필터 카트리지를 놓습니다. 차입 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 8.5) 30 µ L 60에 대 한 서 열 게 추가 s, 그리고 60 다음 스핀 17,900 x g 탁상 원심 분리기에서 s.
  5. 적절 한 DNA 칩 6.1 및 6.2 단계를 반복 하 여 샘플 품질을 평가 합니다. 풀링을 단계 (9 단계)로 이동 합니다.

9입니다. 샘플 시퀀싱 풀링

  1. 수영장 barcoded 그리고 QC'ed 샘플을 설정 하 고 레이블 새 튜브 (또는 96 잘 PCR 플레이트) mRNA 또는 ncRNA 샘플을 포함 하 여. 제조 업체의 지침16,17당 해당 튜브 (또는 새로운 플레이트에 웰 스) 각 바코드 10nM 라이브러리의 13 µ L를 전송 합니다. 시퀀싱에 대 한 풀링된 샘플을 제출, 특정 샘플 동일한 칩에서 실행 하는 경우 비슷한 읽기 길이 선택할 수 있습니다.

결과

우리의 연구에서 대표 샘플 globin ribo 고갈 전체 혈액 샘플은. 7 (그림 1을)와 260/280 nm 농도 비율 2 (그림 1b와 1 c) 이상에 RNA 무결성 번호 (린)와 globin 고갈된 라이브러리 샘플 프로토콜의 대표적인 결과 의하여 이루어져 있다. 유효성 검사 샘플 결과의 각 도서관의 최종 농도 주고 분 광 광도 계를 사용 하 ?...

토론

만든 최적화 된 프로토콜의 첫 번째 중요 한 단계 추가 globin 고갈 단계, 전체 혈액 샘플에서 품질 읽기를 가능 하 게 포함 되어 있습니다. 전 혈을 사용 하 여 시퀀싱 연구에서에 가장 큰 한계 중 하나는 globin 분자에 지도 하 고 관심18의 다른 분자에 매핑할 수 있는 읽기를 줄이기 위해 샘플에서 읽기의 높은 숫자입니다. 따라서, 우리의 샘플 유형에 대 한 프로토콜을 최적화, 우리?...

공개

저자는 공개 없다.

상호 또는이 문서에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부는 평등한 기회 제공 및 고용주입니다.

감사의 말

이 작품에 의해 주로 지원 되었다에 의해 미국 농 무부 NIFA AFRI 2013-67015-21236, 그리고 일부 USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216 여. 이 연구는 농업 연구 서비스 연구 참여 프로그램은 미국 에너지 부 (사이 부처간 합의 통해 과학 교육 (ORISE)에 대 한 오크 리 지 연구소에 의해 관리 하는 약속에 의해 부분적으로 지원 되었다 미상)와 미국 농 무부. ORISE는 관리 오크 리 지 연관 된 대학에 의해 DOE 계약에서 더. 드-AC05-06OR2310입니다.

우리는 HP PRRSV 전염 성 클론, 박사 수잔 Brockmeier에 대 한 그녀의 동물 실험에 관련 된 도움말 및 비서 지원 원고 준비에 대 한 고소 Ohlendorf 닥터 케이 Faaberg 감사 하 고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
PAXgene TubesPreAnalytix762165
Molecular Biology Grade WaterThermoFisher10977-015
mirVana miRNA Isolation KitThermoFisherAM1560
Rneasy MinElute Clean Up KitQIAGEN74204
100% EthanolDecon Labs, Inc.2716
0.2 mL thin-walled tubesThermoFisher98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubesAny supplier
Veriti 96-well ThermocyclerThermoFisher4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1)Any supplierSequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2)Any supplierSequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1)Any supplierSequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2)Any supplierSequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
-KClMillipore Sigma60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
 -DTTThermoFisherY00147
 -MgCl2PromegaA351B
 -Molecular Biology Grade WaterThermoFisher10977-015
RNase HThermoFisherAM2292
SUPERase-INThermoFisherAM2694Rnase inhibitor
EDTAMillipore SigmaE7889
MicrocentrifugeAny supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer InstrumentAgilent TechnologiesG2938C
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent Technologies5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  KitAgilent Technologies5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero IlluminaRS-122-2201mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation GuideIlluminaAvailable on-line
RNAClean XP BeadsBeckmanCoulterA63987
AMPure XP BeadsBeckmanCoulterA63880
MicroAmp Optical 8-tube StripThermoFisherN80105800.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip CapThermoFisherN801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirsAny supplier
SuperScript II Reverse TranscriptaseThermoFisher18064-014
MicroAmp Optical 96 well platesThermoFisherN8010560These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive filmThermoFisher4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) New England BiolabsE73005small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) New England BiolabsE75805small RNA kit
QIAQuick PCR Purification KitQIAGEN28104
96S Super Magnet PlateALPAQUAA001322

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