אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Summary

בנייר זה, אנו שואפים לתאר את הביצועים של הטכניקה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות ויישומו בחקר הפיזיולוגיה של זרע.

Abstract

ברבייה מינית, תא רבייה גברית או תא הזרע בין עם תא רבייה נקבה על הפריה. עם זאת, מספר רב של תאי זרע בעלי יכולת להפרות נדרשים לקיים אינטראקציה עם תא רבייה נקבה כדי לוודא הפריה. ככזה, היכולת המפרה של תאי זרע בודדים הוא קריטי עבור רבייה מוצלחת. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות ניצל במשך כמה עשורים כשיטה לשחזור מהיר, יעיל, אפקטיבי, וישימה מאוד לאסוף רק באיכות גבוהה הזרע כדי לשמש הטכנולוגיה סייעה הרבייה. הפרוטוקולים שאנו המתואר במסמך זה מתמקדים הניצול של הטכניקה הדרגתיות צנטריפוגה (PDGC) צפיפות Percoll רציף כדי לבודד שלוש אוכלוסיות נפרדות של זרע רוסטר מאת האיכות שלהם. הצלחנו לאסוף נמוך - בינוני, זרע באיכות גבוהה. אנו מתארים גם פרוטוקולים לשחזור שכרוכים הקובע פוטנציאל הפוריות של זרע על-ידי הערכת הכדאיות שלהם, ניידות, חדירות. אוסף של זרע על ידי איכות שלהם בטכניקה PDGC להיות שימושי במדויק, ביסודיות לאפיין זרע עם פוטנציאל דיפרנציאלית פוריות.

Introduction

גולגולת, זכר גמטות עוברים אינטנסיבי הלחץ הסלקטיבי; לכן כושר הרבייה של הזכר הוא מרכזי להשגת הפריה מוצלחת. הזכרים של כל מין חוליות נתון חייב להיות מסוגל לייצר תאי זרע בכמויות גדולות ושל באיכות טובה דיה על מנת לענות על הצרכים של הפריה. תאי זרע, יש ראש הזרע והן של שוטון, הם התאים מקוטב ביותר בגוף. הם גם מאוד הטרוגנית באיכות הזרע (נמוך בשידור חי ולא מת, מורפולוגית נורמלי חריג ואני משותק, ניידים וגבוה ניידים), אשר מתגלה וריאציה רחב יעילות הרבייה של הזכרים. גדול יותר חלקם של זרע באיכות גבוהה, פחות המספר של matings נדרשים בהצלחה להפרות את הביצית. עם זאת, כדי להשיג פוריות, תאי זרע נורמלי מורפולוגית להסתמך על כוחות-חליפת שנוצר על ידי שוטון שלהם כדי להגיע לאתר של הפריה גם כדי לחדור את zona pellucida¹ (מסוג ZP; במקרה של יונקים) או perivitelline הפנימי שכבה² (IPVL; במקרה של ציפורים וזוחלים) של הביצית לאחר ההזדווגות טבעי או הזרעה מלאכותית (AI). קביעת זרע באיכות הדרושים לשימוש בטכנולוגיות הרבייה בסיוע³ (אמנות), בחירה של הרבייה הזכרים כדי לשמש AI תוכניות⁴. מצד שני, ההצלחה של אמנות מתבססת אך ורק הערכה מדויקת של איכות הזרע. מספר בדיקות מעבדה פותחו כדי לקבוע את המאפיינים הפונקציונליים של זרע. הפרמטרים החשובים ביותר הם זרע-מורפולוגיה, הכדאיות, ניידות, capacitation (זרע העופות אינן דורשות capacitation⁵), תגובה acrosome (AR; אקסוציטוזה, שחרור של אנזים הפרוטאוליטי acrosome הראש זרע), זרע חדירה מסוג ZP או IPVL, הפריה^{6,7,8,9,10,11}. מדדי פריון לבד אינם מספקים הערכה מדויקת של היכולת המפרה של האוכלוסייה זרע¹¹. מדדים של מספר האירועים שהובילו הפריה של ביצית לאפשר ייצוג הולם של הביצועים של הפרט spermatocytes⁷.

המתודולוגיה פיתח למדידת תפקוד הזרע הוא בעיקר ספציפית. לדוגמה, זרע העופות, הכדאיות, ניידות, חדירה של IPVL הם הפרמטרים הנפוץ ביותר להערכת זרע באיכות^8,11,12. המספר של זרע חי ב השפיכה ממלא תפקיד מכריע להישרדותה של הזרע כי הנוכחות של מספר גדול של הזרע מת ב הזרע משפיע על איכות הזרע. זה מגביר את הייצור של מינים חמצן תגובתי ב הזרע וגורם נזק חמצוני זרע חיים¹³. זרע ניידות, יכולת השוטוניים תנועת הזרע העופות נגד התנגדות בטמפרטורה של הגוף, ידוע כדי לשחק תפקיד ישיר מביא על הפריה⁸. היא מבוססת היטב כי ניידות בקורלציה חיובית עם פוריות, ולכן, דטרמיננטה העיקרי של פוריות⁸. עם זאת, זרע נייד צריך גם את היכולת לעבור על AR לחדור IPVL¹¹. מבחני חדירה IPVL לקחת בחשבון עבור כל זרע המשתתפת בתהליך ההפריה¹¹.

ביישום של אמנות, לפלוט מעובד בדרך כלל על מנת למקסם את הריכוז של זרע באיכות גבוהה, למזער את הריכוז של זרע באיכות נמוכה. לאחר איסוף זרע, יכול להעשיר את הפרופורציה של זרע באיכות גבוהה באמצעות הליכים הפרדת זרע נפוץ בשיטות המחקר והתעשייה. רבים של הליכים אלה פותחו, כל עם הטבות בהתאמה, מגבלות, אך כל לנצל את הטבע הטרוגנית של הזרע כדי לאסוף רק את הזרע עם יכולת גבוהה המפרה. הליכים אלה כוללים שיטות ההעברה זרע, סינון העמודה הדבקות, צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (DGC)^{14,15,16,17,18,19 , 20}. בין הטכניקות הזמינות, DGC נמצאה להיות מאוד פשוטים, הדיר, חסכונית ויעילה לבודד את הסכום המקסימלי של זרע באיכות גבוהה לשימוש באמנות במטרה למקסם את הסיכוי הפריה^{14 , 15}. בנוסף, DGC אינו מזיק קרום תא הזרע. לעומת זאת, שיטות ההעברה זרע לאסוף זרע רק בהדרגה ניידים^18,19, אבל כמות הזרע שנאסף הוא נמוך מאוד, שהופך אותו לא יעיל באיסוף כמויות גדולות של זרע^{18, 20}. הדבקות בעמודה סינון יעיל מאוד של סינון הזרע ניידים במיוחד של זרע¹⁷; עם זאת, הוא נוטה להיות מזיק זרע ממברנות^20,21.

בשיטה DGC, המצע הנפוץ ביותר ליצירת מעבר הצבע צפיפות הוא Percoll, אשר מורכב של סיליקה colloidal חלקיקי מצופה polyvinylpryrolidone. Percoll צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (PDGC) יכול להיות רציף או מקוטע אבל הדרגתי מקוטע משמשת בעיקר לבידוד תשואה גבוהה של זרע ניידים במיוחד^13,16,20. ב הדרגתי מקוטע, מדיה צפיפות נמוכה יותר צף מעל מדיה צפיפות גבוהה יותר, יצירת מעבר צבע מגבירה צפיפות מהחלק העליון לחלק התחתון של צינור חרוטי. פעולה זו יוצרת גבולות בין התקשורת שני של צפיפות שונות. היעילות של PDGC נגזרת בשני גורמים: 1) היכולת-חליפת בין 2) הנטייה של תאי זרע בעלי שלמות מבנית גבוהה יש צפיפות מוגברת של תאי זרע בודדים. זרע עם ניידות גבוהה יותר טובים מסוגלים לחצות ממדיה צפיפות נמוכה יותר, לחדור לתוך בתקשורת צפיפות גבוהה יותר. זרע ניידות נמוכה יותר נוטים יותר להיות לכודים על הגבול שנוצר על ידי הממשק בין המדיה של צפיפות שונות. תאי זרע בעלי שלמות מבנית גבוהה וניידות נוטים להיות בעלי צפיפות גבוהה יותר מאשר מת, לא תקין או נמוך תאי זרע ניידים. כאשר כוח צנטריפוגלי מוחל ב PDGC, זה מקל על תנועת הזרע בצפיפויות שונות למקומן המתאים המילוי ההדרגתי.

בפועל כללית, לאחר PDGC מבוצע, בגדר רך של זרע עם פוטנציאל בחלק התחתון של צינור חרוטי גבוה פוריות נאסף, היתרה נמחקת. עם זאת, יש יתרון חקלאות לא מנוצלים של טכניקה זו היא היכולת שלה להפריד בין תאי הזרע לתוך מספר קבוצות מבוסס על ההבדלים באיכות. למטרות מחקר, הפרדת זרע על ידי מידת איכות ניצול הטכניקה PDGC מאפשר לימוד של איכות הזרע כפי שהוא נוגע להבדלים הפיזיולוגיות, metabolomic ופרוטיאומיה מבנית. כאן, אנו שואפים לפרט איך טכניקה זו עשוי לשמש כדי להפריד את הזרע על-ידי איכות, כמו גם להדגים את ההבדלים באיכות, באמצעות צביעת חיוני אאוזין שנקבעו קודם-nigrosin, עבור הכדאיות, Accudenz assay ניידות, זרע-IPVL האינטראקציה assay עבור חדירות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה של גאורגיה.

1. שטיפה באמצעות צנטריפוגה מסורתי

1. להכין את בופר פוספט (PBS). הוסף 8.0 גר' NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, 1.44 g של Na-₂-HPO-₄ ו- g 0.24₂פו ח'₄ 800 מ ל מים מזוקקים (dH₂O). להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 0.1 N HCl ולהביא את הפתרון 1 ליטר באמצעות dH₂O.
2. להכין מאגר תנועתיות. להוסיף 6.5 גרם של NaCl, 4.5 גר' גלוקוז, 0.444 g CaCl₂ ו- 11.5 g של N - טריס-[hydroxymethyl] חומצה מתיל-2-אמינו-ethanesulfonic (מלון טס) 800 מ של dH₂O. להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 1 M NaOH ולהביא את הפתרון 1 ליטר באמצעות dH₂O.
3. פיפטה 0.5 מ של זרע לתוך צינור פוליפרופילן microcentrifuge. מוסיפים 1.0 מ"ל של PBS ומערבבים בעדינות.
4. צנטריפוגה ב g x 1,500 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר זרע עם PBS עד 1.5 מ ל.
5. צנטריפוגה ב 1,500 x g 10 דקות ב- RT. Resuspend הזרע גלולה עם תנועתיות מאגר עד 0.5 mL.

2. ביצוע הטכניקה PDGC

הערה: בצע את התהליך כולו של PDGC בטמפרטורת החדר.

1. להפוך מ 3.0 ל- 1.08 גרם/mL ופתרונות Percoll 1.07 g/mL שני צינורות נפרדת.
   1. במבחנה נקי, להוסיף 1.712 מיליליטר 1.13 g/mL Percoll המקורי עד 0.3 מ"ל של 1.5 M NaCl פתרון. מוסיפים 0.988 מ ל dH₂O ומערבבים על ידי היפוך עדין לעשות מ 3.0 ל- 1.08 גרם/mL צפיפות פתרון.
   2. במבחנה נקי, להוסיף 1.482 מיליליטר 1.13 g/mL Percoll המקורי עד 0.3 מ"ל של 1.5 M NaCl פתרון. מוסיפים 1.218 מ ל dH₂O ומערבבים על ידי היפוך עדין לעשות מ 3.0 ל 1.07 g/mL צפיפות פתרון.
2. במבחנה נקי, לדלל 1.0 מ"ל של זרע מדגם 1:2 מ ל 2.0 ל- PBS. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
3. Pipet מ 3.0 ל הפתרון צפיפות 1.07 g/mL לתוך צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל. בזהירות pipet מ 3.0 ל הפתרון צפיפות 1.08 גרם/mL מתחת הפתרון צפיפות 1.07 g/mL. ודא כי שתי שכבות לא לערבב. לונג-טופס (9 אינץ ') פסטר פיפטה יכול להקל על שלב זה.
4. Pipet מ 3.0 ל מדולל זרע מדגם overtop את PDG. כדי להבטיח כי דגימת הזרע לא לערבב עם PDG, להטות בעדינות את צינור חרוטי המכיל את PDG בזווית של 45°. Pipet המדגם לאורך החומה של הצינור ולאפשר לו לזרום דרך צינור ושוב את PDG.
5. להכין את שפופרת ריק כדי להתאים את המסה של PDG עם דגימת הלשונית. Centrifuge שני צינורות ב 1500 x g עבור 20 דקות יש מקפידים על מעבר הצבע מקוטע בעת העברת הצינורות מהספסל את האיזון ולאחר מכן לצנטריפוגה.
   הערה: אין להשתמש בבלמים בסוף צנטריפוגה.
6. צפו בתוצאות. ודא כי שלוש שכבות נפרדות זרע נוצר הצינור, כפי שניתן לראות באיור1.
7. האחות זרע מבודד שכבות עם פיפטה. לאסוף את השכבה העליונה של זרע קודם, באמצע שכבה שנייה, והאחרונה בגדר קשה בתחתית הצינורית. להעביר לכל נקי, סטרילי פוליפרופילןצינור microcentrifuge.
8. לדלל כל מדגם 1.5 מ עם PBS. צנטריפוגה ב g x 1500 למשך 10 דקות.
9. יוצקים את תגובת שיקוע. לשקם צניפה זרע עם תנועתיות מאגר מאת pipetting עדין.
   הערה: צפיפות אלטרנטיבית עשוי לשמש לצרכים החוקר. לקבוע כמויות החומרים בשימוש עם המשוואה הבאה, איפה v₀ נפח של צפיפות מניות פתרון להשתמש, v הוא נפח סופי של הפתרון הרצוי, p הוא צפיפות של פתרון צפיפות הסופי הרצוי ו- p₀ היא הצפיפות של צפיפות מניות פתרון:
   
   השתמש תמיד mL 0.3 של 1.5 M NaCl בהכנה של צפיפות פתרונות כדי להתאים את NaCl הריכוז של תמיסת מלח פיזיולוגית.

3. קביעת איכות הזרע

1. חשב שריכוז הזרע כאמור תיאר²².
2. לבצע eosin-nigrosin חיוני מכתים כמו שתואר לעיל¹² עם השינויים הבאים:
   1. להכין µL 100 של פתרון הזרע ריכוז עונה 1 פרק 10⁸ תאים/מ ל....
   2. Pipet 50 µL של פתרון הזרע צינור פוליפרופילן microcentrifuge המכילים אמצעי אחסון שווה של eosin nigrosin כתם. דגירה את התערובת למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. המקום µL 20 טיפת דגימת זרע מוכתם בקצה אחד של זכוכית, למרוח בצורה אחידה באופן דומה לזה המשמש לדם מטושטש. מילה נהדרת השקופיות מרוח בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
   4. להתבונן על השמצות תחת מיקרוסקופ. לספור את כמות הזרע בשידור חי (ללא כתמים), הזרע מת (מוכתם ורוד) ולחשב את האחוז של זרע בשידור חי.
3. לבצע את הבדיקה Accudenz, כאמור תוקף של הזרע עוף, להעריך באופן אובייקטיבי את הניידות זרע⁸ עם השינויים הבאים:
   1. Pipet 1.0 מ"ל של 6% assay פתרון לתוך וואקום פוליסטירן, כמופיע באיור2. דגירה עד 41 מעלות צלזיוס.
      הערה: 41 ° C משמש כדי להתאים את הטמפרטורה הפנימית של תרנגולת. הטמפרטורה הדגירה צריך להתאים את זה של מערכת הרבייה הנשית של המין נחקר.
   2. כיסוי הפתרון assay טרופה עם 100 µL זרע מדגם-ריכוז של 5 x 10⁸ תאים/מ ל....
   3. המקום המכיל cuvette בשכבות זרע מדגם ספקטרופוטומטרים. להקליט את הערך ספיגת 550 ננומטר.
4. לבצע חדירה-IPVL assay כפי שתואר לעיל¹¹ עם השינויים הבאים:
   1. לחתוך חתיכה (0.5 ס מ x 0.5 ס מ) של אזור דיסק שאינו נבטי IPVL ללא פגע.
   2. להתאים את ריכוז הזרע 4 x 10⁶ תאים/מ ל...
   3. דגירה זרע במאגר תנועתיות עם IPVL ב בקבוקון זכוכית קטן למשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כמופיע באיור3.
   4. לטבול את החתיכה IPVL ב 3% NaCl לעצור את האינטראקציה בין IPVL לבין הזרע.
   5. הר החלק IPVL שקופיות מיקרוסקופ, הכתם עם שיף ריאגנט של 10 דקות לאחר קיבוע עם פורמלין 10% 20 s.
   6. לבחון את IPVL תחת מיקרוסקופ לזרע מוצלחת חדירה חורים, לספור את כל החורים גלוי לכל 0.25 מ מ² -40 X הגדלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הטכניקה PDGC הביא הפרדה ברורה של שלוש שכבות של זרע על ידי מידת איכות על פני כל הפרמטרים. זרע מפריד לשכבה באיכות גבוהה להלן הפתרון צפיפות גבוהה יותר, שכבה באיכות בינונית בין פתרון צפיפות נמוכה יותר גבוה יותר ובין שכבה באיכות נמוכה מעל התמיסה צפיפות נמוכה יותר. ההבדלים באיכות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פוריות לא רק קובעת את הרווחיות של ייצור בעלי החיים, אלא פועלת גם כאמצעי הברירה הטבעית של מינים לקיום. הפונקציה האולטימטיבי של תא זרע היא להפרות את הביצית. Oviduct של הנקבה בוחרת רק את הזרע בכושר כדי להבטיח הפריה של ביצית^23,24. מחקרים במבחנה נחשפו גם מתאם קרוב ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
Schiff’s reagent	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope	Olympus America Inc., PA, USA		No catalogue is found