密度勾配遠心法を用いた差動品質の精液採取

要約

本稿では、密度勾配遠心法と精子の生理学的研究への応用のパフォーマンスについて説明を目指します。

要約

有性生殖、雄性配偶子または精子細胞は、受精させる雌性配偶子の融合します。ただし、受精を保障する雌性配偶子と対話する能力を肥やすことで精子の数が多いが必要。など、個々 の精子の受精能力は、正常な再生のため重要です。密度勾配遠心法は、生殖補助医療に使用される質の高い精子だけを収集する再現性の高い、高速、効率的、効果的な非常に適応可能である方法として数十年間利用されています。我々 はここに記載されているプロトコルはその品質によってオンドリの精子の 3 つの異なる集団を隔離する不連続パーコール密度勾配遠心法 (PDGC) 技術の活用に焦点を当てます。低、中、高品質の精子を収集することができました。生存率、モビリティ、および透過性を評価することにより精子の決定の不妊の可能性を伴う再現性のあるプロトコルについて述べる。PDGC 技術を使用してその品質によって精子のコレクションは正確に有用であるし、徹底的に差分不妊治療の可能性と精子を特徴付けます。

概要

脊椎動物、雄性配偶子を受ける強烈な選択圧;したがって男性の生殖のフィットネス、成功受精を達成するために極めて重要です。すべての脊椎動物種の男性は、受精のニーズを満たすために十分な品質と大量に精子細胞を生成できる必要があります。精子細胞、精子頭部と、鞭毛を持つは、体内で最も偏光セルです。また、精子の質の非常に異質です (ライブと死んで、形態学的正常と異常、および不動、低モバイル、高モバイル)、男性の生殖効率の変動幅を明らかには。なるほどの正常に卵子を受精に必要な交配の数は減りますが、質の高い精子の割合。しかし、不妊治療を達成するために形態学的に正常精子細胞はオスミウム酸¹を浸透するも受精のサイトに到達する彼らの鞭毛によって生成された推進力に頼る (ZP 哺乳類の場合) または内部囲レイヤー² (IPVL の鳥類と爬虫類の場合) 次の自然交配または人工授精 (AI) 卵子の。精子を決定する品質は生殖補助医療技術³ (アート) で使用するために必要な AI で使用される繁殖の男性の選択プログラム⁴。その一方で、アートの成功はもっぱら精子の質の正確な評価に依存します。多くの検査は精子の機能の特性を決定する開発されています。最も重要なパラメーターは、精子形態、生存率、モビリティ、精子 (鳥精子受精⁵は必要ありません)、精子、精子先体反応 (AR; エキソサイトーシスと精子頭部の先体からの蛋白分解酵素の放出)ZP や IPVL、受精^{6,7,8,9,10,11}の浸透。不妊治療だけでの対策では、精子人口¹¹の受精能力の正確な評価は提供しません。受精卵が受精に至るまでいくつかのイベントの対策個別精母細胞⁷のパフォーマンスの適切な表現を可能にします。

精子機能を測定するために開発された方法論は、主に種特異的です。たとえば、鳥の精子の生存率、移動性および IPVL の浸透、精子品質^8,11,12を評価するために使用される最も一般的なパラメーター。射精のライブ精子の数は、死者の精子精液中の多数の存在が精子の質に影響するので精子の生存のための重要な役割を果たしています。これは、精液における活性酸素種の生産を高め、ライブ精子¹³に酸化的損傷を引き起こします。精子移動、体の温度、抵抗に対して鳥精子の鞭毛運動のための能力は、受精⁸について持って来ることで直接的な役割を再生する知られています。モビリティが不妊とは正の相関し、は、したがって、不妊治療⁸の主要な決定要因は、定着します。ただし、モバイルの精子には AR を受けると IPVL¹¹を貫通する能力も必要です。IPVL 浸透アッセイ受精¹¹の過程で関与するすべての精子を考慮に入れます。

アートのアプリケーションで射精は通常質の高い精子の濃度を最大化し、低品質の精子の濃度を最小限にするために処理されます。精液の採取後、業界と研究実践でよく使用される精子分離手順高品質精子の割合を濃縮することができます。これらの手順の多くが開発されているすべてをそれぞれの利点と制限事項が、すべては異種精子受精能力の高い精子だけを収集する性質を利用します。精子の移行方法、遵守列ろ過密度勾配遠心法 (DGC)^{14,15,16,17,18,19}などの手順^,20します利用可能な技術の中で DGC 非常にシンプルでコスト効果の高い、反復可能で受精¹⁴のチャンスを最大化することを目標にアート用高品質精子の最大の量を分離することで効率的に発見されました。^,15します。 さらに、DGC は精子細胞膜に有害ではないです。対照的に、精子の移行方法収集だけ徐々 にモバイル精子^18,19, が収集した精子の量が非常に低く、大量の精子^18,の収集に非効率的なこと²⁰. 付着列ろ過は精液¹⁷から機動性の高い精子をフィルタ リングで非常に効率的ただし、精子膜^20,21に害がある傾向にあります。

密度勾配を生成するための最も一般的に使用される基板は、DGC 技術 Percoll polyvinylpryrolidone でコーティングしたコロイド状シリカ粒子から成っています。連続または不連続パーコール密度勾配遠心法 (PDGC) を指定できますが、不連続勾配は機動性の高い精子^13,16,20の高収率分離でよく使用されます。不連続勾配の低い密度メディアに浮かんで高密度メディア、円錐管の底に上から密度が増加するグラデーションを作成します。これは異なる密度の 2 つのメディア間のインターフェイスに境界を作成します。PDGC の効率は 2 つの要因から派生した: 1) 個々 の精子細胞と 2) 密度が増加する構造的整合性が高い精子細胞の傾向の推進能力。高いモビリティと精子、低密度メディアからクロスし、高密度メディアに浸透することができます。低い機動性精子は異なる密度の媒体間のインターフェイスによって作成された境界に閉じ込めになるより可能性があります。高い構造健全性とモビリティの精子細胞は死んで、異常または低のモバイル精子細胞より高い密度を持っている傾向があります。PDGC で遠心力を適用すると、グラデーションの各場所に密度の異なる精子の動きこれ容易になります。

一般的な実習で PDGC を実行すると後は、円錐管の下部に潜在的な高い出生に精子の柔らかいペレットを収集すると、し、残りの部分は破棄されます。しかし、この手法の活用の利点は品質の違いに基づいていくつかのグループに精子細胞を分けるその機能です。研究用 PDGC 技術を活用した品質の程度によって精子の分離それは生理学的、メタボローム、プロテオームの違いに関係、精子の質の研究できます。モビリティ、および精子 IPVL 以前に確立されたエオシン nigrosin 生存率、生体染色、Accudenz の試金を使用して品質のこれらの違いを示すと同様、別の精子の品質によって、この手法を使用する方法の詳細をここでは、目指す透過性の相互作用アッセイ。

プロトコル

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョージアの大学によって承認されています。

1. 伝統的なの遠心分離を用いた洗浄

1. リン酸緩衝液 (PBS) を準備します。8.0 g nacl、KCl、1.44 g Na₂HPO₄と KH₂PO₄ 800 mL の蒸留水 (dH₂O) 0.24 g の 0.2 g を追加します。0.1 N HCl を使用して 7.4 に pH を調整し、dH₂o. を使用して 1 L にソリューションをもたらす
2. 運動性バッファーを準備します。追加, 塩化ナトリウム 6.5 g、4.5 g グルコース、0.444 g CaCl₂と N - トリス-[ヒドロキシメチル] 11.5 g のメチル-2-アミノ-ethanesulfonic 酸 (TES) dH₂O. 800 mL に 1 M NaOH を使用して 7.4 に pH を調整して dH₂o. を使用して 1 L にソリューションをもたらす
3. ポリプロピレン微量遠心チューブに精液の 0.5 mL のピペットします。1.0 mL の PBS を加え、軽く混ぜます。
4. 室温 (RT) で 10 分間 1,500 × g で遠心分離し、上澄みを廃棄します。PBS で精子ペレットを再懸濁します 1.5 mL。
5. 1,500 × g で RT。 精子が運動でペレットを再懸濁しますで 10 分間遠心するバッファー 0.5 mL です。

2. PDGC テクニックを実行します。

注: は、室温で PDGC の全体のプロセスを実行します。

1. 2 つの個別のチューブで 1.08 g/mL と 1.07 g/mL の Percoll ソリューションの 3.0 mL を作る。
   1. きれいな試験管に 1.13 g/mL の 1.712 mL 追加 1.5 M NaCl 溶液 0.3 mL を元 Percoll。DH₂O の mL の 0.988、1.08 g/mL の 3.0 mL 密度ソリューションにするため穏やかな逆転によって混ぜます。
   2. きれいな試験管に追加 1.13 g/mL の 1.482 mL 1.5 M NaCl 溶液 0.3 mL を元 Percoll。DH₂O の mL の 1.218、1.07 g/mL の 3.0 mL 密度ソリューションにするため穏やかな逆転によって混ぜます。
2. きれいな試験管に 2.0 mL の PBS と精液サンプル 1:2 の 1.0 mL を希釈します。ピペットで穏やかに混合します。
3. 滅菌 15 mL の円錐管に 1.07 g/mL 密度液 3.0 mL をピペットで移しなさい。慎重にピペット 1.07 g/mL の濃度溶液下 1.08 グラム/mL の密度液 3.0 mL。2 つの層が混合しないことを確認します。長い形式 (9 インチ) パスツール ピペットやすくできますこの手順。
4. ピペット 3.0 mL 希釈精液サンプルの頭上に、PDG。精液サンプルは、PDG と混ざらないように傾斜 45 ° の角度で PDG を含む円錐管が優しく。ピペットで移しなさい、管の壁に沿ってサンプルとダウン チューブや、PDG をフローことができます。
5. オーバーレイされるサンプルで PDG の質量に合わせて空チューブを準備します。1500 x g で両方のチューブを遠心分離機、20 分がバランスし、遠心分離機管のベンチから転送中不連続勾配を維持するために注意してください。
   注: は、遠心分離の終わりにブレーキを使用しないでください。
6. 結果を確認します。図 1に見られるようにチューブに 3 つの明瞭な精液層を形成していることを確認します。
7. ピペット層分離精液を吸い出しなさい。精液の最上位のレイヤーを最初に集め、中間層の第二に、最新の管の下部にハードのペレット。清潔で滅菌ポリプロピレンにそれぞれ転送遠心チューブ。
8. 各サンプルを PBS で 1.5 mL を希釈します。10 分間 1500 × g で遠心分離機します。
9. 上清を注ぐ。穏やかなピペッティングによる精子運動性バッファーにペレットを再構築します。
   注: 代替の密度は調査官のニーズに合わせて使えます。V₀がストック密度ソリューションのボリュームを次の式で使用される成分の量使用、v ソリューション、p の最終巻は望まれる最終密度解決の密度、p₀はストックの密度の密度決定します。解決方法:
   
   常に生理食塩液の NaCl 濃度に合わせて密度溶液の調製で 1.5 M の NaCl の 0.3 mL を使用します。

3. 精子の質を決定します。

1. 精子濃度は²²を前述を計算します。
2. エオシン nigrosin 重要な上記¹²以下の変更として染色を実行します。
   1. 1 x 10 の⁸セル/mL の濃度で精子溶液 100 μ L を準備します。
   2. ピペット 50 μ L nigrosin エオシン染色の等量を含むポリプロピレン微量遠心チューブに精子ソリューションの。室温で 5 分間混合物を孵化させなさい。
   3. 20 μ L スライド ガラスの一端に汚された精子サンプルのドロップして、血液の使用と同様の方法で均一に塗る場所を塗ります。3-5 分間室温でまみれてスライドを風乾します。
   4. 顕微鏡下で塗抹標本を観察します。ライブ精子 (汚れ無し) と (ピンク染色) 死者の精子の数をカウントし、ライブ精子の割合を算出します。
3. Accudenz 試金は、以前に鶏精子、精子移動⁸以下の変更を客観的に評価するための検証を実行します。
   1. ポリスチレン キュヴェット、図 2に示すように 6% アッセイ液 1.0 mL をピペットで移しなさい。41 ° c. に孵化させなさい
      メモ: 41 ° C は、鶏の内部の温度を一致するように使用されます。培養温度は、調査されている種の女性の生殖器官を一致させてください。
   2. 5 x 10 の⁸セル/mL の濃度で精液サンプルを 100 μ l 添加と予熱分析ソリューションをオーバーレイします。
   3. キュベット含まれている場所には、分光光度計で精子サンプルが重なって表示されます。550 で吸光度値記録 nm。
4. 前述¹¹以下の変更として IPVL 浸透分析を実行します。
   1. そのまま IPVL の非胚ディスク領域の一部 (0.5 × 0.5 cm) をカットします。
   2. 4 x 10⁶セル/ml 精子濃度を調整します。
   3. 図 3に示すようは、37 ° C で 15 分間の小さなガラスの瓶に IPVL と運動バッファーで精子を孵化させなさい。
   4. 3% の IPVL 部分を浸す塩化ナトリウム IPVL と精子の相互作用を停止します。
   5. 顕微鏡のスライドと次の 20 の 10% ホルマリンで固定 10 分シフの試薬で汚れ IPVL ピースをマウント s。
   6. 二穴責め成功した精子を顕微鏡下で IPVL を観察し、40 倍の倍率で 0.25 mm²あたりのすべての目に見える穴の数をカウントします。

結果

PDGC 技術は、すべてのパラメーターの間で品質の程度によって精子の 3 つの層をはっきりと分離で起因しました。精子は高密度ソリューションより高いと低密度ソリューションと上記の低密度ソリューション低品質層間媒体品質層高品質レイヤーに分離します。これらの品質に違いは生存率 (図 4)、移動 (図 5) および浸透 (<...

ディスカッション

不妊治療は、動物生産の収益性を決定するだけでなく、存在のための種の自然淘汰の手段としても機能します。精子細胞の究極の機能は、卵子を受精することです。女性の卵管は卵子^23,24の受精を保障するためにそれらの適者生存精子のみを選択します。生体外研究も質的な精子と受精成功^4,11,...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
Schiff’s reagent	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope	Olympus America Inc., PA, USA		No catalogue is found