JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, biz (mRNA) kodlama işlem için optimize edilmiş bir iletişim kuralı mevcut ve (ncRNA) globin kodlamayan RNA-seq kitaplıkları bir tek tam kan örneğinden azaltılmış.

Özet

Yenilikçi ve giderek güçlü bir sonraki nesil sıralama teknikleri gelişiyle faiz biyolojik süreçleri ile ilgili temel gen ekspresyonu incelemek için yetenek içine yeni yollar açtı. Bu yenilikler sadece araştırmacılar ifade mRNA dizilerinden genler için bu etkin hücresel işlevi kod gözlemlemek için izin, ancak çevrilmeyen ama hala kalır kodlamayan RNA (ncRNA) molekülleri düzenleyici fonksiyonları da mevcuttur. Araştırmacılar mRNA ve ncRNA ifade gözlemlemek yeteneği olmasına rağmen alışılmış odaklanmak bir veya diğer bir çalışma oldu. Çalışmalar mRNA ve ncRNA ifadede ilgileniyor musunuz, ancak, birçok kez onlar ayrı örnekleri kodlama veya RNA'ların Kütüphane hazırlıklar farklılığı nedeniyle kodlamayan incelemek için kullanın. Bu zaman, sarf malzemeleri ve hayvan stres artırabilir daha fazla örnek için gereken yol açabilir. Ayrıca, araştırmacılar örnekleri tek bir analizi için genellikle mRNA soruşturma olması biyolojik soru sayısını sınırlama, hazırlamak karar vermek neden olabilir. Ancak, ncRNA'lar o etkisi mRNA ifade düzenleyici rollere sahip birden çok sınıf span. NcRNA olduğundan temel biyolojik süreçler ve bu süreçlerin bozukluğu için önemli enfeksiyon sırasında bu nedenle, tedavi için çekici hedefler hale getirebilir. Bu el yazması değiştirilmiş bir protokol oluşturmak için gösterir mRNA ve tam kan tek bir örnek üzerinden viral RNA da dahil olmak üzere kodlamayan RNA ifade kütüphaneler,. Bu protokol optimizasyon RNA saflık geliştirilmiş, ligasyonu metillenmiş RNA'ların kurtarılması için arttı ve boyut seçimi, daha fazla RNA türlerin yakalama izin vermek için ihmal.

Giriş

Sonraki nesil sıralama (NGS) biyolojik organizmalar genomik düzeyinde meydana gelen değişiklikler incelenmesi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. NGS yöntemleri için numune hazırlama organizma, doku türü, bağlı olarak değiştirilebilir ve daha da önemlisi sorular araştırmacılar adresine keskin burada. Birçok çalışma NGS için gen ekspresyonu hasta ve sağlıklı bireyler1,2,3,4gibi devletler arasındaki farklılıkları eğitim aracı olarak döndü. Sıralama bir bütün genom olarak yerleştirin ve en iyi yakalamak bir araştırmacı sağlar, değilse, genomik için tüm bilgileri belirli bir genetik marker teker teker gelin.

En yaygın veri işaretleyicilerini gözlenen ifade haberci RNA (mRNA) vardır. En çok kullanılan yordamlar prepping kitaplıkları için RNA-seq purifications, fragmentations ve d5,6bir dizi aracılığıyla mRNA molekülleri kurtarılması için optimize edilmiştir. Ancak, bir protokol yapılması için nasıl üzerinde karar ağır örnek türü ve dedi örnek hakkında yöneltilen sorular üzerine dayanmaktadır. Çoğu durumda toplam RNA elde edilir; henüz, tüm RNA molekülleri ilgi ve mRNA ifade çalışmaları gibi durumlarda ribozomal RNA (rRNA) gibi aşırı bol RNA tür tespit tutanakları mRNA'ların ile ilişkili sayısını artırmak için kaldırılması gerekir. Bol rRNA molekülleri kaldırmak için en popüler ve yaygın olarak kullanılan yöntem polyA tükenmesi7olarak anılacaktır poliadenile RNA transkript azalma var. Bu yaklaşım mRNA transkript etkilemez de mRNA ifade analizi için çalışır. Ancak, içinde ya da viral kodlamayan RNA'ların ilgilenen çalışmalarda polyA tükenmesi bu moleküller de kaldırır.

Birçok çalışma (kodlama) ya da mRNA ifade incelemek için RNA dizisi Kütüphane hazırlık veya küçük veya büyük kodlamayan RNA'ın belirli bir sınıfın odaklanmak seçin. Bizimki Çift numune hazırlama için izin gibi diğer yordamlar8 olsa da, birçok çalışma kitaplıkları ayrı örneklerinden ayrı çalışmalar ne zaman elde edilebilir için hazır olun. Bizimki gibi bir çalışma için bu normalde zaman, sarf malzemeleri ve hayvan stres artan birden fazla kan örnekleri gerektirecektir. Çalışmamızın amacı belirlemek ve her iki mRNA farklı sınıflar ölçmek için tam kan hayvanlardan kullanmak mümkün olacaktı ve sağlıklı ve yüksek patojenik domuz üreme ve solunum Sendromu virüs (HP-PRRSV) arasında kodlamayan RNA ifade Sadece bir tek tam kan örneği (2.5 mL) her domuz olmasına rağmen domuz9,10 meydan. Bunu yapabilmek için biz tipik çıkarma ve kütüphane oluşturma protokolleri mRNA ve kodlamayan RNA (ncRNA) ifade11 tek bir örnek üzerinden analizi için izin vermek için uygun verileri oluşturmak için en iyi duruma getirmek için gerekli.

Bu mevcut standart kitleri ve RNA-ekstraksiyon ve kütüphane oluşturma yöntemlerini esas mRNA için amaçlanmıştır ve bir poli-A tükenmesi adım12kullanın çünkü mRNA ve kodlamayan RNA analizi için izin verilen bir iletişim kuralı için bir ihtiyaç istenir. Bu adımı kodlamayan RNA veya viral transkript alınan örneğin kurtarmak mümkün olurdu. Bu nedenle, en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi ihtiyaç vardı bu izin olmadan örnek polyA tükenmesi toplam RNA çıkarılması için. Bu el yazması sunulan Yöntem mRNA ve ncRNA'lar küçük ve büyük boyutlarda için sıralama kitaplıkları oluşturmak için ve tam kan bir örnek türü olarak kullanmak için izin vermek için optimize edilmiştir. Yöntem, tüm tespit kodlamayan RNA'ların analiz için izin gibi daha sonra soruşturma13viral RNA'ların korumak için en iyi duruma getirilmiş. Toplamda, bir tek tam kan örneği üzerinden birden çok RNA molekülleri incelenmesi için bizim en iyi duruma getirilmiş Kütüphane hazırlık Protokolü sağlar.

Genel amacı, bu yöntemin kullanılması arkasında hem kodlamayan RNA ve mRNA koleksiyonundan bir tam kan örneği için izin verilen bir süreç geliştirmekti. Bu bir tek örnek9' dan kaynaklı çalışma mRNA, ncRNA ve her hayvan için viral RNA olmasını sağlar. Bu, sonuçta, ek hayvan maliyeti olmadan daha bilimsel keşif için izin verir ve daha kapsamlı bir resmi tek tek her örnek ifade verir. Gen ifadesinin yanı sıra her iki karşılaştırarak bağdaşık çalışmaların tamamlanması için izin düzenleyiciler incelenmesi için açıklanan yöntemi sağlar mRNA ve kodlamayan RNA ifade tek bütün kan örneği kullanarak. Bizim çalışma gen ekspresyonu değişiklikleri incelemek için bu protokolü kullanılan ve olası epigenetik düzenleyiciler virally 9 - hafta eski erkek ticari domuzları enfekte.

Protokol

Hayvan iletişim kuralları ulusal hayvan hastalığı Merkezi (USDA-ARS-NADC) hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. toplama domuz kan örnekleri

  1. Kan örnekleri RNA tüpler içine toplamak. Büyük koleksiyon tüpler yoksa ~2.5 mL veya daha fazla toplama.

2. domuz kan işleme örnekleri

  1. 5,020 x g (15-25 ° C) Oda sıcaklığında 10 dakika için de kan tüpler santrifüj kapasitesi. Eğer dondurulmuş işleme örnekleri için bir en az 2 h aralıklarla önce oda sıcaklığında tüp kuluçkaya.
  2. Süpernatant kaldırın ve 8 mL su RNase free için Pelet ekleyin. Kapat ve girdap Pelet kadar gözle görülür çözülür. 5,020 x g Pelet kurtarmak için oda sıcaklığında 10 dakika için de örnek tüpler santrifüj kapasitesi. Tüm süpernatant atın ve Pelet korumak.

3. organik çıkarma için toplam RNA ve küçük RNA (miRNA izolasyon Kit)

  1. Toplam RNA ayıklama lizis bağlama arabellek pipetting 300 µL tarafından adım 2.2 için Pelet başlar.
  2. Girdap ve transfer yeni bir karışıma 1,5 mL santrifüj tüpü etiketli. Homogenate katkı 30 µL Seti'nden ekleyin. Girdap tüp ve 10 min için buz üzerinde yer.
  3. Tüpü çıkarması ve asit-fenol 300 µL ekleyin: kloroform reaktif kiti. Girdap karıştırmak için tüp. 10.000 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
  4. Sulu faz (300-350 µL) taze bir tüp için dikkatli bir şekilde çıkarın. Bir sonraki adım için birim unutmayın.

4. Toplam RNA izolasyon yordamı

  1. Sulu kurtarma (300-350 µL) miktarına göre %100 (~ 375 µL) etanol 1,25 x hacmi sulu faz için ekleyin. Bir pipet kullanarak örnek karıştırın.
  2. Her örnek için bir filtre kartuş içeren kurulum yeni koleksiyon tüpler. Pipet ~ 675 µL üzerine filtre kartuşu lysate/etanol karışımı.
    Not: > 700 µL filtre kartuşu için aynı anda eklemeyin. Daha büyük birimler için art arda uygulayın.
  3. Kısaca santrifüj kapasitesi (~ 15-20 s) sıvı filtreden geçmek için 10.000 x g de. Bu daha fazla spin yok.
  4. Aracılığıyla akış atmak ve tüm uygulandıktan kadar gerekirse, kalan lysate/etanol karışımı ile aralıklarla tekrarlayın. Bir sonraki adım için aynı filtre kartuş ve toplama tüp korur.
  5. Yıkama çözüm 1 700 µL seti için filtre kartuşu ekleyin ve kısa bir süre santrifüj kapasitesi (~ 10 s) filtre üzerinden çekmek için. Aracılığıyla akış atmak ve aynı filtre kartuşu ve toplama tüp korumak.
  6. Yıkama çözüm 2/3 500 µL ekleyin. Santrifüj filtre kartuşu ile sıvı çizmek için. Aracılığıyla akış atmak. Yıkama adımı yineleyin.
  7. Çalışmaları aynı Tüp, filtre kartuşu bir ek 60 spin s herhangi bir kalıntı sıvı filtre kaldırmak için. Filtre kartuşu bir taze koleksiyonu tüp aktarın.
  8. Önceden ısıtılmış (95 ° C) nükleaz ücretsiz su 100 µL filtre kartuşu Merkezi'ne ekleyin. Yaklaşık 20-30 s Masaüstü Santrifüj maksimum hızda için spin.
    Not: RNA eluate bulunan şimdi daha fazla işlenen ve -20 ° C veya altında saklı. Zenginleştirme için küçük RNA'lar gerçekleştirilmedi.

5. globin azaltma (domuz tam kan örnekleri için en iyi duruma getirilmiş bir protokol bağlı olarak)14,15

Not: kütüphaneler ile kalabalık değil böylece azaltma gerçekleştirilir Globin eşleme okuma büyük ilgi14,15 diğer genler için eşlemek kullanılabilir sayısı düşürmek globin genleri için okur.

  1. Hibridizasyon globin azaltma oligos ile
    1. RNA (maksimum 7 µL ses 6 µg RNA örnek) ayıklanan örnek 0.2 mL ince duvarlı nükleaz-alerjik reaksiyon tüp içine pipetting ve 2 min için 70 ° c termal cycler yerleştirerek denatüre. Hemen sonra ilk denature adım en uygun RNA kalitesi için tüpler buz anahtarıdır. DNaz tedavi gereklidir.
    2. Tüpler serin bir 400 µL 10 x globin azaltma oligo karışımı hazırlarken: 100 µL her iki HBA oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3' ve 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3') 30 µM, iki HBB oligos, (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', ve 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3') 7.5 µM HBA oligos ve 30 µM HBB oligos son bir konsantrasyon tepki başına 120 µM verimli. 10 x oligo hibridizasyon arabellek hazırlamak: 100 mM Tris-HCL, pH 7,6; 200 mM KCl.
    3. Hibridizasyon karışımı hazırlayın: RNA örneği (maksimum 7 µL ses) 10 globin azaltma oligo mix (son konsantrasyon 2 X), 10 x oligo hibridizasyon arabelleği 1 µL x 400 µL 2 µL 6 µg (son konsantrasyonu 1 x). Nükleaz ücretsiz su 10 µL son bir hacim için ekleyin.
    4. 70 ° c 5 dk. serin hemen 4 ° C için thermocycler ayarla ve RNase H sindirim için devam edin.
  2. RNase H sindirim
    1. 10 RNase H x seyreltik (10 U / µL) 1 RNase H x 1 x RNase H arabellek.
      Not: tampon 10 x gelir ve 1 x ile seyreltilmiş gerekir RNase RNase H 1 x kullanmak için önceden tampon.
    2. RNase H reaksiyon mix birleştirme tarafından hazırlamak: 10 x RNase arabellek, 1 RNase H x 2 µL RNase inhibitörü 1 µL ve 5 µL nükleaz ücretsiz su için toplam Cilt 10 µL 2 µL.
    3. Globin azaltma hibridizasyon örnekleri RNase H reaksiyon mix ve sindirmek için 10 dk. serin ile 4 ° c 37 ° C'de 10 µL iyice karıştırın
    4. Sindirim 0,5 M EDTA her örnek için 1.0 µL eklenmesi tarafından durdurmak ve hemen Temizleme adıma geçin.
  3. RNase H tedavi edilen toplam RNA Temizleme.
    1. Arındırmak RNase H silis-zar bazlı elüsyon arıtma Temizleme Seti üreticisinin yönergeleri doğrultusunda kullanarak RNA tedavi. Premix arabellekleri: hafif yıkama arabellek için % 100 etanol 44 mL ekleyin.
    2. Örnek için yeni bir tüp aktarılmaz. 80 µL RNase free su ve 350 µL lizis arabelleği ekleyin. 250 µL % 100 etanol seyreltilmiş RNA için de pipetting tarafından ekleyip karıştırın.
      Not: santrifüj kapasitesi değil. Derhal 5.3.3 adıma gidin.
    3. Şimdi 700 µL örnek aracılığıyla akış toplamak için 2 mL toplama tüp yerleştirilir bir elüsyon filtre kartuşu aktarın. Santrifüj 15 ≥ 8.000 x gs. Akışı aracılığıyla atın.
    4. Bu yeni bir 2 mL Koleksiyonu tüpüne elüsyon filtre kartuşu koyarak işlemi yineleyin. Filtre Kartuşu ve santrifüj 15 500 µL hafif yıkama arabelleği eklemek filtre kartuşu membran yıkamak için ≥ 8.000 x g s. Akışı aracılığıyla atın. Toplama tüp 5.3.5. adımda yeniden.
    5. Şimdi aynı örnek tüp kullanarak başka bir 500 µL % 80 etanol için filtre kartuşu ekleyin. Bu sefer tüp ≥ 8.000 x gde 2 dk santrifüj kapasitesi. Bir sonraki adım için elüsyon spin sütun toplamak ve akış yoluyla hem toplama tüp atın.
    6. Elüsyon filtre kartuşu son adımından yeni 2 mL toplama tüp içine koymak. Bırakın kapağı üzerinde filtre kartuşu açın ve spin sütun membran kuru ve etanol önlemek 5 min için tam hızda santrifüj kapasitesi taşımak. Akış yoluyla ve toplama tüp atmak.
      Not: Rotor bir yönün nokta kapakları hasar açı önlemek için.
    7. Kurutulmuş filtre kartuşu alın ve yeni 1,5 mL toplama tüp içine yerleştirin. 14 µL RNase free su doğrudan merkeze eklemek için emin yapma kartuşu membran filtre uygulamak için RNase free su ekleyin. Santrifüj 60 s tam hızda RNA elute.
  4. Globin azaltılmış RNA örnekleri (adım 6) kalitesini değerlendirmek. MRNA numune hazırlama (7. adım) ve küçük RNA Kütüphane hazırlık (adım 8)16,17için devam edin.
    Not:-80 ° C, depolama için uzun vadeli korunması önerilir ancak Globin azaltılmış RNA örnekleri şimdi-20 ° C'de depolanabilir.

6. RNA değerlendirilmesi

  1. RNA konsantrasyonu bir spektrofotometre kullanarak ölçmek. 260 ve 280 nm dalga boyu oranını incelemek. Oranları ~ 2 veya daha büyük RNA için saf olarak kabul edilir ve bazı kirlenme alt değerleri gösterir. Araç bu oran olarak ng/µL RNA konsantrasyonu belirlemek için kullanır.
  2. RNA kalite 1 µL kullanarak değerlendirmek (100 ng) örneği uygun bir yonga üzerinde. Nihai ürün ~ 2 veya daha yüksek bir RIN ve ~ 280 zirve olmalı kütüphaneler; okumak nt mRNA tek küçük RNA kitaplıkları doruklarına 143, miRNAs için karşılık gelir.

7. Toplam RNA numune hazırlama mRNA ve uzun ncRNA kütüphaneler için zor durumda. 16

  1. Not: Elüsyon tampon ve rRNA kaldırma boncuk oda sıcaklığına getirmek. 0.2 ml ince duvarlı PCR tüpleri (tabak da kullanılabilir) önceden etiket. Üreticinin yönergeleri16tarihinde göre Protokolü adımlardan.
    1. Globin azaltılmış RNA 4 µL ile başlayın. 6 µL nükleaz ücretsiz su, 5 µL rRNA bağlama arabellek ve 5 µL tüp (1st tüp) başına rRNA kaldırma karışımı ekleyin. Pipet karıştırmak ve yeniden kap. Thermocycler kapaklı 100 ° C ısıtılmış-5 dk 68 ° C. Kaldır bölümündeki ve 60 oda sıcaklığında bırakın s.
    2. RRNA kaldırma boncuk girdap tarafından resuspend; Yeni (2nd) PCR tüp boncuk 35 µL ekleyin ve 1st tüpler üzerine boncuk 2nd tüpler içinde örnekten pipet. 2nd PCR Tüp 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. 7 dk. için manyetik stand üzerine yerleştirin.
      Not: Her örnek için en uygun rRNA tükenmesi pipetting tarafından iyice karıştırın. Stand tüpte yetiştirme/Lowering ayrılık süreci hızlandırmak yardımcı olabilir.
    3. Transferi 2nd PCR tüp süpernatant eşleşen 3rd PCR tüp ve yer manyetik açmak için sadece boncuklar tüp taraf için taşınmaz transfer yeni bir PCR tüp içine en az 60 s. tekrar için stand.
    4. Mix örnek arıtma boncuk girdap tarafından; 99 µL her 3rd PCR tüp ekleyin. 15 dk. yer 5 dakika süreyle manyetik stand için oda sıcaklığında emin olun boncuk hamle iki taraf için de oturmak için izin verir. Pipet süpernatant atmak için.
    5. 3rd tüp manyetik kürsüye ayarla tutun. 200 µL % 70 etanol iken boncuk dürtükleme değil dikkatli olma ekleyin. En az 30 s ve pipet süpernatant atmak için oturmak için izin verir. Adımı yineleyin.
    6. Örnek manyetik stand 15 dakika oda sıcaklığında kurumasını sağlar. 5 için kiti elüsyon arabellek santrifüj kapasitesi 600 x gs. Tüpü çıkarması ve iyice karıştırma elüsyon arabelleği 11 µL ekleyin. Bankta 2 dk sonra en az 5 dakika oda sıcaklığında manyetik stand için kuluçkaya.
    7. 8,5 µL süpernatant ile 3rd bir yeni (4thiçin) aktarım PCR tüp. Elute/Prime/parça yüksek Mix 8,5 µL Seti'nden ekleyin. İyice karıştırın. Kap ve bir thermocycler önceden ısıtılmış ile kapak 94 ° C'de 8 min için 4 ° C'de tutun bir yere Kaldır ve santrifüj kısaca.
  2. İlk Strand cDNA sentez
    1. İlk strand sentez karışımı oda sıcaklığında gelip 600 × g 5 s. Transfer 50 µL transkriptaz, için de ilk strand sentez karışımı içine santrifüj kapasitesi Takımı'ndan izin. Ters transkriptaz ilk sentez 1:9 oranında strand eklenebilir.
    2. Kombine transkriptaz 8 µL pipet/sentez karışımı ile örnek 4 tüp içine ilk strand. Kap ve 600 x g için 5 s. yer thermocycler önceden ısıtılmış kapaklı 100 ° C'de ayarla santrifüj kapasitesi İçin çalıştırın: 25 ° c, 42 ° C, 70 ° C'de 15 dk, 15 dk 10 dk sonra 4 ° C'de dinlenme ~ 25 µL iyi başına son birimdir. Hemen sonraki adıma geçmek.
  3. İkinci Strand cDNA sentez
    1. Son onarım reaktif (hata) ve ikinci Strand Mix (SSM) Oda sıcaklığına getirmek ve 5 Mix ERR resuspension arabellek ile 1:50, s. için de 600 x g santrifüj kapasitesi seyreltme. 4th tüp çıkarın ve seyreltilmiş ERR 5 µL ve SSM 20 µL her ekleyin; Pipet iyice karıştırın. Son hacim ~ 50 µL ds cDNA.
    2. Kap ve 16 ° C'de 1 saat içinde thermocycler kuluçkaya Döngüsü tamamlandığında, caps kaldırmak ve tezgah üstüne oda sıcaklığına gelmesini sağlar.
  4. DS cDNA temizlik adım
    1. Katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon (SPRI) paramagnetic boncuk tarafından girdap karışımı ile başlar. Örnek 4thtüp (ds cDNA) boncuk 90 µL aktarmak ve karıştırın. ~ 5 min için manyetik stand için 15 dakika oda sıcaklığında oturmak 140 µL. izin ver tüpler kuluçkaya son birimdir. ~ 135 µL süpernatant, her kuyudan çıkarın. Orada 5 µL her kuyuya yaptı gerekir.
    2. Tüp manyetik kürsüye bırakın ve 200 µL % 80 etanol ekleyerek yıkayın. 30 s sonra Kaldır ve atma süpernatant için oturmak için izin verir. Yıkama adımı yineleyin. Tüpler manyetik stand kuru olanak verecek şekilde 15 dakika bırakın.
    3. Resuspension arabellek 600 x g 5, santrifüj kapasitesi oda sıcaklığına geliyor sonra s. Tüpler standından kaldırın. 17,5 µL resuspension tampon tüp aktarmak ve karıştırın. 2 dk sonra 5 min için manyetik stand taşımak için tezgah üstüne kuluçkaya tüpleri ver.
    4. 15 µL olan yeni ince duvarlı set (5inci), 0.2 mL tüpler için ds cDNA örnekleri içeren süpernatant pipet. Hemen sonraki adıma geçmek veya mühür ve -15 ° c-25 ° C ile en fazla 7 gün için saklayın.
  5. Adenilat 3' biter.
    1. Oda sıcaklığında resuspension arabelleği 2.5 µL örnek tüpüne pipet sonra 12.5 µL çözdürülen A-takip karışımı ekleyin. Tamamen pipetting tarafından karıştırın.
      Not: A-takip denetimi kullanılır.
    2. Kap ve 100 ° C önceden ısıtılmış kapaklı bir thermocycler kuluçkaya. Sonra 70 ° C'de ısıtılmış kapak ile 5 min için 30 dk 37 ° C'de çalıştırın. Thermocycler 4 ° C'de dinlenmek izin
  6. Dizin adaptör ligate
    1. RNA adaptör tüpler ve durdurmak ligasyonu arabellek karışımı oda sıcaklığına getirmek. Her biri için 600 x g 5 s. bırak ligasyonu karışımı derin dondurucu için de kullanım için hazır kadar santrifüj kapasitesi. Örnek dizin oluşturma için düzenleme havuzu bilinmesi gerekir.
    2. Resuspension arabellek 2.5 µL ve 2.5 µL ligasyonu karışımı her örnek tüp ekleyin. Şimdi doğru RNA adaptör 2.5 µL içinde her örnek tüpüne pipet. Adaptörü seçimi seçilen kit için üretici yönergelerine göre yapılmalıdır.
    3. Recap ve 280 x g, 1 dk aralıklarla tarafından karıştırın. Termal cycler 30 ° C'de 10 dakika içinde kuluçkaya Tüp ligasyonu arabelleği durdurmak 5 µL reaksiyonu durdurmak ve iyice karıştırın için örnek ekleyin.
    4. Begin SPRI paramagnetic boncuk boncuk her tüp için 60 s. 42 Transfer µL için girdap tarafından karıştırma tarafından temizlik. Mix thoroughlythen kuluçkaya tezgah üstüne 15 dakika.
    5. Tüpler manyetik standına taşımak ve sıvı döner (~ 5 dk) temizleyene kadar bırakın. Bir kere net kaldırmak ve süpernatant ile 79,5 µL atın. Tüpler manyetik kürsüye bırakın ve 200 µL % 80 etanol ekleyerek yıkayın. En az 30 s sonra Kaldır ve atma süpernatant için oturmak için izin verir. Yıkama adımı yineleyin. Manyetik stand kurutma için izin vermek ek ~ 15 dakika bırakın. Boncuk yıkama adımları sırasında bozmak değil.
    6. Resuspension arabellek 52,5 µL örnek tüp ve boncuk tamamen yeniden askıya kadar karıştırın. Tezgah üstüne 2 min için kuluçkaya. Hareket örnek tüp sıvı kadar manyetik stand başa açıktır (~ 5 dk).
    7. Kürsüye bırak ve yavaşça 50 µL, yeni (6th) süpernatant pipet tüpler. Vortexed SPRI boncuk 50 µL ekleyin. 15dk için tezgah üstüne kuluçkaya olanak sağlar.
    8. Manyetik standına taşımak ve sıvı döner (~ 5 dk) temizleyene kadar kalın plaka izin. 5 µL her tüpün içinde bırakarak atma 95 µL of süpernatant.
    9. Tüpler manyetik kürsüye bırakın ve 200 µL % 80 etanol ekleyerek yıkayın. Tüp için 30 oturmak izin s sonra kaldırmak ve süpernatant atın. Yıkama işlemi yineleyin. Tüpler 15dk için manyetik stand kuru izin.
    10. Resuspension arabellek 22.5 µL içinde ve boncuk askıya kadar karıştırın. 2 min için bankta kuluçkaya sonra sıvı döner açık kadar manyetik stand için (~ 5 dk) taşıyın. Örnek 20 µL PCR yeni tüpler (7th) içine pipet.
  7. Gerekli seti bileşenleri oda sıcaklığına getirmek. 5 µL PCR astar mix ve 25 µL PCR ana Mix seti için örnek için transfer (7inci PCR tüp) içeren dizin oluşturulmuş örnekleri. Örnek ve kap tüp karıştırın.
    1. Termal cycler önceden ısıtılmış kapaklı tüpler yerleştirin. Programı çalıştırın: 98 ° C 30 s sonra 15 devredir 10 98 ° c s, 30 60 ° C s, 30 72 ° C s, 5 dk. tutun 4 ° C'de 72 ° C
  8. Örneklerini birleştirmek için 50 µL tüp örnek ve pipet yeterince karışık SPRI boncuk ekleyerek temiz. 15dk için tezgah üstüne kuluçkaya tepki sağlar.
    1. Tüp manyetik bir stand için hareket ve sıvı döner (~ 5 dk) temizleyene kadar kuluçkaya. 5 µL her tüpün içinde bırakarak atma 95 µL of süpernatant.
    2. Tüp manyetik kürsüye bırakın ve 200 µL % 80 etanol ekleyerek yıkayın. En az 30 s ve sonra Kaldır ve atma süpernatant için oturmak için izin verir. Bu yıkama işlemi tekrarlayın. Manyetik stand kuru olanak verecek şekilde 15 dakika bırakın.
    3. Resuspension arabellek 32,5 µL içinde ve boncuk tamamen yeniden askıya kadar karıştırın. 2 min için bankta kuluçkaya sonra sıvı döner açık kadar manyetik stand için (~ 5 dk) taşıyın. 30 µL örneği her tüp yeni bir PCR tüp pipet.
    4. DNA miktar ve kalite 6.1 ve 6.2 uygun çip ile adımları tekrar ederek değerlendirmek. Adım (adım 9) havuzu için devam.

8. küçük RNA Kütüphane hazırlık sncRNAs. 17

Not: üretici talimatları17tarihinde göre Protokolü adımlardan.

  1. Küçük RNA Kütüphane hazırlık ~ 220 ile başlamak ng - ~1.1 µg / µL globin azaltılmış RNA'ın örnekleri (4 µL).
  2. Adaptör ligasyonu
    1. 3'-adaptör 1 µL adaptör, nükleaz ücretsiz su 2 µL ve globin azaltılmış RNA örneği 4 µL iyice karıştırarak ligate. 70 ° c 2 min için kuluçkaya ve hemen buza koyun.
    2. 2 tüp ligasyonu arabellek x 10 µL ekleyin ve 3 µL ligasyonu enzim Mix, mix ve 16 ° C 18 h için kuluçkaya.
      Not: Artış örnek kuluçka süresi 18 saat daha düşük sıcaklık 16 ° c için çalışmalar metillenmiş RNA türleri, piwi RNA'ların gibi ilgi için önerilir. Kuluçka uzun tüp ligasyonu verimliliği sınıfı değişiklikler nedeniyle 3' adaptör ligasyonu evre sırasında sağlar.
    3. Ters transkripsiyon astar 1 µL nükleaz ücretsiz su 4,5 µL içinde aşırı 3' adaptör adaptör-dimer oluşumunu önlemek için ligasyonu karışıma ekleyin.
    4. 4 ° C'de ısıtılmış bir termal cycler 75 ° C, 37 ° C, 25 ° c, 15 dk, 15 dk, 5 dk için programlanmış kuluçkaya basılı tutma
    5. Önceden seyreltilmiş 5'-adaptörü 2 min için 70 ° c termal cycler örnek başına 1 µL tabiatını ve hemen buza koyun.
    6. Denatüre 5'-adaptör 1 µL, 10 x 5' ligasyonu arabelleği 1 µL ve 5' ligasyonu enzim 2.5 µL ekleyin. Mix ve 25 ° C için 1 h kuluçkaya.
  3. cDNA sentez ve güçlendirme
    1. 5 ' / 3 '-adaptör-bakmaksızın RNA, ilk iplikçikli arabelleğinin 8 µL, 1 µL RNase inhibitörü ve transkriptaz 1 µL pipetting 30 µL tarafından iyice karıştırın. 50 ° C 60 dk. ilerle hemen PCR güçlendirme için karisimin kuluçkaya veya ısı 15dk için 70 ° C'de tepki devre dışı bırakın ve -20 ° C'de depolayın
    2. Ters transkriptaz tepki 50 µL PCR ana Mix, RNA PCR astar, 2.5 µL eklemek belirlenen RNA PCR astar Dizin örnek, 2.5 µL ekleyerek 40 µL PCR yükseltmek ve nükleaz ücretsiz su toplam hacmi 100 µL. pipetting tarafından karıştırın. PCR aşağıdaki Bisiklet koşullarını kullanarak termal cycler içinde çalıştırın: 30 94 ° C'de ilk denatürasyon s; 11 94 ° C devredir 15 30 s ve 70 ° c 15 uzantısı için 62 ° C'de tavlama s, s; 70 ° c 5 min için son bir uzantısı ardından; örnekleri 4 ° C'de cycler tarihleri arasında.
    3. Not: Örnek havuzu oluşturma amacıyla dizinler eklenir.
  4. Örnek temizlik
    1. DNA temizleme seti için bağlama arabellek 500 µL ekleyin (5 M Gu-HCl, % 30 isopropanol) 100 µL PCR spin-sütun membran için verimli bağlamasını etkinleştirmek için güçlendirilmiş örneği için.
      Not: bağlama arabellek dahil pH göstergesi kontrol varsa karışım rengini sarı olur.
    2. Pipet 600 µL karışımı örnek ve bağlayıcı arabelleğe filtre kartuşu bir 2 mL toplama Tüp, 30-60 s 17,900 x g masa üstü bir santrifüj içinde de tur içinde. Akışı aracılığıyla atın.
    3. 30-60 s 17,900 x g masa üstü bir santrifüj, iplik ve akışını atarak 0.75 mL sağlanan seti yıkama arabelleği (10 mM Tris-HCl pH 7.5, % 80'i etanol) ile aynı toplama tüp içine filtre kartuşu yıkama-den geçerek. İçin ek bir 60 kuru filtre kartuşu spin s.
    4. Filtre kartuşu bir temiz 1.5 mL toplama tüpü yerleştirin. 30 µL elüsyon arabelleği (10 mM Tris-HCl pH 8,5), izin için 60 stand sütun Ekle s ve sonra spin 60 için masa üstü bir santrifüj 17,900 x g s.
  5. Örnek kalite uygun DNA çip ile 6.1 ve 6.2 adımları tekrar ederek değerlendirmek. Adım (adım 9) havuzu için hareket.

9. örnek sıralama için havuzu oluşturma

  1. Havuzu barkodlu ve kurulum ve mRNA ya da ncRNA örnekleri içeren yeni tüpler (veya 96 iyi PCR plaka) etiketleme tarafından QC'ed örnekleri. Her barkodlu 10nM kitaplığının 13 µL karşılık gelen borular (veya yeni plaka wells) üreticisinin yönergeleri16,17başına aktarın. Sıralama için havuza alınan örnek, örnekler aynı çipte çalışmasına benzer okuma uzunlukları seçin emin olun.

Sonuçlar

Bizim çalışma temsilcisi örneklerinde globin ve ribo tükenmiş tam kan örnekleri vardır. Globin tükenmiş Kütüphane örneği bir sayıyla RNA bütünlüğü (RIN) 7 (Şekil 1bir) ve 260/280 nm konsantrasyon oranlarının ya da 2 (Şekil 1b ve 1 c) üzerinde yukarıda protokol temsilcisi sonucu oluşur. Doğrulama örnek sonucu her kitaplık son konsantrasyonu vermek için spektrofotomet...

Tartışmalar

En iyi duruma getirilmiş yapılan protokolündeki ilk kritik adım kalite okuma tam kan örnekleri almak mümkün kılan eklenen globin tükenmesi adımları dahil. Bir tam kan sıralama çalışmalarda kullanma en büyük sınırlamalar globin moleküller için harita ve ilgi18diğer moleküller için harita okuma azaltmak okuma örnek sayısının fazlalığı vardır. Bu nedenle, bizim örnek türü için protokol optimize içinde en yüksek olası mRNA ve kodlamayan RNA aracılığıyla sıra...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Ticari adlar veya ticari ürünler bu makalede söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya ABD Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işveren olduğunu.

Teşekkürler

Bu eser esas olarak tarafından desteklenmiştir USDA NIFA Engelleyeceğiz 2013-67015-21236 tarafından ve kısmen USDA NIFA Engelleyeceğiz 2015-67015-23216 tarafından. Bu çalışmada kısmen randevu Tarımsal Araştırma hizmet araştırma katılım bilim ve eğitim (ORISE) için bize Enerji Bakanlığı (arasında arası bir anlaşma ile Oak Ridge Enstitüsü tarafından yönetilen programı tarafından desteklenen DOE) ve ABD Tarım Bakanlığı. ORISE Hayır DOE sözleşme altında Oak Ridge Associated üniversiteler tarafından yönetilir. DE-AC05-06OR2310.

Dr. Kay Faaberg HP-PRRSV bulaşıcı klonlar, Dr Susan Brockmeier için ona yardım hayvanlarla denemede yer ve Sue Ohlendorf yazının hazırlanmasında sekreterlik yardım için teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
PAXgene TubesPreAnalytix762165
Molecular Biology Grade WaterThermoFisher10977-015
mirVana miRNA Isolation KitThermoFisherAM1560
Rneasy MinElute Clean Up KitQIAGEN74204
100% EthanolDecon Labs, Inc.2716
0.2 mL thin-walled tubesThermoFisher98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubesAny supplier
Veriti 96-well ThermocyclerThermoFisher4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1)Any supplierSequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2)Any supplierSequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1)Any supplierSequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2)Any supplierSequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
-KClMillipore Sigma60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6Fisher ScientificBP1757-100
 -DTTThermoFisherY00147
 -MgCl2PromegaA351B
 -Molecular Biology Grade WaterThermoFisher10977-015
RNase HThermoFisherAM2292
SUPERase-INThermoFisherAM2694Rnase inhibitor
EDTAMillipore SigmaE7889
MicrocentrifugeAny supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer InstrumentAgilent TechnologiesG2938C
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent Technologies5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  KitAgilent Technologies5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero IlluminaRS-122-2201mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation GuideIlluminaAvailable on-line
RNAClean XP BeadsBeckmanCoulterA63987
AMPure XP BeadsBeckmanCoulterA63880
MicroAmp Optical 8-tube StripThermoFisherN80105800.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip CapThermoFisherN801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirsAny supplier
SuperScript II Reverse TranscriptaseThermoFisher18064-014
MicroAmp Optical 96 well platesThermoFisherN8010560These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive filmThermoFisher4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) New England BiolabsE73005small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) New England BiolabsE75805small RNA kit
QIAQuick PCR Purification KitQIAGEN28104
96S Super Magnet PlateALPAQUAA001322

Referanslar

  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
  3. Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
  4. Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
  5. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  6. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  7. Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  8. Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
  9. Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
  10. Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
  11. Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
  12. Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
  13. Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
  14. . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
  15. . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
  16. Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
  17. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
  18. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 141mRNASigara kodlama RNARNA Seqtam kanepigenetikGlobin azaltma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır