Prélèvement du sperme de qualité différentielle en utilisant la Centrifugation en Gradient de densité

Résumé

Dans cet article, nous visons à décrire les performances de la technique de centrifugation en gradient de densité et de son application dans la recherche de la physiologie de sperme.

Résumé

Dans la reproduction sexuée, un gamète mâle ou spermatozoïde fusionne avec un gamète femelle pour parvenir à la fécondation. Toutefois, un grand nombre de spermatozoïdes avec capacité de fertilisation est requises pour interagir avec un gamète femelle pour assurer la fécondation. Par conséquent, la capacité fécondante des spermatozoïdes individuels est critique pour la reproduction réussie. Centrifugation en gradient de densité a été utilisée pendant plusieurs décennies comme une méthode reproductible, rapide, efficace et extrêmement adaptable pour recueillir seulement qualité sperme devant servir à la reproduction assistée. Les protocoles que nous décrit ci-après portent sur l’utilisation de la technique de centrifugation en gradient (PDGC) densité de Percoll discontinue pour isoler les trois populations distinctes de sperme du coq par leur qualité. Nous avons pu recueillir, faible, moyen et haute qualité sperme. Nous décrivons également les protocoles reproductibles qui entraînent déterminant potentiel de fertilité du sperme en évaluant leur viabilité, la mobilité et la pénétrabilité. Collection de spermatozoïdes par leur qualité à l’aide de la technique de PDGC serait utile à avec précision et caractériser complètement sperme avec différentielle fertilité potentielle.

Introduction

Chez les vertébrés, les gamètes mâles subissent une intense pression sélective ; reproduction remise en forme d’un mâle est donc essentiel pour la réalisation de fécondation réussie. Les hommes de toute espèce de vertébrés donnée doivent être en mesure de produire des spermatozoïdes en grande quantité et de qualité suffisante pour répondre aux besoins de fertilisation. Cellules du sperme, avoir une tête de sperme et d’un flagelle, sont des cellules plus polarisées dans le corps. Ils sont également très hétérogènes dans la qualité du sperme (vivant et mort, morphologiquement normal et anormal et immobile, low haut et mobile mobile), qui se révèle à travers la grande variation dans efficacité reproductive des mâles. Plus la proportion de spermatozoïdes de qualité, au moins le nombre d’accouplements pour avec succès de féconder l’ovule. Toutefois, pour atteindre la fertilité, des spermatozoïdes morphologiquement normaux comptent sur propulsion forces générées par leurs flagelles pour accéder au site de fertilisation ainsi quant à pénétrer la zone pellucide¹ (ZP ; dans le cas des mammifères) ou intérieure périvitellin couche² (IPVL ; dans le cas des oiseaux et reptiles) de l’ovule après l’accouplement naturel ou l’insémination artificielle (IA). Détermination de sperme qualité est nécessaire pour une utilisation dans les techniques de procréation assistée³ (ART) et des programmes de sélection des mâles reproducteurs pour être utilisé en intelligence artificielle⁴. En revanche, le succès de l’ART se fonde uniquement sur l’évaluation précise de la qualité du sperme. Un certain nombre de tests de laboratoire ont été développé afin de déterminer les caractéristiques fonctionnelles du sperme. Les paramètres les plus importants sont la morphologie des spermatozoïdes, de viabilité, de mobilité, de capacitation (sperme aviaire ne nécessite pas de capacitation des⁵), réaction de l’acrosome (AR ; l’exocytose et libération d’une enzyme protéolytique de l’acrosome, de la tête du spermatozoïde), Sodo, sperm pénétration de la ZP ou IPVL et fertilisation^{6,7,8,9,10,11}. Mesures de fertilité seule ne fournissent pas une évaluation précise de la capacité fécondante d’un sperme population¹¹. Les mesures des plusieurs événements menant à la fécondation d’un ovule permettre une représentation appropriée de la performance des spermatocytes individuel⁷.

La méthodologie développée pour mesurer la fonction spermatique est essentiellement propres à chaque espèce. Par exemple, dans le sperme aviaire, viabilité, la mobilité et la pénétration de IPVL sont les paramètres couramment utilisés pour évaluer la qualité de sperme pour^8,11,12. Le nombre de spermatozoïdes vivants dans le sperme joue un rôle crucial pour la survie des spermatozoïdes, car la présence d’un grand nombre de spermatozoïdes morts dans le sperme affecte la qualité du sperme. Cela augmente la production d’espèces réactives de l’oxygène dans le sperme et provoque des dommages oxydatifs aux spermatozoïdes vivants¹³. Mobilité des spermatozoïdes, la capacité de mouvement flagellaire du sperme aviaire contre la résistance à la température corporelle, est connue pour jouer un rôle direct dans fertilisation⁸. Il est bien établi que la mobilité est en corrélation positive avec la fertilité et est donc déterminant de fertilité⁸. Toutefois, un spermatozoïde mobile doit avoir aussi la capacité de subir un AR et de pénétrer l' IPVL¹¹. Essais de pénétration IPVL prennent en compte pour chaque spermatozoïde qui participe dans le processus de fécondation¹¹.

Dans l’application de l’ART, l’éjaculat est généralement traitée afin de maximiser la concentration du sperme de qualité et de réduire la concentration de spermatozoïdes de mauvaise qualité. Après le prélèvement du sperme, la proportion de spermatozoïdes de qualité peut être enrichie par des procédures de séparation de sperme couramment utilisés dans les pratiques de l’industrie et la recherche. Beaucoup de ces procédures ont été développées, avec des avantages respectifs et les limites, mais tous utilisent la nature hétérogène du sperme pour recueillir uniquement le sperme avec haute capacité fécondante. Ces procédures incluent des méthodes de migration des spermatozoïdes, filtration de colonne de l’adhérence et densité centrifugation en gradient (DGC)^{14,15,16,17,18,19 , 20}. parmi les techniques disponibles, DGC s’est avéré pour être très simple, reproductible, rentable et efficace pour isoler le montant maximal du sperme de haute qualité pour une utilisation dans l’ART dans le but de maximiser les chances de fécondation^{14 , 15}. en outre, la DGC n’est pas préjudiciable à la membrane de la cellule de sperme. En revanche, recueillent des méthodes de migration de sperme sperme seulement progressivement mobile^18,19, mais la quantité de sperme recueilli est très faible, rendant inefficace dans la collecte de grandes quantités de sperme^{18, 20}. adhérence colonne filtration est très efficace pour le filtrage très mobiles spermatozoïdes du sperme¹⁷; Toutefois, elle tend à nuire aux spermatozoïdes membranes^20,21.

Dans la technique de la Guilde canadienne des réalisateurs, le substrat le plus couramment utilisé pour générer le gradient de densité est Percoll, qui est composé de particules de silice colloïdale recouvert de polyvinylpryrolidone. Centrifugation en gradient de densité Percoll (PDGC) peut être continu ou discontinu, mais un gradient discontinu est plus couramment utilisé pour l’isolement de rendement élevé de spermatozoïdes mobiles^13,16,20. Dans un gradient discontinu, média de densité inférieure plane au-dessus de média de densité supérieure, créant un gradient qui augmente la densité du haut vers le bas d’un tube conique. Cela crée des limites à l’interface entre les deux milieux de densité différente. L’efficacité de PDGC est dérivée de deux facteurs : 1) la capacité propulsive de spermatozoïdes individuels et 2) la tendance des spermatozoïdes avec haute intégrité structurale a une densité accrue. Sperme avec une plus grande mobilité est mieux capables de traverser des médias de densité plus faible et de pénétrer dans un média de densité plus élevé. Sperme de mobilité plus faible est plus susceptibles d’être coincé à la limite créée par l’interface entre les médias de densité différente. Spermatozoïdes à haute intégrité structurale et de la mobilité ont tendance à avoir une densité plus élevée que les spermatozoïdes mobiles morts, anormales ou faibles. Lorsque la force centrifuge est appliquée en PDGC, cela facilite le déplacement des spermatozoïdes avec des densités différentes à leur place respective dans le gradient.

En médecine générale, après PDGC, le pellet mou de sperme avec une fécondité élevée potentielle au fond du tube conique est recueillie, et le reste est ignoré. Cependant, un avantage sous-utilisées de cette technique est sa capacité à séparer les cellules spermatiques en plusieurs groupes fondés sur les différences de qualité. À des fins de recherche, séparation des spermatozoïdes par degré de qualité utilisant la technique PDGC permet d’étudier de la qualité du sperme en ce qui concerne les différences physiologiques, de métabolomique et protéomique. Ici, nous visons à détailler comment cette technique peut être utilisée pour séparer les spermatozoïdes de qualité, mais aussi de montrer ces différences de qualité, à l’aide de l’éosine-nigrosine préétablie coloration vitale pour la viabilité, Accudenz dosage pour la mobilité et sperme-IPVL analyse d’interaction pour la pénétration.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Georgie.

1. laver à l’aide de Centrifugation traditionnel

1. Préparer la solution de tampon phosphate (PBS). Ajouter 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ et 0,24 g de KH₂PO₄ à 800 mL d’eau distillée (dH₂O). Ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 N HCl et porter la solution à 1 L avec dH₂O.
2. Préparer le tampon de la motilité. Ajouter 6,5 g de NaCl, 4,5 g de glucose, 0,444 g de CaCl₂ et 11,5 g de N - tris-[hydroxyméthyl] acide méthyl-2-amino-ethanesulfonic (TES) à 800 mL de dH₂O. ajuster le pH à 7.4 à l’aide de 1 NaOH M et porter la solution à 1 L avec dH₂O.
3. Pipetter 0,5 mL de sperme dans un tube en polypropylène microcentrifugeuse. Ajouter 1,0 mL de PBS et mélanger doucement.
4. Centrifuger à 1 500 g pendant 10 min à température ambiante (RT) et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot de sperme avec du PBS à 1,5 mL.
5. Centrifuger à 1 500 x g pendant 10 min à RT. remettre en suspension le sperme à pellets avec motilité jusqu'à 0,5 mL de tampon.

2. effectuer la technique PDGC

Remarque : Effectuez toutes les étapes du PDGC à la température ambiante.

1. Faites 3,0 mL de solutions Percoll 1,08 g/mL et 1,07 g/mL à deux tubes séparés.
   1. Dans un tube à essai propre, ajoutez 1,712 mL du 1,13 g/mL original Percoll à 0,3 mL de solution de NaCl à 1,5 M. Ajouter 0,988 mL de dH₂O et mélanger par retournement doux à porter 3,0 mL d’un 1,08 g/mL solution de densité.
   2. Dans un tube à essai propre, ajoutez 1,482 mL du 1,13 g/mL original Percoll à 0,3 mL de solution de NaCl à 1,5 M. Ajouter 1,218 mL de dH₂O et mélanger par retournement doux à porter 3,0 mL d’un 1,07 g/mL solution de densité.
2. Dans un tube à essai propre, diluer 1,0 mL de l’échantillon de sperme 1:2 avec 2,0 mL de PBS. Mélanger doucement de pipetage.
3. Pipeter 3,0 mL de la solution de densité 1,07 g/mL dans un tube conique stérile de 15 mL. Soigneusement Pipeter 3,0 mL de la solution de densité de 1,08 g/mL sous la solution de densité 1,07 g/mL. Veiller à ce que les deux couches ne se mélangent pas. Une longue durée (9 pouces) pipette Pasteur peut simplifier cette étape.
4. Pipeter 3,0 mL de l’échantillon de sperme dilué par dessus le PDG. Pour s’assurer que l’échantillon de sperme ne se mélange pas avec le PDG, basculer doucement le tube conique contenant le PDG à un angle de 45°. Pipette de l’échantillon le long de la paroi du tube et laisser s’écouler dans le tube et le PDG.
5. Préparer un tube vide pour correspondre à la masse de la PDG avec échantillon superposée. Centrifuger les deux tubes à 1500 x g pour 20 min. attention à maintenir le gradient discontinu tout en transférant les tubes à l’audience à l’équilibre, puis à la centrifugeuse.
   Remarque : N’utilisez pas le frein à la fin de la centrifugation.
6. Observez les résultats. Veiller à ce que les trois couches distinctes de sperme ont formé dans le tube, comme on le voit à la Figure 1.
7. Aspirer les couches isolées de sperme avec une pipette. Recueillir la couche supérieure de sperme tout d’abord, le milieu couche deuxième et dernière le culot dur au fond du tube. Transférer chacun d’un polypropylène propre et stériletubes de microcentrifuge.
8. Diluer chaque échantillon à 1,5 mL avec du PBS. Centrifuger à 1500 x g pendant 10 min.
9. Décanter le liquide surnageant. Reconstituer pellet de sperme avec le tampon de la motilité de pipetage doux.
   Remarque : Autres densités peuvent servir aux besoins du chercheur. Déterminer les quantités d’ingrédients utilisés par l’équation suivante, où v₀ est volume de solution de densité du stock utilisés, v est un volume final de la solution souhaitée, p est la densité de la solution finale de la densité souhaitée et p₀ est la masse volumique de la densité du stock solution :
   
   Toujours utiliser 0,3 mL de 1,5 M de NaCl dans la préparation des solutions de densité en fonction de la concentration de NaCl de sérum physiologique.

3. détermination de la qualité du sperme

1. Calculer la concentration de sperme comme décrit plus haut²².
2. Effectuez l’éosine-nigrosine vital coloration comme décrit précédemment¹² avec les modifications suivantes :
   1. Préparer 100 µL de solution de sperme à une concentration de 1 x 10⁸ cellules/mL.
   2. Pipetter 50 µL de solution de sperme dans un tube en polypropylène microcentrifugeuse contenant un volume égal d’éosine nigrosine tache. Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante.
   3. Place un 20 µL goutte de l’échantillon de sperme teinté à une extrémité d’une lame de verre et Enduire uniformément d’une manière similaire à celle utilisée pour le sang frottis. Sécher les diapositives barbouillés à température ambiante pendant 3 à 5 min.
   4. Observer le frottis au microscope. Compter le nombre de spermatozoïdes vivants (sans tache) et de spermatozoïdes morts (colorés en rose) et calculer le pourcentage de spermatozoïdes vivants.
3. Effectuez le test de Accudenz, comme déjà validé pour le sperme de poulet, d’évaluer objectivement la mobilité de spermatozoïdes⁸ avec les modifications suivantes :
   1. Pipette 1,0 mL de solution de test de 6 % dans des cuvettes de polystyrène, comme illustré à la Figure 2. Incuber à 41 ° C.
      NOTE : 41 ° C est utilisée pour correspondre à la température interne d’une poule. La température d’incubation doit correspondre à celui de l’appareil reproducteur femelle de l’espèce étudiée.
   2. La solution de dosage préchauffé avec 100 µL de l’échantillon de sperme à une concentration de 5 x 10⁸ cellules/mL de superposition.
   3. Place la cuvette contenant superposées échantillon de sperme dans le spectrophotomètre. Enregistrer la valeur d’absorbance à 550 nm.
4. Effectuez dosage IPVL-pénétration comme décrit précédemment¹¹ avec les modifications suivantes :
   1. Couper un morceau (0,5 x 0,5 cm) de région de disque non germinales de IPVL intact.
   2. Ajuster la concentration du sperme à 4 x 10⁶ cellules/mL
   3. Incuber le sperme dans un tampon de motilité avec IPVL dans un flacon en verre petit pendant 15 min à 37 ° C, comme illustré à la Figure 3.
   4. Immerger la pièce IPVL dans 3 % NaCl pour arrêter l’interaction entre l’IPVL et du sperme.
   5. Monter la pièce IPVL sur une lame de microscope et la tache avec du réactif de Schiff pendant 10 min après fixation par le formol 10 % pendant 20 s.
   6. Observer l’IPVL sous un microscope pour les spermatozoïdes réussi trous de pénétration et de compter le nombre de tous les trous visibles / 0,25 mm² à un grossissement de 40 X.

Résultats

La technique PDGC a été nette séparation de trois couches de sperme par degré de qualité à travers tous les paramètres. Spermatozoïdes se sépare en une couche de qualité inférieure à la solution de densité plus élevée, une couche de qualité moyenne entre le supérieur et solution de densité plus faible et une couche de faible qualité au-dessus de la solution de densité plus faible. Ces différences de qualité sont mis en évidence de différences évidentes dans la via...

Discussion

Fécondité non seulement détermine la rentabilité de la production animale, mais agit également comme un moyen de sélection naturelle des espèces pour l’existence. La fonction ultime d’un spermatozoïde doit féconder un ovule. L’oviducte de la femelle choisit seulement ces spermatozoïdes plus forts afin d’assurer la fécondation de l’ovule^23,24. Des études in vitro ont révélé également une étroite corrélation entre les caractéri...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accudenz	Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA	AN7050
Percoll	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	P7828
Schiff’s reagent	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	3952016
TES	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	T1375
Eosin Y	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	E4009
Nigrosin	Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA	198285
ST 40R Centrifuge	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope	Olympus America Inc., PA, USA		No catalogue is found